革兰氏阴性菌介绍

微生物实验室如何面对挑战?
更加标准化 更高质量 更高效率
更主动的信息交流
微生物实验室效率有待提升
实验室效率
实验室流程规划
实验室自动化
•流程评估 •实验室设计 •持续流程改善 •提升临床重视程度
•自动化仪器提升結果 报告时间 •减少大部分操作时间
Байду номын сангаас
实验室信息化
• 提升资料传输效率 • 提升资料溯源性 • 提升资料整理能力
MALDI TOF-微生物鉴定的TAT时间
天
小时
分钟
MALDI-TOF工作流程
节 省
灭活
+ 基质
点靶
TAT24-48h
药敏
每个样本
鉴定: 1~2min
约1分钟 药敏: 6~8 hr
VITEK 2 Compact工作流程
快 速
！
！
鉴定: 4~18hr 药敏: 6~8hr
MULTIDIMENSIONAL SCALING REPRESENTING MALDI TOF SPECTRA OF ACB COMPLEX SPECIES
TAT时间
——将数天数小时降低至数分钟
血培养+MS
• 分离胶管
Tip 头高速离心法 血培养前处理装置法
法
巧克力平板快速培养法
血培养+MS
传
统
血培养采集
流
仪器检测
程
报告时间：72小时
阳性血培养接 种固体培养基
传统ID/AST
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报告时间：24小时
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24019163
Diagnostic Microbiology and Infectious Disease
– Fastidious GN (August 2013)
鉴定—既有流程
• 手工API、半自动ATB、Vitek 2 Compact、凤凰、Walkaway等系统并 行采用
MALDI-TOF MS
Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight
Mass Spectrometry
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪
VITEK MS
靶板
MALDI-TOF MS 的原理
detection separation
2012
MALDI-TOF MS for detecting antimicrobial resistance
• Cheap and quick method • Detection of a real carbapenemase acticity • Possible application to detect
Hydrolysis corresponds to a mass shift of 18 Da, which can be easily detected by MALDI-TOF MS.
+ 18 Da
Resistance against-b-lactam antibiotics is a growing challenge for managing severe bacterial infections
MALDI-TOF MS 在细菌鉴定和药敏中的应用
倪语星
微生物检验 是感染性疾病治疗的依据
• 病原学检测：
– 确定病原菌
• 药敏检测：
– 确定敏感药物 – 确保治疗效果的药物剂量及给药方式
临床微生物检验起重要作用
目前形势对微生物实验室的挑战
• 硬件设施和人员的技术水平、诊断水平等参差不齐 微生物专家需多年的经验积累 传统鉴定能力有限
Detection of (non-)formylated Staphylococcus aureus delta-toxin production by whole-cell MALDITOF mass spectrometry. Gagnaire J et al. PLoS One. 2012
DETECTION OF LIPIDA MODIFICATION AS A POTENTIAL BIOFILM SIGNATURE
1319 965 558
7
31
17
40
18
33
95.1 96.6 90.7
331 651 852 4676
6
6
11
26
7
31
66 167
95.2 92.3 96.6 94.8
美国 FDA 临床试验结果
发表了6篇文章：
Journal of Clinical Microbiology
– 革兰阳性菌 (2013)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23658261
– 真菌 (2013)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23658267
Clinical Microbiology and Infection
– 厌氧菌 (2013)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23927597
Calculated masses and corresponding molecular forms defining the sensitivity and resistance patterns for different antibiotics…
This change in mass as a result of hydrolysis can be detected using a mass spectrom eter…
carbapenemases in Enterobacteriaceae and A. baumannii • Detection of degradation products depends on a sample preparation (e.g..buffer system)
Detection of b-lactamase by MALDITOF
• The sensitivity is 96.67%, with a specificity of 97.87%
Hrabak et al., JCM2011
A carbapenemase (KPC-2) producer
JCM2011
Carbapenemase Detection By MALDI-TOF MS
• 人力资源普遍不足 平均每1000床位<5位临床微生物专家
• 临床要求更快检验时效 更高的工作强度
• 临床微生物专家与临床医师对称、沟通有障碍 较少涉略临床用药指引
• 政策,法规和督查增多 抗菌药物临床应用管理办法（卫生部令第84号) 三级综合医院评审标准实施细则
• 耐药菌株逐年上升 更多药物敏感性报告需求
• 生化+经验，存在差错率（阴性、阳性判断错误） • 传统仪器法，存在速度较慢的问题（6-10小时不等） • 受限于生化反应的数量和种类，导致鉴定菌种库有限。
鉴定的革命—MALDI-TOF MS
MALDI-TOF 质谱工作原理
（TOF） 飞行时间质量分析器
离子在电场作用下，加速飞过飞行管道， 根据到达检测器的飞行时间不同而被检测。 离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间平方
FIG. 1. MALDI-TOF mass spectrogram of ampicillin for five ESBL-producing Escherichia coli strains and one ampicillin-susceptible strain. The figure demonstrates the accumulation of complete (blue arrow) and partial (red arrows) hydrolysis products in ESBL-producing strains. Accumulation of native ampicillin was present only in the susceptible strain DH5 (black arrows).
European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases
– 肠杆菌 (2013)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23818163
– Non-Enterobacteriaceae Gram-Negative Bacilli (Sept 2013)
鉴定—传统 Vs MS
缩短报告TAT（24h）
微生物培养 （without MALDI)
微生物培养 （with MALDI)
Day 1 接种平板培养；PCT
接种平板培养，PCT
革兰染色，直接镜检；
Day 2
配置鉴定药敏菌悬液上机；MS检测1~3分钟鉴定出细菌
及药敏试验
报告临床；同时做快速药敏
Day 3 ID&AST报告
Published application for MALDI-TOF MS
Analysis of antibiotic molecules and their modified products
Analysis of bacterial cell components
Analysis of ribosomal RNA methylation
成正比 ，从而对样品进行分析。
（MALDI） 基质辅助激光解析电离离子源
激光照射样品与基质形成共结晶薄膜， 激光照射晶体后, 基质分子吸收能量与
样品解吸附并使其电离。
Croxatto A et al.. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 2012 Mar;36(2):380-407.
Zlokamik et al., 1998
JCM2012
A MALDI-TOF MS-based assay was set up to investigate different Enterobacteria for resistance against different b-lactam antibiotics: Ampicillin, piperacillin, cefotaxime, ceftazidime, ertapenem, imipenem, meropenem.
JCM 2011(9):3321–4.
Detection of β-lactamases by MALDI-TOF
Procedure for detection of beta-lactamase metabolites by MALDI-TOF mass spectrometry.
acceleration ionization desorption
+ + + +
+ +
图谱 离子探测器
飞行时间 环形电极 加速区
基质／样品 目标
美国
细菌种类
革兰阳性 肠杆菌科细菌 非肠杆菌科的革兰阴性杆菌 革兰氏阴性杆菌 苛养菌 厌氧菌 真菌 总数
5个临床试验中心
检测标本数量 属量 种量 准确率 (%)
直
接
快
血培养采集
速
仪器检测
流
程
阳性血培养 预处理
MALDI鉴定 +
直接药敏
药敏—既有流程
• 为满足临床和监测要求，Kb和仪器法结合 • 人员配置有限，工作量大 • 如下午13：00仪器法和Kb法 • 仪器法最快下午19：00出结果 • KB法最快第二天下午才能拿到药敏报告
or • 临床科室有可能会在第四天 第五天早晨查房时更换抗生素
Detection of mutations with mini-sequencing
Detection of carbapenemase by MALDI-TOF
Carbapenemase
Hrabak et al., JCM2011
• Demonstrate the ability of this method to routinely detect carbapenemases in Enterobacteriaceae and Pseudomonas spp.
A
B
MDS obtained using CHCA matrix
MDS obtained using direct protein extraction method : formic acid-CHCA
CHARACTERIZATION OF SMALL MOLECULES: S. aureus DELTA-TOXIN