快速高通量的病原体核酸检测技术
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检测 体 系 ， 个 检 测过 程 大 约耗 时 ４ ， 整 ｈ 比病 毒 分离 的方法 敏感 ３ ０ ～１０ ０倍 ， 比先前一 些病 毒分 子检 也 测方法 灵敏度 更高 。采用这套 体 系检 测 了 １６ ３份 ８ 疑似脑 炎患者 的脑 脊 液 ， 发 现 病毒 核 酸 阳性 标本 共 １ ８份 （ ． ） 其 中 ５ ３ ８２ ， １份 肠 道 病 毒 阳 性 ， ３份 ３ ＨＳ Ｖ２阳性 ， ８份 Ｖｚ 阳 性 ， ５份 ＨＳ ２ Ｖ ２ Ｖ１阳性 。 该 结果 同时显示 ， 由于 肠道 病 毒在 中枢 神经 系 统感 染 中占有相 当大 比例 ， 纯依 靠从 脑 脊 液 中分 离病 单 毒进行诊 断远 远不够 。 案例 ２ 多 种不 同种 属 的病 毒 、 细菌 都 可 以引 起 呼吸道感 染 ， 出现相 似 的临 床表现 ， 也是住 院治疗 的主要原 因 。 唯有 通 过特 异 的 实验 室 检测 才 能确 定 病 原 。Ｌ ｍ 等 ， ２ ａ 将 １种 呼 吸 道 病 原 设 计 到 ５组
特异 基 因， 期 主要 以能 否 得 到 预 期长 度 的 Ｄ 早 ＮＡ
片段作 为判 定标 准 。１ ８ ９ ８年 Ｃ ａ ｅｌｉ 报道 了 ｈ ｍｂ ｒ ｎ ａ
一
种 衍 生 的 Ｐ Ｒ 方 法 —— 多 重 Ｐ Ｒ（ ｕｔ ｌｘ Ｃ Ｃ Ｍ ｌ ｐｅ — ｉ 可 以 同 时 扩 增 多 个 靶 基 因 ， 据 大 小 明 显 不 同 的 靶 根
生物检 测／ 鉴定 ， 具有精 确 、 速 、 快 高通 量的特点 。本 文就 近 １ ０多年来 出现 的一 些病 原 体快 速 高 通量 核
酸检测技 术及其 应用实例 进行综 述 。 １ 以 多 重 Ｐ Ｒ 为 基 础 的检 测 技 术 Ｃ
由于能够在 短时 间内实现病 原生 物特异性 基 因 片段 的体外大量 扩增 ， Ｃ Ｐ Ｒ技 术 问世 以后 很 快就 广 泛应用 于多种传 染性 疾 病 的临 床诊 断 ， 及 的病 原 涉 体 涵 盖 了细菌 、 毒 、 生 虫 、 菌 等各 种类 型 。典 病 寄 真 型 的 Ｐ Ｒ检 测 体 系的设 计通 常 针对 病原 体 的单 个 Ｃ
１ ５ ０２
中 国 人 兽 共 患 病 学 报
Ｃｈ ｎｅ ｅ Ｊ ｕ ｎ ｌｏ ｏｎ ｓ ｓ ｉ ｓ ｒ ａ ｆ Ｚｏ ｏ ｅ ｏ
文 章 编 号 ：０ ２ ６ ４ ２ Ｏ １ —１ ５ —０ １ ０ —２ ９ （ ０１ ｊ １ ０ ２ ７
快速高通量的病原体核酸检测技术
张 拥 军 ， 延 生 严
百度文库靶基 因 。
多重套式 Ｐ Ｒ检测 体系 （ 括 ４组 ＲＮＡ病 原 ， 组 Ｃ 包 １
ＤＮＡ病 原 ， 涉 及 多 种 ＲＮ 病 毒 、 共 Ａ ＤＮＡ 病 毒 、 细 菌、 衣原体 和支原 体） ， 中 初步测试 结果 显示 ， 体系 该 特异 性 好 ， 比传 统 培 养 分 离 方 法 敏 感 １ ０ １ ０ ０ ０ ～ ０
据实 际需要 （ 如相 同的症候 群 、 近的感染 器官 和部 相 位、 相似 的流行病 学特 征 等 ） 将 针 对 相关 病原 体 特 ， 异基 因 的一 系列 引物 混 合 ， 通过 预 实验 摸 索 出该 反 应体 系 的最佳 扩 增 条件 。所 需 要 的设 备相 对 简单 ， 成本 比较低廉 。一些 经典 的应用 实例如下 。
Ｐ Ｒ） ， 单 一 Ｐ Ｒ 体 系 中 加 入 两 对 以 上 的 引 物 ， Ｃ ）在 Ｃ
基 因片段判 定结果 。这个理 念推广 到病原体 诊断领 域， 即分别 将不 同病 原 体 的特 异 基 因引 物加 入 同一 个 反应体 系 中， 在一 个 反 应 中 同时检 测 多个 病 原体
中 图分 类 号 ： ３ Ｒ７
文 献标 识 码 ： Ａ
对于任何 传染性 疾 病 的 出现 ， 时检 测 和鉴 定 及
病原 体是有 效 控 制 疫 情 及 选择 合理 治 疗 方 案 的关 键 。随着生 物技术 的高速发 展 ， 以核 酸杂交 、 核酸扩 增 和核酸序列 分 析为 代 表 的分 子诊 断／ 测 技术 在 检 病原 体鉴定 和确认 中 越来 越 多地 发挥 了重 要作 用 。 相对 于传统 的以病 原分 离 培养 为 核 心 的手段 ， 型 新 检测技 术不再 局限 于依 靠 纯培 养 分离 病 原 ， 著缩 显 短 了病 原体鉴 定周期 ， 并且配 合新型 仪器 的使 用 ， 还 能够进 行一些 培养生 长缓慢 或暂时无法 培养 的病原
理 上讲 ， 系中包 含 的靶基 因引 物数 量要 求 尽 可能 体
多 。 实 验 过 程 中 ， 于 引 物 对 的 增 加 可 能 导 致 非 特 由
１ １ 经典 的 多重 Ｐ Ｒ 体 系及 实例 早期 的 多重 ． Ｃ
Ｐ Ｒ 检 测 体 系 主要 以 凝 胶 电泳 展 示 扩 增 结 果 ， 原 Ｃ 从
倍 。随后对 ３ ３份临床 疑似呼 吸道感 染患者 的鼻咽 ０
吸 取 物 样 品 进 行 检 测 ， １份 分 离 培 养 阳 性 ６ （Ｏ １ ）４ 份 直 接 免 疫 荧 光 阳 性 （ ３ ５ ｏ ， ２ ． ，１ １ ． Ｙ ） 而该 体 系得到核 酸 阳性 样 品 １ ７份 （ ８ ５ ） 显 著高 于 ４ ４ ． ，
案例 １ Ｒ ａ ｅｄ等 人 认 识 到 由 于 临床 实 验技
术 的缺 陷 ， 多数 中枢 神 经 系统 疾 病 的病 原学 诊 断普 遍缺 乏 实验 室证 据 支持 。于是他 们 在 １ ９ ９ ８年针 对
最常 见 的病 毒 性 脑 膜 脑 炎 病 原 体 ＨＳ 、 Ｖ２ Ｖ１ ＨＳ 、 Ｖｚ 和一些 肠 道 病 毒 ， 发 了一 套 多 重 套 式 Ｐ Ｒ Ｖ 开 Ｃ
特异 基 因， 期 主要 以能 否 得 到 预 期长 度 的 Ｄ 早 ＮＡ
片段作 为判 定标 准 。１ ８ ９ ８年 Ｃ ａ ｅｌｉ 报道 了 ｈ ｍｂ ｒ ｎ ａ
一
种 衍 生 的 Ｐ Ｒ 方 法 —— 多 重 Ｐ Ｒ（ ｕｔ ｌｘ Ｃ Ｃ Ｍ ｌ ｐｅ — ｉ 可 以 同 时 扩 增 多 个 靶 基 因 ， 据 大 小 明 显 不 同 的 靶 根
生物检 测／ 鉴定 ， 具有精 确 、 速 、 快 高通 量的特点 。本 文就 近 １ ０多年来 出现 的一 些病 原 体快 速 高 通量 核
酸检测技 术及其 应用实例 进行综 述 。 １ 以 多 重 Ｐ Ｒ 为 基 础 的检 测 技 术 Ｃ
由于能够在 短时 间内实现病 原生 物特异性 基 因 片段 的体外大量 扩增 ， Ｃ Ｐ Ｒ技 术 问世 以后 很 快就 广 泛应用 于多种传 染性 疾 病 的临 床诊 断 ， 及 的病 原 涉 体 涵 盖 了细菌 、 毒 、 生 虫 、 菌 等各 种类 型 。典 病 寄 真 型 的 Ｐ Ｒ检 测 体 系的设 计通 常 针对 病原 体 的单 个 Ｃ
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中 国 人 兽 共 患 病 学 报
Ｃｈ ｎｅ ｅ Ｊ ｕ ｎ ｌｏ ｏｎ ｓ ｓ ｉ ｓ ｒ ａ ｆ Ｚｏ ｏ ｅ ｏ
文 章 编 号 ：０ ２ ６ ４ ２ Ｏ １ —１ ５ —０ １ ０ —２ ９ （ ０１ ｊ １ ０ ２ ７
快速高通量的病原体核酸检测技术
张 拥 军 ， 延 生 严
百度文库靶基 因 。
多重套式 Ｐ Ｒ检测 体系 （ 括 ４组 ＲＮＡ病 原 ， 组 Ｃ 包 １
ＤＮＡ病 原 ， 涉 及 多 种 ＲＮ 病 毒 、 共 Ａ ＤＮＡ 病 毒 、 细 菌、 衣原体 和支原 体） ， 中 初步测试 结果 显示 ， 体系 该 特异 性 好 ， 比传 统 培 养 分 离 方 法 敏 感 １ ０ １ ０ ０ ０ ～ ０
据实 际需要 （ 如相 同的症候 群 、 近的感染 器官 和部 相 位、 相似 的流行病 学特 征 等 ） 将 针 对 相关 病原 体 特 ， 异基 因 的一 系列 引物 混 合 ， 通过 预 实验 摸 索 出该 反 应体 系 的最佳 扩 增 条件 。所 需 要 的设 备相 对 简单 ， 成本 比较低廉 。一些 经典 的应用 实例如下 。
Ｐ Ｒ） ， 单 一 Ｐ Ｒ 体 系 中 加 入 两 对 以 上 的 引 物 ， Ｃ ）在 Ｃ
基 因片段判 定结果 。这个理 念推广 到病原体 诊断领 域， 即分别 将不 同病 原 体 的特 异 基 因引 物加 入 同一 个 反应体 系 中， 在一 个 反 应 中 同时检 测 多个 病 原体
中 图分 类 号 ： ３ Ｒ７
文 献标 识 码 ： Ａ
对于任何 传染性 疾 病 的 出现 ， 时检 测 和鉴 定 及
病原 体是有 效 控 制 疫 情 及 选择 合理 治 疗 方 案 的关 键 。随着生 物技术 的高速发 展 ， 以核 酸杂交 、 核酸扩 增 和核酸序列 分 析为 代 表 的分 子诊 断／ 测 技术 在 检 病原 体鉴定 和确认 中 越来 越 多地 发挥 了重 要作 用 。 相对 于传统 的以病 原分 离 培养 为 核 心 的手段 ， 型 新 检测技 术不再 局限 于依 靠 纯培 养 分离 病 原 ， 著缩 显 短 了病 原体鉴 定周期 ， 并且配 合新型 仪器 的使 用 ， 还 能够进 行一些 培养生 长缓慢 或暂时无法 培养 的病原
理 上讲 ， 系中包 含 的靶基 因引 物数 量要 求 尽 可能 体
多 。 实 验 过 程 中 ， 于 引 物 对 的 增 加 可 能 导 致 非 特 由
１ １ 经典 的 多重 Ｐ Ｒ 体 系及 实例 早期 的 多重 ． Ｃ
Ｐ Ｒ 检 测 体 系 主要 以 凝 胶 电泳 展 示 扩 增 结 果 ， 原 Ｃ 从
倍 。随后对 ３ ３份临床 疑似呼 吸道感 染患者 的鼻咽 ０
吸 取 物 样 品 进 行 检 测 ， １份 分 离 培 养 阳 性 ６ （Ｏ １ ）４ 份 直 接 免 疫 荧 光 阳 性 （ ３ ５ ｏ ， ２ ． ，１ １ ． Ｙ ） 而该 体 系得到核 酸 阳性 样 品 １ ７份 （ ８ ５ ） 显 著高 于 ４ ４ ． ，
案例 １ Ｒ ａ ｅｄ等 人 认 识 到 由 于 临床 实 验技
术 的缺 陷 ， 多数 中枢 神 经 系统 疾 病 的病 原学 诊 断普 遍缺 乏 实验 室证 据 支持 。于是他 们 在 １ ９ ９ ８年针 对
最常 见 的病 毒 性 脑 膜 脑 炎 病 原 体 ＨＳ 、 Ｖ２ Ｖ１ ＨＳ 、 Ｖｚ 和一些 肠 道 病 毒 ， 发 了一 套 多 重 套 式 Ｐ Ｒ Ｖ 开 Ｃ