液相色谱图
高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
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色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
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液相色谱
(二)、HPLC与GC异同点
气相色谱 只能分析挥发性物质，只能分 析20%的化合物 不能用于热不稳定物质的分析 用毛细管色谱可得到很高的柱 效 有很灵敏的检测器如ECD和较 灵敏的通用检测器（FID和TCD） 流动相为气体，无毒，易于处 理 运行和操作容易 仪器制造难度较小 高效液相色谱 几乎可以分析各种物质
高效液相色谱的分类
1 按固定相的聚集状态可分为：
• 液液色谱法(LLC)
• 液固色谱法(LSC)
2 按分离机制可分为：
• 分配色谱法
• 吸附色谱法
• 化学键合相色谱法 • 离子交换色谱法
• 分子排阻色谱法
• 亲和色谱法
四、流程及主要部件
process and main assembly of HPLC
。亲和力大，保留时间长。
阳离子交换： 阴离子交换： 离子交换反应达到平衡时，保留值决定于平衡常数。容量因子 k’ 与平衡常数 K 成正比，且与流动相中的反离子浓度（ M+ 、 X- ） 成反比。 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离 子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸、蛋白质等。
四、 离子对色谱
ion pair chromatography 原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（ 对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏 水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；
液相色谱图谱常见问题及解决办法
液相色谱图谱常见问题及解决办法液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来。
其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决；而有些问题必须通过修改操作程序来解决。
本文汇总了一些关于液相色谱图谱问题的解决办法，这些办法也许能更有效的帮你解决问题。
一、峰拖尾原因和解决方法1、筛板阻塞a、反冲色谱柱b、更换进口筛板c、更换色谱柱2、色谱柱塌陷填充色谱柱3、干扰峰a、使用更长的色谱柱b、改变流动相或更换色谱柱4、流动相PH选择错误调整PH值。
对于碱性化合物，低PH值更有利于得到对称峰5、样品与填料表面的溶化点发生反应a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂b、更改色谱柱二、峰前延原因和解决方法1、柱温低升高柱温2、样品溶剂选择不恰当使用流动相作为样品溶剂3、样品过载降低样品含量4、色谱柱损坏更换色谱柱三、峰分叉原因和解决方法1、保护柱或分析柱污染取下保护柱再进行分析。
如果必要更换保护柱。
如果分析柱阻塞，拆下来清洗。
如果问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施。
如果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱。
2、样品溶剂不溶于流动相改变样品溶剂。
如果可能采取流动相作为样品溶剂。
四、峰变形原因和解决方法1、样品过载减少样品载量五、早出的峰变形原因和解决方法1、样品溶剂选择不恰当a、减少进样体积b、运用低极性样品溶剂六、早出峰拖尾程度大于晚出峰原因和解决方法1、柱外效应a、调整系统连接（使用更短、内径更小的管路）b、使用小体积的流通池七、K’增加时，脱尾更严重原因和解决方法1、二级保留效应，反相模式a、加入三乙胺（或碱性样品）b、加入乙酸（或酸性样品）c、加入盐或缓冲剂（或离子化样品）d、更换一支柱子2、二级保留效应，正相模式a、加入三乙胺（或碱性样品）b、加入乙酸（或酸性样品）c、加入水（或多官能团化合物）d、试用另一种方法3、二级保留效应，离子对加入三乙胺（或碱性样品）八、酸性或碱性化合物的峰拖尾原因和解决方法1、缓冲不合适a、使用浓度50-100mM的缓冲液b、使用Pka等于流动相PH值的缓冲液九、额外的峰原因和解决方法1、样品中有其他组份2、前一次进样的洗脱峰a、增加运行时间或梯度斜率b、提高流速3、空位或鬼峰a、检查流动相是否纯净b、使用流动相作为样品溶剂c、减少进样体积十、保留时间波动原因和解决方法1、温控不当调好柱温2、流动相组分变化防止变化（蒸发、反应等）3、色谱柱没有平衡在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱十一、保留时间不断变化原因和解决方法1、流速变化重新设定流速2、泵中有气泡从泵中除去气泡3、流动相选择不恰当a、更换合适的流动相b、选择合适的混合流动相十二、基线漂移原因和解决方法1、柱温波动控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器2、流动相不均匀。
液相色谱HPLC(双语版)
Refractive Index
Amperometric Detector
Amperometric Detection
§3-7液相色谱分离类型的选择
（自学，通过自学初步学会如何根据样品的性质选择合适的色谱分离方法）
§3-8 液相色谱法应用举例 §3-9 高效毛细管电泳
Self-study
●Stationary and Mobile Phases of HPLC
Self-study Problems
What kinds of stationary phases do each HPLC method have?
What characteristics do each stationary phase have?
敏感性
检测器
紫外 示差 荧光 电化学 电导
选择性
紫外吸收 通用型 荧光物质 电活性 离子
梯度洗脱
可以 不可以 可以 不可以 不可以
线性范围
105 104 103 106 2×104
检测限 (g/ml)
2×10－10 2×10－7 10－11 10－12 10－8
对流速 不敏感 不敏感 不敏感 敏感 敏感
Back
●Steric Exclusion Chromatography
Figure Schematics showing the basis of separation in size-exclusion chromatography. The solute represented by the solid circle(●) is the more strongly retained.
How to select mobile phase in HPLC?
HPLC(液相色谱)常识及疑难详解(附实际操作图解)
1 液相色谱基础知识1.1 液相色谱名词术语Mobile phase：流动相，在色谱柱中存在着相对运动的两相，一相为固定相，一相为流动相。
流动相是指在色谱过程中载带样品（组分）向前移动的那一相。
Stationary phase：固定相，柱色谱或平板色谱中既起分离作用又不移动的那一相。
Gradient elution: 梯度洗脱,一个分析周期中，按一定程序不断改变流动相的浓度配比, 使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。
Detection wavelength：检测波长，retention time：保留时间，被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间Peak:峰Peak Base：峰基线，经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。
一般应平行于时间轴Peak Height：峰高，色谱峰顶点至峰底的距离。
Peak Width：峰宽，色谱峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点间的距离Peak Width at Half Height：半峰高宽Peak Area：峰面积Tailing Peak: 后沿较前沿平缓的不对称峰Leading Peak:前沿较后沿平缓的不对称峰Ghost Peak: 假峰，并非由试样所产生的峰Baseline Drift:基线漂移Baseline Noise:基线噪音Band Broadening:组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象. 1.2 流动相1.2.1 流动相类型正相液相色谱流动相：一般正相色谱固定相极性大于流动相极性，采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。
常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等），极性小的组分先出柱。
反相液相色谱流动相：一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。
决明子(大黄酚、橙黄决明素)高效液相图谱(对照和样品)
<色谱图>采集人: Admin 样品名称: 决明子 样品 ID :进样体积: 10 uL数据文件名: 决明子z023-*******对照002.lcd 方法文件名: 决明子.lcm 批处理文件名: 金银花.lcb 报告文件名: Default.lcr数据采集: 2012-6-15 10:51:02数据处理: 2012-6-15 13:07:16峰表检测器 A Ch1 284nm 峰# 1 2 总计保留时间 13.965 31.184 面积1648741 851750 2500491高度59691 60136 119827面积 % 65.937 34.063 100.000高度 % 49.814 50.186 100.000理论塔板# 5823.163 110629.956２０１０版药典方法，岛津ＬＣ－２０１０Ｃ，迪马柱子（Ｃ１８＼２５０＊４．６）<色谱图>采集人: Admin 样品名称: 决明子 样品 ID :进样体积: 10 uL数据文件名: 决明子z023-*******样品002.lcd 方法文件名: 决明子.lcm 批处理文件名: 金银花.lcb 报告文件名: Default.lcr数据采集: 2012-6-15 11:47:41数据处理: 2012-6-15 13:08:02峰表检测器 A Ch1 284nm 峰# 1 2 3 4 5 总计保留时间 13.950 15.745 28.491 29.269 31.189 面积1074739 1204896 3312016 1820122 1016312 8428086高度37631 36461 214605 125204 71428 485330面积 % 12.752 14.296 39.297 21.596 12.059 100.000分离度0.000 2.274 20.578 1.982 5.081理论塔板# 5617.165 5693.975 79513.348 94356.967 110806.591２０１０版药典方法，岛津ＬＣ－２０１０Ｃ，迪马柱子（Ｃ１８＼２５０＊４．６）。
液相色谱中的谱图
甲醇：醋酸钠Leabharlann 80：20#组分名保留时间(min)峰高(mV)峰面积(mV.sec)浓度样品含量(%)
1Unknown3.73167372.454319.220.00000.0000
甲醇：醋酸钠=70：30
组分名保留时间(min)峰高(mV)峰面积(mV.sec)浓度样品含量(%)
醋酸钠pH=6.48
甲醇：醋酸钠=80：20
组分名保留时间(min)峰高(mV)峰面积(mV.sec)浓度样品含量(%)
1Unknown3.93500208.034337.480.00000.0000
2Unknown4.670006.80109.690.00000.0000
甲醇：醋酸钠=70：30
组分名保留时间(min)峰高(mV)峰面积(mV.sec)浓度样品含量(%)
1Unknown4.60833257.654409.590.00000.0000
甲醇：醋酸钠=60：40
组分名保留时间(min)峰高(mV)峰面积(mV.sec)浓度样品含量(%)
1Unknown6.67167140.585693.750.00000.0000
醋酸钠pH=6.01
甲醇：醋酸钠=80：20
1Unknown4.50333244.054441.790.00000.0000
2Unknown5.977503.3451.140.00000.0000
甲醇：醋酸钠=60：40
组分名保留时间(min)峰高(mV)峰面积(mV.sec)浓度样品含量(%)
1Unknown8.04417177.514616.170.00000.0000
组分名保留时间(min)峰高(mV)峰面积(mV.sec)浓度样品含量(%)
高效液相色谱
2 高效液相色谱仪
储液器 真空脱液器
高压泵
自动进样器 柱温箱
检测器 馏分收集器
图1 高效液相色谱仪示意图
由输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统 组成。
进样系统
分离系统
高压输液系统
图2 高效液相色谱仪示意图
数据处理系统
检测系统
HPLC组成 主要部分：高压输液系统、进样系统、分离 系统和检测系统。
100mg
1g
高效液相色谱与经典液相色谱比较
➢ 与经典液相色谱的工作原 理相同，但使用效能却远 大于经典的液相色谱；
➢ 高效液相色谱又被称为 现代液相色谱。
（1）高柱效：由于新型高效微粒固定相填料的使用，柱效 可达30000块/m理论塔板数；
（2）高灵敏度：在高效液相色谱中常使用的紫外吸收检测 器的最小检测量可达10-9g，而荧光检测器的灵敏度可达10-11 g，非破坏性；
2.2 进样系统
进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，把分 析试样有效地送入色谱柱上进行分离。
微量注射器
定量管
采样
进样
六通阀进样器工作原理示意图
手动进样阀
定量管 接头
柱外效应
柱外展宽（柱外效应） ：色谱柱外的因素所引 起的峰展宽。主要包括进样系统、连接管道及检测 器中存在死体积。可分柱前和柱后展宽。
高效液相色谱
1 概述
高效液相色谱法（HPLC， high performance liquid chromatography）发展于20世纪60年代末；
它不受样品挥发性的限制，可完成气相色谱法不 易完成的分析任务；
适于分析沸点高、难气化、分子量大、受热不稳 定的有机化合物、生物活性样品，这些化合物约 占有机化合物ห้องสมุดไป่ตู้80％。