胚胎干细胞体外培养
人胚胎生殖干细胞的体外培养研究
１ ６ ０１ １ ０ ，Ｃｈｎ ． ｉａ
【 ｂｔ ｃ】 Ｔｉｅ ｅｍ ｎａｅ ｔ ｎｒｉｄａａ ｓ ｅ ｏ ｅ ｃ ｙｔ ｄｒ Ｇｃｌｒｓ ｃｎｉ ｎ ｕｅ ｔ ｇ ｉ ｔｎｂ ｃ ｉ Ａ ｓ ａｔ ｈ ｐｒ ｅｔ ｆｒｈ ｇ ｅ ｌｅ ｌ ｉｔ ｍ ｓ ｓｎｅ Ｅ ｅ ｉ ｄｉ ， ｓ ｅ ｒ ｎ ａｏ ｌ ｋ ａｅ ｒ ｓ ｘ ｉ ｔ ｅ ｅ ａｚ ｎ ｙｓｈ ｄ ｔ ｂ ａ ｉ ｌａ ｅ ｏ ｔ ｏ ｓｈ ｏ ａ ｚ ｉ ｏ ｒｓ
格床和 实验 医学毒志 ２０ ０９耳 ３月 弟８卷 弟 ３ 期
・９ ・
Hale Waihona Puke 人胚 胎 生殖 干细 胞 的体 外 培 养 研 究
陈明玉（ 大连铁路卫生学校 辽宁 大连 １６０ ） １０ １
【 要】 本 实验在综合分析 目 国内外人胚胎 生殖细胞 （ Ｇ细胞 ） 摘 前 Ｅ 的培养条件后 ， 采用组织块培养法 ， 同源胚胎 以
ｗｉ ｈｅｍｏ ｓ ｏｍａ ｅｔｅｒｉｉｇｌｖ ｌ ｕ ｏｒｉｅ ｅｈ ｔｒｇ ｎ ｏ ｓｐｏｅｎｐ ｌｕｉｎ ｗｈｃ ｈ ｙｔｍ ｒａｅ ．Ｔ ｉ ｉ ｂ ｕ ｓ ｂｉｈ ｓｔｅ ｈ ｔ ｔ ｕｅ ｔ ｋ ａｓｎ ｅ ，ｂ ｔｔ ａｓｄｔ ｅｅｏｅ ｅ ｕ ｒｔｉ ｏｌｔｏ ｉｈｔ ｅｓｓｅ ｃｅ ｔｄ ｈ ｓ ｓａ ｏ ｔｅｔ ｌ ｅ ｈ ｅ ｈ ａ ｓ ｈ
ｔｅ ｎｉ ｉｏｒｉｅｔ ｈ ｕ ｎ Ｅ ｃ ｌ．Ｔ ｅｃ ｌ ｒｄ ｓｓｅ ｇ ａａ ｔｅ ｅｈ ｍａ ｉｓｏ ｎｖｔ ａｓ ｏｔｅｈ ｍａ Ｇ ｅ１ ｈ ｕｔ ｅ ｙ ｔｍ ｕ ｒ ｅ ｄ ｔ ｕ ｎ ＥＧ ｅｌｈ ｄｔｅ ｓｆｉｉｎ ｒｇｎ ｉ ｈ ａｓ ｒｃ ｓ ，ｈ ｓ ｒ ｕ ｎ ｈ ｃｌ ａ ｕ ｃｅ ｔｏｉｉ ｎ ｔｅｒ ｅｐｏ ｅ ｓ ａ ｈ ｉ
体外培养人胚胎干细胞饲养层的研究进展
ｇｏ ｈｆｃｏ ，ＧＦ 等 ， 到既 促 进 增殖 又抑 制 分 化 ｒｗｔ ａｔｒ Ｓ ） 起 的双重 作用 。
饲 养 层 细 胞 的 来 源 与 筛 选
验 证实 维持 Ｅ Ｃ的效 果可 靠 ， 仍有 自身弊 端［ ： １ Ｓ 但 ３ （） ］ 小 鼠来 源 的饲 养 层 细胞 可 能 给培 养 体 系 带 来 异 种 蛋 白和遗 传物 质 ， 引起 不 良反 应 ； ２ 小 鼠源 性 饲养 层 可 （） 能会 引入小 鼠携 带的病 原微 生 物 ， 造成 污 染 ； ３ 通 常 （）
需 定期 制备 ， 大 了 Ｅ Ｃ培 养 的工 作量 和经 济 负担 ； 加 Ｓ 且 随着 传代 的增 加 ， 生 长 活性 和分 泌 Ｌ Ｆ Ｆ 其 Ｉ 、 ＧＦ等
因子 的能力 将逐 渐下 降 ； 同时 饲养 层 细胞 种类 发 生 变
制备 的条件培 养基 ；３ 以人 胚胎 成 纤 维细 胞 、 人输 （） 成
化 ， 利于 深入分 析其 成分 ；４ 成纤 维 细胞 耐硫 代 鸟 不 （） 嘌 呤和耐 乌本苷 亚 系由于 长期 体 外 培养 ， 色 体 已发 染
生 畸 变 ， 能有效 地 抑 制 Ｅ Ｃ 的分 化 和 维 持 Ｅ Ｃ 的 不 Ｓ Ｓ
二倍 体核型 。
来源于 人或 鼠的饲 养 层 制 备 并 添 加 细胞 外 基 质 以保 持 人 Ｅ Ｃ 的所有特 性 ， ２种培养体 系避 免 了人 Ｅ Ｃ Ｓ 这 Ｓ 与饲养 层直接 接触 ， 但仍 有不 足 ：１ 培 养体 系 仍 存在 （）
卵管上 皮细胞 、 包皮 成纤 维 细胞 、 宫 内膜 基 质 细胞 、 子 小 鼠成 纤维 细 胞 等 为 来 源 的 饲 养层 。前 ２种 体 系 又称无 饲养 层 培 养 体 系 。无 血 清无 饲 养 层 培 养 体 系 需添加 各种细 胞因子 和血 清 替代 品 ， 件培 养 基需 要 条
胚胎干细胞体外诱导分化的研究进展
04
胚胎干细胞体外诱导分化的应用前景
疾病治疗与药物筛选
疾病治疗
胚胎干细胞具有多向分化潜能，可分化为特定类型的细胞，如神经细胞、心肌细 胞等，为疾病治疗提供了新的途径。例如，通过诱导胚胎干细胞分化为神经细胞 ，可以用于治疗帕金森病、阿尔茨海默病等神经系统疾病。
药物筛选
胚胎干细胞可在体外培养扩增，为药物筛选提供了大量的实验样本。通过比较胚 胎干细胞在药物处理前后的分化过程和表型变化，可以评估药物的疗效和副作用 ，为新药研发提供有力支持。
表观遗传修饰
表观遗传修饰可以影响胚 胎干细胞的分化，如DNA 甲基化、组蛋白乙酰化等 。
03
胚胎干细胞体外诱导分化方法
化学诱导分化方法
化学诱导分化是利用化学物质 调节胚胎干细胞的分化过程。
常用的化学物质包括细胞因子 、激素、小分子化合物等。
这些化学物质通过调节胚胎干 细胞的基因表达、信号转导等 途径，诱导细胞定向分化。
组织工程与器官移植
组织工程
胚胎干细胞具有发育成各种组织的潜力，为组织工程提供了理想的基础材料。例如，可以诱导胚胎干细胞分化 为软骨、肌肉、血管等组织，用于修复或替换受损的组织器官。
器官移植
胚胎干细胞可分化为多种器官细胞，为器官移植提供了新的来源。与传统的器官移植相比，胚胎干细胞诱导分 化的器官具有更好的组织匹配性和更少的不良反应，有望成为解决器官短缺和提高移植效果的重要途径。
研究方法
采用体外培养胚胎干细胞的方法，通过添加不同的诱导因子 或采用特殊的培养条件，观察细胞的分化过程和分化产物的 特性，同时结合分子生物学、细胞生物学等技术手段分析相 关机制。
02
胚胎干细胞特性与分化机制
胚胎干细胞特性
胚胎干细胞在再生医学中的应用及其局限性
胚胎干细胞在再生医学中的应用及其局限性随着科技的发展，再生医学成为了一个备受关注的领域，其中胚胎干细胞作为再生医学的“明星”，备受关注。
但是，对于跨越正常生理的应用还存在伦理道德问题，以及一些局限性。
本文将探讨胚胎干细胞在再生医学中的应用及其局限性。
一、胚胎干细胞的定义与特点胚胎干细胞指来源于早期胚胎的一类具有自我复制和分化潜能的干细胞，可以区分为内胚层干细胞和外胚层干细胞。
胚胎干细胞具有以下特点：①自我更新②可分化成不同细胞类型③可以体外繁殖因此，胚胎干细胞可用于再生医学和基础研究。
二、胚胎干细胞在再生医学中的应用1. 代替病变细胞胚胎干细胞可以通过体外培养形成各种组织和器官细胞，如心脏细胞、神经元细胞、肝细胞等。
因此，如果人体某个部位的细胞暴露于病变或正常衰老的威胁，那么胚胎干细胞可以用于替代这些病变的细胞，从而治疗许多疾病，如心脏病、糖尿病、帕金森病等。
2. 治疗疾病胚胎干细胞可以用于治疗许多不可治愈的疾病，如心脏病、糖尿病、癌症等。
利用胚胎干细胞治疗疾病的方法是，将干细胞注射到病人的体内，让其分化成需要的细胞类型从而修复破损组织。
三、胚胎干细胞的局限性1. 伦理、道德问题人类胚胎的获得是胚胎干细胞应用的基础。
因此，胚胎干细胞的研究与使用在伦理和道德方面引起了争议和质疑。
对于胚胎干细胞的使用可能侵犯被使用的这些胚胎的尊严和权利。
如果利用胚胎干细胞进行研究和应用，需要在相应的法律与伦理规范、社会共识以及利益平衡的基础上来进行。
2. 值得注意的潜在风险在应用胚胎干细胞过程中的潜在的风险包括，潜在的细胞突变风险、组织排异反应、T细胞和自身免疫细胞的反应等。
此外，由于胚胎干细胞具有无限制自我复制的能力，其对人体的潜在恶性肿瘤形成风险也需要被考虑到。
3. 模式性问题胚胎干细胞只可以形成特定的细胞类型，并不适合于所有的修复需求。
此外，由于体内的生产环境具有的多样性，使用胚胎干细胞时存在与体内环境之间的差距，这也会影响再生医学的实用性。
动物克隆 第三章胚胎干细胞分离培养
第三章胚胎干细胞分离培养1981年，Evens等首次发现小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)在体外具有稳定增殖并维持未分化状态及分化全能性潜能的特性，并成功建立小鼠ESCs系[1]。
由于ESCs独特的生物学特性，ESCs方面的研究迅速成为生命科学研究领域的热点之一，1999年－2000年连续两年被评为世界十大科技新闻。
ESCs已成为分子遗传学、发育生物学、细胞工程、组织工程等研究的重要工具，在研究细胞分化机制、临床治疗、转基因等方面有着重要的意义。
随着对干细胞研究的不断深入，人们将逐渐掌握和利用干细胞，还将推动相关学科的发展。
文章综述了ESCs的研究概况、体外分离培养、生物学特性、鉴定方法、影响ESCs分离培养的因素、存在问题以及应用前景等。
1 胚胎干细胞研究概况ESCs的研究最早要追溯到畸胎瘤细胞的发现，但真正意义上的开始却是1981年Evens等首先从延缓着床的胚泡分离培养到小鼠的ESCs，并建立小鼠的ESCs系，之后ESCs研究迅速发展，已在大鼠、仓鼠、猪、牛、水貂、兔、山羊、绵羊、恒河猴和人等多种哺乳动物上建立了类ESCs系[2]。
近几年来，ESCs研究在ESCs来源与培养方法、探索建立和维持ESCs系的条件、定向诱导分化、遗传操作、疾病动物模型的治疗等方面取得了一定的进展。
研究人员利用体细胞核移植技术进行胚胎重建，从克隆胚胎中成功得到小鼠、兔和人等多种哺乳动物ESCs[3-5]；利用孤雌激活技术建立小鼠和非人灵长类孤雌激活胚胎源的ESCs系[6]，这些为ESCs的分离克隆开辟了新的途径。
利用定向诱导分化技术成功将ESCs分化为造血细胞、内皮细胞、肝细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、胰岛细胞、心肌细胞、成骨细胞，甚至滋养层细胞和生殖细胞等所有3 个胚层的细胞类型[7-13]。
试验表明，人ESCs 能有效治疗心肌梗死、糖尿病、中风等疾病。
国内在ESCs方面的研究起步较晚，但发展迅速，在相关领域做了大量的研究。
小鼠胚胎干细胞体外诱导分化成GABA能神经元
小鼠胚胎干细胞体外诱导分化成GABA能神经元目的探讨小鼠胚胎干细胞在体外培养向GABA能神经元定向诱导分化的可能性。
方法将小鼠胚胎干细胞以“无血清”方法培养,用DMEM/F12、N2、B27及NT4作为诱导分化剂定向诱导分化,分化好的细胞利用免疫荧光技术、流式细胞技术和RT-PCR鉴定。
结果在胚胎干细胞诱导分化成神经元后期,免疫荧光显示有GABA能神经元存在;RT-PCR结果证实有GABA能神经元正确分化的重要调控基因Viaat、Gad1和Gad2基因表达;流式细胞仪计数结果显示GABA阳性细胞约占总细胞数的(11.49±6.86)%。
结论小鼠胚胎干细胞经体外培养可以定向诱导分化成GABA能神经元,可作为神经移植的新来源。
[Abstract] ObjectiveTo investigate the possibilities of in vitro culture and differentiation of mouse embryonic stem cell to GABAergic neurons. MethodsMouse embryonic stem cells were cultured and induced into GABAergic neurons in serum-free cultural condition. Immunofluorescence,reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) and flow cytometer assay were used to identify the properties of the differentiated cells. ResultsIn the later period of differentiation of embryonic stem cells into neurons,immunofluorescence showed that GABAergic neurons existed,RT-PCR results confirmed the important regulatory genes Viaat,Gad1 and Gad2 gene expression due to the correct differentiation of GABAergic neurons and flow cytometry analysis showed the GABA-positive cells accounted for about(11.49±6.86)% of the total cell number. ConclusionMouse embryonic stem cells can be induced into GABAergic neurons in vitro in serum-free cultural condition,providing a new source of nerve graft.[Key words]Embryonic stem cell; Induce; Differentiate; GABA干细胞移植治疗中枢神经系统疾病的研究方兴未艾,且取得了一定成果,但由于其多取材于胚脑的神经干细胞,为日后临床应用埋下了伦理道德问题之患,并且受到供体来源短缺的限制[1]。
利用培育技术进行胚胎干细胞培养的操作步骤
利用培育技术进行胚胎干细胞培养的操作步骤胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，简称ESCs）是一种具有无限分裂潜能的细胞，可以分化成人体中任何类型的细胞。
这使得胚胎干细胞培养成为研究和治疗许多疾病的潜在方法。
在利用培育技术进行胚胎干细胞培养的操作步骤中，有几个关键的步骤是必须仔细考虑和执行的。
首先，需要获取胚胎。
这个过程通常是通过体外受精(In Vitro Fertilization，简称IVF)完成的。
医生会收集女性的卵子和男性的精子，然后将它们结合在一起，在实验室环境中进行体外受精。
这一步骤要确保卵子和精子的质量，并控制好培养环境的温度和湿度。
接下来，受精后的卵子会不断分裂，形成胚胎。
为了获取胚胎干细胞，最常用的方法是在胚胎发育到八细胞阶段时，将其分离成单个细胞。
这个过程被称为细胞扩增(Cell Expansion)。
细胞扩增的关键是确保每个细胞的健康和稳定性。
细胞扩增过程中，常常需要添加培养基和生长因子，以促进细胞的分裂和生长。
当细胞扩增到一定数量时，就可以开始进行胚胎干细胞的分化。
分化过程通常涉及将胚胎干细胞移植到特定的培养基中，并加入适当的生长因子和细胞信号转导分子。
这些因子和分子可以模拟人体内特定发育时期的信号，从而促使胚胎干细胞向特定种类的细胞分化。
例如，通过添加一种叫作“Noggin” 的蛋白质，胚胎干细胞可以被诱导分化为神经细胞。
分化的结果取决于培养的时间和添加的生长因子，以及其他培育条件的调节。
通过对胚胎干细胞的培养和分化过程进行精确控制，研究人员可以获得一系列不同类型的细胞，包括心脏细胞、肝细胞、胰岛细胞等。
这些特定的细胞类型可以应用于研究、药物测试和再生医学等领域。
需要注意的是，胚胎干细胞培养涉及许多伦理和法律问题。
在进行胚胎干细胞研究和应用时，必须确保遵守伦理准则和法律规定，保护人类生命和尊严。
总结来说，利用培育技术进行胚胎干细胞培养涉及从胚胎获取细胞、进行细胞扩增和细胞分化的过程。
胚胎干细胞体外定向诱导分化的研究进展
胚胎干细胞体外定向诱导分化的研究进展（姓名：李翔单位：宁夏师范学院化学与化学工程学院11级科学教育班）摘要：胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团分离培养出来的具有发育全能性或多能性的干细胞,具有多向分化潜能和自我更新的特性。
胚胎干细胞可以定向诱导分化生产组织和细胞,可为细胞移植提供无免疫原性的材料,为难以治愈的疾病的细胞移植治疗提供可能。
本文介绍了胚胎干细胞的诱导分化方法和应用。
关键词：胚胎干细胞;定向诱导分化;分化潜能;自我更新胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES 细胞)是从早期胚胎( 桑椹胚、囊胚) 或原始生殖细胞(primordial germ cell, PGCS)分离出来的能在体外永久培养的、具有多方向分化潜能和种系嵌合能力的细胞系。
ES 细胞具有多向分化潜能, 可分化形成外胚层、中胚层和内胚层细胞的谱系干细胞, 再成长为不同的神经、造血、肌肉,骨骼等各种细胞基于其特性,目前普遍认为, ES细胞对体外研究动物和人胚胎的发生发育, 基因表达调控, 药物的筛选和致畸实验及作为组织细胞移植治疗, 克隆治疗和基因治疗的细胞源及产生克隆和转基因动物等领域将产生重要的影响。
1998 年,T homson和Gearhart2 个研究组分别从人ICM和PGCS建立了人类ES细胞系, 在国际上引起了轰动。
Science 杂志将人类ES 细胞研究成果评为1999 年世界十大科技进展之首, 美国《时代》周刊将其列为20世纪末世界十大科技成就之首, 并认为ES 细胞和人类基因组将同时成为新世纪最具发展和应用前景的领域, 由此掀起了ES细胞研究的高潮。
1体外诱导 ES 细胞的原理在体胚胎分化过程中，组织发生和身体构造的形成具有时空顺序性和相互诱导性。
在个体发育过程中，细胞分化是程序控制的有序有规律过程，程序的运行结果表现为不同发育阶段、不同组织部位的细胞表现出不同的形态、不同的生长方式和不同的生理功能。
干细胞提取和分离方法总结
干细胞提取和分离方法总结干细胞是一类具有自我更新和分化为多种细胞类型能力的细胞，因其在再生医学和疾病治疗方面的巨大潜力而备受关注。
干细胞的提取和分离是开展干细胞研究的关键步骤，本文将总结几种常用的干细胞提取和分离方法。
1. 胚胎干细胞提取和分离胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)具有广泛的分化潜能，可以分化为体内所有的细胞类型。
目前，主要有两种方法用于胚胎干细胞的提取和分离：体外受精和体细胞核移植。
- 体外受精方法：该方法从捐赠人体内获取受精卵，通过体外培养获得兔囊胚，并将兔囊胚的内质体提取出来，形成胚胎干细胞系。
这种方法可以大规模获取胚胎干细胞，但受到伦理等因素的限制。
- 体细胞核移植方法：该方法通过将一个成体细胞的细胞核移植到一个空卵子中，得到克隆胚胎。
然后从克隆胚胎中提取胚胎干细胞。
这种方法可以避免使用受精卵，但技术难度较大且效率较低。
2. 间充质干细胞提取和分离间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)存在于骨髓、脐带血、脂肪组织等多种组织中，具有自我更新和多向分化能力。
提取和分离间充质干细胞的方法主要有以下几种：- 骨髓采集法：该方法通过穿刺骨髓髓腔，用针收集骨髓组织，然后经过干细胞分离和纯化得到间充质干细胞。
这种方法具有高效、简便的优点，但操作有一定难度。
- 脐带血提取法：该方法通过脐带血采集脐带中的干细胞，经过干细胞分离和纯化得到间充质干细胞。
相较于骨髓采集法，脐带血提取法更为简单和无创，但提取的间充质干细胞数量和质量较低。
3. 诱导多能干细胞提取和分离诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)是通过使用转录因子或化学物质将成熟的体细胞重新编程为干细胞的一种方法。
主要有两种方法用于诱导多能干细胞的提取和分离：细胞外基质和转录因子。
- 细胞外基质法：该方法在细胞培养基内添加适当的细胞外基质，提供合适的生长环境，帮助细胞重新获得干细胞特性。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤以下是小鼠胚胎干细胞的培养实验步骤：1.准备培养基和细胞培养器材：-将培养基预热至37摄氏度。
-准备含有培养基的无菌试管、离心管和细胞培养板。
-洗手并戴上合适的培养操作手套。
2.预处理培养皿：-用无菌PBS（磷酸盐缓冲液）将细胞培养板彻底洗涤，去除残留的培养基和细胞残留物。
-用0.1%胰蛋白酶溶液或0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液将细胞培养板上的细胞进行脱落。
-将细胞均匀地分布在预处理的培养皿中，使其形成单层细胞。
3.检查细胞数目和品质：-用显微镜检查细胞的形态和活力。
-用细胞计数计算细胞的数目。
-计算细胞的分裂倍增时间。
4.细胞传代：-按照需要的细胞密度将细胞从一个培养皿转移到另一个培养皿。
-用0.05%胰蛋白酶-EDTA将细胞从培养皿上脱落。
-投入适当比例的培养基到新的培养皿中，使其形成单层细胞。
5.制备小鼠胚胎纤维母细胞：-从小鼠胚胎体内收集纤维母细胞。
- 将纤维母细胞转移到含有DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）和10%胎牛血清的细胞培养皿中。
-培养纤维母细胞在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中直至细胞接触起离皿表面。
6.制备和维持小鼠胚胎干细胞：-转接分裂期的小鼠胚胎干细胞到新的培养皿中。
-用无菌吸管或离心管的尖端轻轻挑取细胞克隆。
-将细胞克隆转移到含有mESC培养基（如DMEM、15%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺和1×LIF（小鼠白细胞介素-6）的细胞培养板中。
-在体外细胞培养中维持小鼠胚胎干细胞的自我更新和增殖。
7.细胞培养的常规维护：-定期更换新鲜的培养基。
-检查细胞的形态和活力。
-定期传代细胞，以保持其细胞数目和活力。
-控制培养基和细胞的污染。
以上是小鼠胚胎干细胞培养的一般步骤，实验过程可能因研究目的和实验室的要求而有所不同。
为了保证实验的准确性和可重复性，建议在实验过程中随时记录和保留实验数据，并使用正确的实验操作和生物安全规范。
小鼠胚胎干细胞培养实验具体步骤及方法
小鼠胚胎干细胞培养实验具体步骤及方法胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。
我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。
细胞全程培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。
一般体外诱导向神经细胞方向分化，也可以采用低浓度的RA进行诱导。
具体步骤一、ES培养基在LIF存在的条件下维持细胞培养。
二、EB培养基使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。
1. 分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分）。
2. 纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50 ml Falcon管中，计数细胞取适量体积放入15 ml管中离心3分钟。
3. 用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液4. 一个15 cm的细菌培养皿接种4～5x106个细胞（1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。
5. 2天后更换培养基，将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。
弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。
6. 用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）。
1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。
7. 形成胚状体需要4天时间。
在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。
这一天被认为是第2步和第3步的分界。
三、ITSFn培养基在最少量培养基中选择神经前体细胞1. 胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基。
2. 并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
3. 保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基--大约每隔一天。
4. 观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。
当神经样细胞能够被鉴别时，转入到第4步。
胚胎干细胞体外培养及在眼科的研究进展
２ １ ２ 人源性 细胞 饲养 层 为 了避 免使 用 小 鼠成纤 ．． 维 细胞带来 的各种 缺 陷 ， 年 来研 究 人 员利 用多 种 人 近 源性 细胞作 为饲养 层细胞 来 支持 Ｅ Ｃ培 养体 系 ， 骨 ｓ 如 髓 基质细胞 、 睾丸 支持 细胞 、 体 输 卵管 上皮 细 胞 、 成 成 体包皮 细胞 、 宫 内膜基 质细胞 等 。 子 Ａ ｉ等 利 用 胎 牛 血 清 ， 清 替 代 物 （ ｅ ｍｔ 血 ｓｍｍ ｒｐａｅ ｅｔｓ ） ｅｌｃｍ ｎ ，Ｒ 和人 血清 分 别建 立 了人 包 皮细 胞 系 ， 维持到 ４ ２代 以 上 ， 用 其 作 为 饲 养 层 ， 加 Ｓ 将 并 添 Ｒ， ｈｓ Ｅ ｃ成功传 至 ５ ７代 。随后 ， ｏ ａ ａ Ｈ ｖｔ 等 用人包 皮成 ｔ
ｇｒ ｅ Ｐ ｃ） ｅｍ ｃｕ，Ｇ 的一 种 多 潜 能 细 胞 ， 有 体 外 无 限 增 具
生 和 高度 自我更 新 的 能 力 两个 显 著 特 征 。在 一 定 条
件 下 ， 分 化 成 ３个 胚 层 来 源 的 各 种 细 胞 。 因 此 ， 能
Ｅ ｃ在 动物 和 人 的 胚 胎 发 育 、 畸 实 验 、 织 工程 和 Ｓ 致 组 移植 治疗 等研 究 领 域 具 有 重 要 的科 学 意 义 和 巨 大 的
应 用前 景 。
养 于 ｓ ０ 饲 养 层 上 ， 次 建 立 了 小 鼠 的 Ｅ ｃ 系。 Ｔ 首 ｓ Ｔ ｏ ｓｎ等 在体 外 受精 （ｎｖｔ ｅ ｉｚｔ ｎ Ｉ Ｆ 实 ｈｍ ０ ｉ—ｉ０ｆ ｔｉ ｉ ，Ｖ ） ｒ ｒＩａ ０ 验中 ， 用来 自于不 孕症 夫妇 提 供 的胚 胎 进行 Ｉ Ｍ 的提 Ｃ
胎 发 育 、 畸 实 验 、 织 工 程 和 移 植 治疗 等研 究 领 域 具 有 重 要 的科 学 意 义 和 巨 大 的 应 用 前 景 。 对 胚 胎 干 细 胞 的 发 展 、 致 组 体
基因编辑小鼠模型构建方法
基因编辑小鼠模型构建方法基因编辑小鼠模型是一种通过基因编辑技术改变小鼠基因组的方法，以研究基因在生物体发育、生理和疾病过程中的功能和机制。
下面是关于基因编辑小鼠模型构建方法的十条详细描述：1. 胚胎干细胞（ES细胞）导入方法：将经过基因编辑的ES细胞注射到小鼠早期胚胎中，使其发育成含有编辑基因的小鼠体。
2. 胚胎干细胞（ES细胞）体外培养方法：将小鼠胚胎中的干细胞分离出来，进行基因编辑后体外培养并转移到小鼠胚胎中，培育出基因编辑小鼠。
3. 基因敲除方法：使用CRISPR/Cas9等基因编辑工具，设计合适的寡核苷酸序列并导入小鼠胚胎，通过切割和删除目标基因，实现基因敲除。
4. 基因突变方法：通过CRISPR/Cas9等基因编辑工具，直接在小鼠基因中引入点突变或插入突变，使其产生突变株。
5. 转基因方法：将外源基因导入小鼠胚胎细胞，并使其嵌入细胞基因组，从而使小鼠表达外源基因。
6. 基因表达调控方法：通过CRISPR/Cas9等基因编辑工具，设计合适的寡核苷酸序列并导入小鼠胚胎细胞，以实现对基因的过表达或下调。
7. 基因标记方法：使用CRISPR/Cas9等基因编辑工具，在小鼠基因中插入标记基因，如荧光蛋白，以便对基因表达进行可视化和追踪。
8. 基因互补方法：通过CRISPR/Cas9等基因编辑工具，将外源基因导入小鼠胚胎细胞，使其与已有基因相互补充或修复，从而恢复基因功能。
9. 基因组工程方法：通过CRISPR/Cas9等基因编辑工具，在小鼠基因组中引入大片段DNA，如全基因组范围的基因敲除、替换或插入。
10. 利用转基因碰撞方法：将两个具有特定基因敲除或表达的小鼠品系交配，使它们的后代同时具有两个基因的敲除或表达，从而模拟一种基因缺失或改变的状态。
这些方法都是对基因编辑小鼠模型构建过程中常用的技术手段，能够有效地改变小鼠基因组，从而研究基因功能和机制。
但是在实际应用过程中需要注意合理选择方法，并根据具体的研究目的进行优化和改进。
胚胎干细胞在器官再生中的应用
胚胎干细胞在器官再生中的应用胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，简称ESCs）是一种来源于早期胚胎的多潜能干细胞，具有无限分裂能力和多能分化能力。
这些特点使得胚胎干细胞在器官再生和组织工程等生物医学领域具有非常广阔的应用前景。
下面将详细介绍胚胎干细胞在器官再生中的应用。
胚胎干细胞的来源主要有两种，一种是通过封闭过程获得的人类胚胎，另一种是通过体外受精过程中主动终止的胚胎。
获得胚胎干细胞需要借助生殖医学技术，如体外受精和胚胎移植等。
这些胚胎干细胞在体外培养的过程中，可以通过特定条件的培养基维持其干细胞状态，也可以通过调整培养基的成分和信号分子来促使其向特定细胞类型分化。
器官再生是指利用胚胎干细胞重新构建、修复或替代功能受损的器官组织。
胚胎干细胞在器官再生中的应用主要包括以下几个方面：1. 心脏再生：心脏疾病是当前世界上主要的致死疾病之一，而胚胎干细胞可以通过不同的分化方法培育心肌细胞，从而实现心脏细胞的再生和修复。
实验结果显示，将人类胚胎干细胞种植到小鼠心肌缺血区域，可以形成新生血管和心肌细胞，从而增加心肌功能。
此外，胚胎干细胞也可以用于心脏瓣膜再生，如修复受损的二尖瓣和主动脉瓣等。
2. 肝脏再生：肝脏是人体最大的内脏器官，负责许多重要的生物功能，如代谢、解毒和合成等。
而胚胎干细胞可以分化为肝细胞，并被用于肝脏再生。
研究表明，将胚胎干细胞移植到肝脏受损的小鼠体内，可以促进肝细胞再生和修复，并提高患者的生存率。
此外，胚胎干细胞也可以用于肝脏组织工程，如构建人工肝脏或肝细胞三维培养系统，以提供肝脏功能的替代。
3. 神经系统再生：神经系统损伤是目前临床难以治愈的疾病之一，而胚胎干细胞可以分化为不同类型的神经细胞，包括神经元和胶质细胞，用于神经系统再生。
研究结果显示，将胚胎干细胞植入到脊髓损伤的小鼠体内，可以促进神经元再生和脊髓功能的恢复。
此外，胚胎干细胞也可以用于脑组织工程，如构建人工脑片或模拟脑组织的脑片培养系统。
胚胎干细胞培养流程
胚胎干细胞培养流程
胚胎干细胞培养流程主要分为以下几个步骤：
1. 胚胎获取：从受精卵或早期胚胎中获取胚胎干细胞。
这一过程通常在体外受精（IVF）过程中进行，通过收集多余的受精卵或选择性将早期胚胎分离出来。
2. 胚胎培养：将获取的胚胎放置在含有营养物质和适当环境条件的培养皿中，以促进其细胞分裂和生长。
培养基通常包括必需的营养物质、生长因子和激素等。
通过优化培养条件，可以促进胚胎细胞的增殖。
3. 胚胎分离：在细胞分裂的早期阶段，胚胎细胞开始形成不同的细胞群，包括内胚层、外胚层和滋养层。
通过机械或酶法等方法，将这些不同细胞群分离开来。
其中，内胚层细胞具有胚胎干细胞的潜能。
4. 胚胎干细胞扩增：将分离得到的内胚层细胞培养在含有适当营养物质和生长因子的培养基中，促进其进一步增殖。
这个过程可以通过细胞培养技术，如经典的细胞培养方法或新兴的三维培养技术（如胶体微珠培养）来实现。
5. 胚胎干细胞鉴定：通过特定标记和检测方法，确认扩增的细胞群中是否存在胚胎干细胞。
常用的鉴定标志包括OCT4、SOX2和NANOG等胚胎干细胞特异性标记物。
6. 胚胎干细胞应用：胚胎干细胞可用于医学研究，如疾病机制研究、药物筛选和组织工程等领域。
此外，它们还
可以用于再生医学的临床应用，如组织修复和再生等。
需要注意的是，胚胎干细胞的研究和应用涉及伦理和法律等多个方面的问题，在进行相关研究和应用时应遵守相关规定和伦理原则。
胚胎干细胞的分化与操作技术
胚胎干细胞的分化与操作技术胚胎干细胞是一类极为重要的细胞类型，它们具有无限制的自我更新能力和分化能力，可以分化为各种不同类型的细胞，如神经细胞、心肌细胞和肝细胞等。
因此，胚胎干细胞在组织工程、再生医学和药物筛选等领域中具有广泛的应用前景。
本文将从胚胎干细胞的分化和操作技术两个方面探讨其相关知识。
一、胚胎干细胞的分化1. 胚胎干细胞的来源胚胎干细胞来源于早期胚胎发育的内质球，一般来自人类或动物的受精卵。
在体外培养的条件下，胚胎干细胞可以不断地自我更新和分化，形成各种不同类型的细胞。
这种特殊的分化潜能使得胚胎干细胞成为了组织工程和再生医学领域中重要的研究对象。
2. 胚胎干细胞的分化类型2.1. 向神经细胞分化在体外培养的条件下，胚胎干细胞可以通过一系列的生化处理和激素调节，分化为神经细胞。
这种无细胞移植的技术，已被广泛地应用于神经系统疾病的治疗，如帕金森病、阿尔茨海默病和脊髓损伤等。
2.2. 向心肌细胞分化在体外培养的条件下，胚胎干细胞可以通过生长因子和激素的管理，分化为心肌细胞。
这种技术目前已经实现了体外培育心肌片，对心脏病和心肌损伤的治疗有着广泛的应用前景。
2.3. 向肝细胞分化在体外培养的条件下，胚胎干细胞可以通过化学物质和激素的调节，分化为肝细胞。
这种技术可以应用于肝脏损伤和肝癌的治疗中。
二、胚胎干细胞的操作技术1. 胚胎干细胞的提取目前，胚胎干细胞主要通过体外受精的方法获得。
从优质卵子和精子中提取出受精卵后，使其在体外进入早期胚胎的发育进程。
从发育过程中的早期胚胎的内质球中分离出胚胎干细胞，科学家就可以开始对其进行操作。
2. 胚胎干细胞的培养在实验室中，胚胎干细胞通过培养基的供应进行体外培养。
培养基中的维生素和氨基酸等成分可以保证细胞分化所需的元素，并且可以保证其无限制的自我更新能力。
这种培养方法使得生物医学领域中各种研究得以开展。
3. 胚胎干细胞的操纵在实验室中，胚胎干细胞可以通过各种方法和技术进行操纵。
利用培育技术进行胚胎干细胞研究的实验步骤
利用培育技术进行胚胎干细胞研究的实验步骤胚胎干细胞研究是生命科学领域的一项重要研究课题，它对于理解人体发育过程、疾病治疗和组织再生等方面具有潜在意义。
而在胚胎干细胞研究中，培育技术是至关重要的一环。
本文将介绍胚胎干细胞研究中利用培育技术的实验步骤。
首先，胚胎干细胞的获取是进行研究的第一步。
在动物模型中，研究者通常选择小鼠胚胎作为胚胎干细胞的来源。
小鼠胚胎干细胞的获取通常是通过体外受精的方式，将小鼠卵子和精子结合并进行体外培育，待胚胎发育到适当的阶段时，可以将其收集下来进行后续实验。
在人类胚胎干细胞研究中，由于伦理和法律的限制，获取胚胎干细胞的方式相对复杂。
一种常用的方法是通过人类体外受精（IVF）技术，从试管婴儿中获得过剩的胚胎。
这些胚胎经过特定的处理和培养条件，可以获得人类胚胎干细胞。
接下来，培养胚胎干细胞需要提供合适的培养基。
培养基是一种特殊的液体，可以提供胚胎干细胞所需的营养物质和生长因子。
常用的培养基包括DMEM/F12等。
在培养基中，还需要添加适当的血清或血清替代物，以提供额外的营养和生长因子。
同时，在胚胎干细胞培养过程中，细胞需要附着在培养器皿上进行生长。
因此，在实验中，需要将胚胎干细胞转移到预先涂有特殊细胞粘附层的培养器皿中。
常用的细胞粘附层包括凝血素、明胶和胶原等。
在胚胎干细胞的培养过程中，温度和CO2浓度也是需要严格控制的因素。
一般情况下，胚胎干细胞的培养需要在37摄氏度和5% CO2的气氛下进行。
这样的环境条件可以模拟人体内的生长环境，促进细胞的正常生长和分化。
此外，胚胎干细胞在培养过程中需要定期检查和处理。
研究者通常使用显微镜观察细胞的生长状态，以及细胞形态的变化。
当细胞生长到一定程度时，需要进行细胞分离和传代，以保持细胞的稳定生长。
细胞分离可以通过使用胰蛋白酶等消化酶来实现，将细胞从培养器皿上分离下来，然后重新接种到新的培养器皿中。
在培育技术的基础上，胚胎干细胞研究可以进一步开展细胞分化实验。
胚胎干细胞的来源和培养的技术和条件
胚胎干细胞的来源和培养的技术和条件体外受精会产生多个胚胎。
这会产生一些过剩的胚胎不用于临床或不适合植入患者体内，因此可以在征得供体同意的情况下可能获得捐赠。
人类胚胎干细胞可以从这些捐赠的胚胎中获得，或者还可以使用患者的细胞和捐赠的卵子从克隆的胚胎中提取。
胚胎囊胚期的内细胞团(感兴趣的细胞)与滋养层细胞分离，滋养层细胞将来分化为胚外组织。
从免疫外科来说，通过抗体结合到滋养层细胞并且被另一种溶液去除，与此同时进行机械解剖以实现（内细胞团的）分离。
获得的内部细胞团细胞被接种到提供支持的细胞上。
内部细胞团细胞附着在一起并进一步扩张形成未分化的人胚胎细胞系。
每天需给这些细胞提供养分，而且每四至七天需通过酶解或机械分离一次。
为了发生分化，将人胚胎干细胞系从支持细胞中取出以形成胚状体，然后与含有必要信号分子的血清共培养，或者移植到三维支架中以产生。
胚胎干细胞来源于早期胚胎的内细胞团，这些细胞团是从供体雌性动物身上获得的。
马丁·埃文斯和马修·考夫曼报道了一种延迟胚胎植入的技术，该技术允许内细胞团数量增加。
这个过程包括摘除捐献者母亲的卵巢，给她注射黄体酮以改变激素环境，从而使胚胎在子宫中保持自由。
在子宫内培养4-6天后，胚胎即被收获并在体外培养至内细胞团形成“卵圆筒状结构”，此时内细胞团分离成单细胞，并铺在用丝裂霉素c处理的成纤维细胞上(以防止成纤维细胞进行有丝分裂)。
克隆的细胞系是由单个细胞生长而成的。
埃文斯和考夫曼表明，从这些培养物中生长出来的细胞可以形成畸胎瘤和胚状体，以及可以在体外分化，以上结果表明这些细胞具有多能性。
盖尔·马丁以不同的方式获得和培养她的胚胎干细胞。
她从交配后大约76小时的捐献者母亲身上取出胚胎，并在含血清的培养基中培养过夜。
第二天，她通过显微外科手术从晚期胚泡剥离出内细胞团。
提取的内细胞团在含有血清的培养基并用丝裂霉素c处理的成纤维细胞上培养，并根据胚胎干细胞的状态作调节。
胚胎干细胞的体外诱导分化与筛选
存在的问题
1.来源限制：由于需要胚胎作为胚胎干细胞 分离的材料，因此人类胚胎干细胞研究存 在来源限制的问题 2.体外培养困难：由于胚胎干细胞的体外培 养会自动分化，而且机制还不清楚，控制 胚胎干细胞分化的一致的技术有待完善。
3.安全性：胚胎干细胞和多能成体干细胞的 自动分化方向是多向的，干细胞移植后的 成瘤性风险比较大 4.伦理道德问题：获取人的胚胎干细胞、体 外培养的胚囊是否具有生命使人类胚胎干 细胞研究面临伦理道德问题
细胞因子诱导法
在体外诱导ES细胞分化方面，细胞因子诱导 法研究的比较深入。 细胞因子：也称为细胞激素，是一组蛋白质 及多肽，在生物中用作信号蛋白。这些类 似激素或神经递质的蛋白用作细胞间沟通 的信号。
细胞因子诱导分化的方法虽然操作简便， 但其诱导产生的成熟细胞数量较少，而且 纯度较低，不利于细胞移植治疗。 于是人们开始尝试利用转基因方法达到 诱导ES细胞定向分化
胚胎干细胞的体外诱 导分化与筛选
在特定的体外培养条件和诱导剂作用下，胚 胎干细胞可以分化形成其他类型的细胞。 包括：造血系细胞、心肌细胞、神经细胞、 脂肪细胞、胰岛素分泌细胞、内皮细胞、 上皮细胞、肝脏细胞、成骨细胞、表皮样 细胞等。 方法：细胞因子诱导法、选择性标记基因筛 选目的细胞法、特异性转录因子异位表达 法
选择性标记基因筛选目的细胞
利用基因工程技术将带有选择性标记的基因 转入胚胎干细胞，在体外培养胚胎干细胞， 利用选择性基因（如抗生素基因、绿色荧 光蛋白基因）
胚胎干细胞研究 前景及存在的问题
Байду номын сангаас
应用前景
由于ES 细胞具有体胚胎所不具有的优越性， 所以ES 细胞是研究胚胎发育的理想模型。 ES 细胞几乎可发育成所有类型细胞，可将 定向诱导产生的细胞或组织用于替代治疗 解决相应的严重疾病，如神经变性疾病 （帕金森综合症、亨廷顿舞蹈症、阿尔茨 海默病等），糖尿病，心脏病，原发性缺 陷病，烧伤等
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胚胎干细胞体外培养(一)胚胎干细胞的来源目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。
其中囊胚的ICM最为常用。
(二)胚胎干细胞的分离1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。
以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。
以PGCs取ES细胞时：小鼠取12.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或13.5～14.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。
2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。
从囊胚分离ICM的方法主要有三种：(1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。
这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。
(2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。
结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。
Evans和Kaufman采用这种方法第一个建立了小鼠ESCs系。
(3)显微外科学方法：小鼠受精后3～4天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养。
由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。
组织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落。
(三)胚胎干细胞的培养和建系ESCs的分离培养和建系是其得以应用的前提。
ESCs建系的原理是：将分离获取的ICM 或PGCs与饲养层共同培养，使之增殖而又保持其未分化状态，这样代代相传从而使ESCs成千上万的克隆。
目前建立ESCs系的方法有多种，常用方法包括以下过程：①原始ESCs 的获得：从受孕动物体内或体外受精卵培养中获得发育至桑葚胚或胚泡阶段的早期胚胎，用机械法分离、胰酶或胶原酶消化桑葚胚或胚泡内细胞团得到原始ESCs悬液。
②ESCs的传代培养：将原始ESCs悬液接种到经放射线照射或丝裂霉素C处理的成纤维细胞饲养层上进行培养。
培养1周左右，发现典型的ESCs集落，挑取细胞集落，用低浓度胰酶分散后，进行传代培养，3～5天传1次。
经反复传代培养，可获得生长旺盛的高纯度ESCs。
③ESCs 的鉴定。
由于ESCs来源于分裂增殖非常活跃的早期胚胎细胞，所以维持其生长代谢所需的营养要充足，用于ESCs培养的饲养层细胞培养基含高糖和谷氨酰胺，同时加胎牛血清、新生牛血清、2-巯基乙醇。
高糖的作用是提高ESCs的增殖速度，同时提供饲养层细胞生长所需的能量；谷氨酰胺作为细胞合成蛋白质与核酸的原料，是饲养层细胞培养基的必需品；2-巯基乙醇的作用为促进胚胎细胞的分裂增殖，并可还原血清中的含硫化合物，防止过氧化物对ESCs的损害。
1.胚胎干细胞的培养体系：(1)常规培养液：选择和配制高质量的培养基是体外培养ESCs的基本要求。
常用的培养基有MEM-α、DMEM、TCM-199、F12等合成培养基，以DMEM应用最为普遍。
再加入10%新生牛血清、10%胎牛血清、0.1mM 2-巯基乙醇、100μg/ml L-谷氨酰胺。
Thomson等建立恒河猴(rhesus monkey)ESCs系时，培养基中补加了1%的非必需氨基酸，结果ESCs生长良好。
Gardner和Lane发现，如果培养基中含有输卵管液中高浓度表达的氨基酸成分，胚胎卵裂、囊胚形成和孵化均显著增加。
(2)无血清培养基：血清中含有大量促细胞生长因子和多种营养物质，有促进细胞生长繁殖和黏附的作用，但血清中还含有许多未知的成分和一些分化诱导因子，不利于ESCs 未分化状态的维持。
为此人们尝试使用无血清培养液、化学合成培养液(chemically defined medium)进行ESCs的培养，加入刺激细胞生长的激素、细胞因子等，发现ESCs 增殖旺盛，且能保持未分化状态。
(3)条件培养基(conditioned medium，CM)：Martin曾应用小鼠畸胎瘤多能干细胞系PSA-1的条件培养基建立了小鼠ESCs系，后Axelrod对其进行了改良：将PSA-1畸胎瘤细胞接种于STO饲养层上，在含有10%胎牛血清的DMEM中贴壁培养，达到50%～75%汇合时更换培养液，用不含血清的DMEM培养基(加有10mg/ml转铁蛋白、10mg/ml 胰岛素)继续培养24小时，收集培养液，离心，去除细胞沉淀，上清液再经过0.22μm的微孔滤膜过滤，过滤后的PSA-1培养液再加入10%胎牛血清、0.1mM 2-巯基乙醇，即为PSA-1条件培养基。
使用前用含有10%胎牛血清、0.1mM 2-巯基乙醇的DMEM培养基稀释，PSA-1细胞分泌的细胞因子等活性物质的活性基本保持不变。
以后许多实验室制备了不同的条件培养基取代饲养层细胞来维持ESCs的生长，如BRL(buffalo rat liver cells)、PC10-6R转染的COS细胞、HBC-5637(5637 human bladder carcinoma cells)、RH-CM(大鼠心肌细胞条件培养基)等，这些条件培养基中都含有高浓度的细胞分化抑制因子，可以抑制ESCs的分化。
(4)饲养层(feeder layer)：饲养层是一层经过射线照射或丝裂霉素C处理后用作培养ESCs的底物细胞层。
饲养层细胞经射线照射或丝裂霉素C处理后，虽然失去分裂能力，但仍能保持生存，并有同化培养液的能力，为胚胎发育提供一些必需因子，如成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子等促有丝分裂因子，LIF等细胞分化抑制因子，促进其增殖，抑制其分化，而且可以除去体外培养环境中的毒素。
目前常用的饲养层有：STO、PMEF(primary mouse embryonic fibroblast)、SNL(G418R基因和LIF基因转染的STO)、HBC-5637等。
其中PMEF以其易于取材、抑分化效果好等特点而被广泛应用。
制备饲养层时，取达到80%汇合的原代鼠胚成纤维细胞，加入含10μg/ml丝裂霉素C的培养液，作用2～4小时后，弃去培养液，用无Ca2+、Mg2+的Hank’s液洗涤培养细胞4～5次后，0.125%胰蛋白酶—0.02%EDTA消化制成细胞悬液，接种在涂有0.1%明胶的四孔板中。
安立龙等将小鼠ESCs置于衰老饲养层表面进行培养时发现，ESC集落松散，表面及周围形成许多颗粒细胞、巨型细胞和上皮样细胞，认为衰老饲养层能诱导小鼠ESCs的体外分化，所以建议使用新鲜制备的饲养层细胞来分离培养ESCs。
2.胚胎干细胞的获取：(1)早期胚胎细胞培养法：早期胚胎细胞培养法是将致密桑葚胚用0.3% EDTA将其离散为卵裂球，并单个培养在STO(原代胎儿成纤维细胞)饲养层上，在培养48～72小时后，出现ESCs集落。
(2)胚胎与饲养层细胞共培养法：将早期胚胎如桑葚胚、囊胚、扩张囊胚等放置在铺有STO或3T3饲养层细胞的培养液中培养，待胚胎贴壁、透明带脱落、ICM附着增生，出现鸟巢状集落时，挑出ICM，消化ICM为细胞小块，用等体积培养液或胎牛血清中和胰蛋白酶作用，将细胞小块接种在新饲养层上培养，就会获得ESCs。
(3)ICM与饲养层细胞共培养法：用免疫外科手术法剥除滋养层细胞，以STO细胞为饲养层，用ESCs条件培养基培养ICM细胞，也可获得ESCs，剥除滋养层的主要目的是防止滋养层细胞对ICM细胞的竞争抑制和诱导分化。
(4)原始生殖细胞与饲养层细胞共培养法：将原始生殖细胞PGCs接种于STO饲养层细胞表面，可获得人ESCs。
从人流产胎儿生殖嵴分离和克隆人ES细胞，克服了实验材料难以取得的困难，这将会促进与人ESCs相关研究的进行。
(5)裸胚与饲养层细胞共培养：用玻璃针刺破囊胚或桑葚胚透明带，将有破口透明带的胚胎置于培养液中培养，次日，ICM就从透明带中脱出贴附于饲养层。
透明带坚固、厚、不易破裂的动物胚胎贴壁缓慢，影响ICM增殖，切除透明带，有利于ICM增殖和ESCs 形成。
而透明带薄，易于破裂的胚胎贴壁不受影响，切除透明带等操作对ICM有不利影响，使ESCs形成率降低。
(6)热休克处理胚胎与饲养层共培养：当胚胎在体内发育至2细胞或桑葚胚时，从子宫中取2细胞胚胎或桑葚胚，将胚胎置于41℃持续1小时，增加胚胎ICM细胞。
采用热休克处理胚胎，桑葚胚发育至孵化胚的效率为87%，2细胞胚胎发育至囊胚的比率为85.0%。
在胚胎分裂的活跃期用热应激处理胚胎，阻制了胚胎分化，扩大了ESCs分离的时间范围。
(7)切割胚胎培养：对早期胚胎进行切割，使胚胎一分为二。
若2个半胚均含有ICM 和滋养层细胞，半胚可发育为扩大囊胚，大约有35%的半胚可贴附于子宫成纤维细胞滋养层，且对以后的胚胎和胎儿发育无影响。
这表明，用切割半胚可以分离ICM和ESCs。
(四)小鼠胚胎干细胞分离培养的实验室技术由于ESCs在一般体外培养条件极易分化而失去其多潜能性特点，故需掌握一定的培养技术才能保留其多向分化潜能和体外扩增两大特点。
目前，以小鼠ESCs体外培养技术最为成熟，本文将以小鼠ESCs为例，介绍ESCs体外培养和ESCs分离鉴定等实验技术。
1.培养基的准备：(1)ESCs培养液：以DMEM(高糖，葡萄糖含量要在4.5g/L以上)为基础液，加入以下成分：NaHCO3 2.2g/L谷氨酰胺2mM非必需氨基酸0.1mMβ-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)0.1mM或单硫甘油(monothioglycerol)0.15mM庆大霉素50μg/ml或青、链霉素各100IU/ml(必要时可不加抗生素)15%胎牛血清(FBS)或10%胎牛血清+10%新生牛血清(NBS)LIF(leukemia inhibitory factor)，可选择性加入，用饲养层细胞饲养ES细胞时，可以不加，或加入500～1 000IU/ml，无饲养层细胞饲养时要加1 000IU/ml以上。