转化摇菌提质粒
(完整word版)质粒转化流程
质粒转化流程：（以下操作如无特别说明均在超净台中操作）
1.取一管感受态细胞，待感受态细胞在冰上融化后，取1μl质粒DNA或20μl连接产物与
之混合(质粒DNA的用量不超过50ng)，冰浴30min。
2.42℃水浴90s。
3.冰浴5min。
4.加入800μｌ不含抗生素的LB液体培养基，于37℃摇床培养45min。
5.5000rpm离心3min，吸去800μl上清。
6.将剩余200ul菌液重悬，加入倒有含抗生素的LB固体培养基平板上，用涂布棒涂均匀。
7.正置数分钟，待菌液稍干，放入37℃培养箱中倒置培养，12-16个小时后可观察到菌落
形成。
8.第二天上午挑取单菌落于1ml含有抗生素的LB液体培养基中37℃摇菌。
9.晚上将摇起来的菌株每管加入500ul 50%无菌甘油，于-70℃中冻存。
注：可做一组阴性对照，即用无菌水取代质粒，与感受态细胞混合，其余操作相同，平板
上应无法长出菌落。
连接产物的转化应设一组用线性化载体的阴性对照和空载体的阳性对
照。
质粒提取摇菌的详细步骤
质粒提取摇菌的详细步骤质粒提取摇菌啊，这可是分子生物学实验里相当常见又重要的事儿呢。
咱先来说说这摇菌吧。
你得先有含有你要提取质粒的菌液才行。
这菌就像一个个小小的工人，在液体里忙活着呢。
你得从甘油保存的菌种里挑一点儿出来，就像从宝藏库里取一颗小珍珠一样。
这菌种啊，要小心地用接种环挑取，可别贪多，一点点就够啦。
然后把这挑取的菌种放到装有新鲜培养基的试管或者锥形瓶里。
这培养基就像是菌的食物，得给它们准备得妥妥当当的。
那这个装菌液的容器啊，可不能随随便便就扔到摇床上去晃悠。
要把它密封好，要是没密封好，菌液漏出来不说，还可能会混进去一些杂菌呢，那可就像一场不速之客闯进了一场精心准备的聚会，全乱套了。
把密封好的容器放到摇床里，这摇床的转速和温度可都是有讲究的。
转速就像风的强度，要是太快了，菌可能会被晃晕乎了，要是太慢了，菌又觉得不得劲儿，不好好生长。
一般来说，200 - 300转每分钟就挺合适的。
温度呢，就像菌的被窝温度，大多数菌在37摄氏度的时候长得最欢实，就像人在最舒适的温度下最惬意一样。
等菌在摇床里晃悠了一段时间后，你就能看到菌液变得浑浊啦，这时候菌就繁殖得差不多了。
这浑浊的菌液就像一杯加了很多料的果汁，满满当当的都是菌。
接下来就是提取质粒喽。
把摇好的菌液收集起来，这时候的菌液就像是充满宝藏的湖水，质粒就是湖水里珍贵的珍珠。
先把菌液离心一下，这就像是一场筛选比赛，通过离心力把菌都聚集到管子底部，就像把乱跑的小动物都赶到一个角落里一样。
离心完了之后，把上清液倒掉，可别倒得太猛，要是把菌也倒掉了，那就像把宝贝和水一起倒掉了，多可惜啊。
然后往菌沉淀里加入溶液，这溶液就像神奇的魔法药水，能把菌的细胞壁打破，让里面的东西都释放出来。
加完溶液后，要好好地把菌沉淀和溶液混合均匀，就像搅拌面粉和水做面糊一样，得让每一处都混合到。
再进行一次离心，这次离心就像二次筛选，把一些杂质去掉。
接着取上清液，再加入新的试剂，这试剂能让质粒乖乖地和其他物质分开。
质粒提取
质粒提取
挑单克隆摇菌过夜，菌液1ml 10000转x 1min 离心2次得沉淀，去尽上清。
1：加solutionⅠ100μl充分混匀。
同时加RNAase
2：加solutionⅡ200μl混匀，静置2—5分钟，至溶液透明
3：加solutionⅢ150μl混匀，出现白色絮状物
4：离心10000转x 10min
5：取上清+0.7倍体积的异丙醇混匀，常温静置15min
6：离心10000转x 10min，弃上清
7：75%乙醇洗沉淀2次，每次10000转x 5min，风干15min
8：加30μl TE/H2O。
粗提质粒可用酶切鉴定，不适于回收片断作克隆
大提质粒菌液体积增加，solutionⅠ、solutionⅡ、solutionⅢ体积也相应成比例增加，小提一般不需要酚抽提，大提质粒一般需要RNase消化和纯化，纯化即酚抽提，具体步骤如下：1：等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提2次
2：添加1/10体积的3M NaOAc
3: 添加2.5倍体积冷乙醇，在-20°C保冷30-60min
4：离心分离回收沉淀，用4倍量70%冷乙醇洗，干燥吹干
5：用适量（1/100—1/30体积）的TE/H2O溶解沉淀。
质粒提取步骤protcol
质粒提取步骤（去除内毒素的kit）准备：挑取单克隆后摇菌12-16小时‘异丙醇，无水乙醇，1.5毫升无酶EP管，无菌去离子水，涡旋在SOLUTION 1中加入RNASE A 保存在4度冰箱DNA W ASH buffer中加入无水乙醇，室温保存HBC Buffer 中加入异丙醇，室温保存检查SOLUTION 2是否沉淀，若有沉淀，加热到37度溶解N3缓冲液放在冰上热块加热到42 度，或者水浴锅，还有一个，加热到70度离心机转速5000XG微凉离心机13000XG步骤：1、摇菌2、收集菌液，5000XG，室温离心，10min3、弃掉上层培养基4、加入500ul SOLUTION 1/RNASE A ，涡旋或者抽吸，彻底混匀。
重悬完全能获得好的结果5、转移细胞到新的2ml离心管中6、加入500ul SOLUTION 2，涡旋或轻柔旋转数次，获得澄清裂解液，孵育2-3min，注意避免用力混合，否则会剪切染色体DNA，降低质粒纯度，不要让裂解液反应超过5min，SOLUTION 2要盖紧，防止空气中的CO2导致其酸化7、加入250ul冰浴预冷的N3 Buffer，轻柔颠倒数次，直到形成白色絮状沉淀（除蛋白）Buffer必须充分混合，如果混合液是粘的，棕色的，成团的，需要更多次混合完全中和SOLUTION。
完全中和绝对影响结果。
8、最大转速（大于13000XG），离心10min,形成白色沉淀，迅速进行下一步9、将清澈的裂解有转移到1.5ml EP管，量取清澈的裂解液的体积10、加入1/10的ETR溶液，此时会浑浊，颠倒EP管10次，彻底混匀如果转移500ul清澈裂解液，就加入50ulETR溶液11、冰上孵育10min,在孵育过程中，颠倒混匀数次，冰上裂解后悔澄清，2min/次12、裂解液42度孵育5min,裂解液又会出现浑浊13、25℃12000XG，离心3min,,ETR溶液在管底部14、将上层水相转移到一个新的1.5ml EP管中，加入1/2体积无水乙醇，轻柔颠倒6-7次，室温培养1-2min15、将小柱加入2ml管中，注意：选择性步骤：小柱是否处理16、将700ul混合液加入小柱中17、最大转速（大于13000XG），离心1min,18、弃去滤液，重新放回19、重复16-18，所有的东西都保存在柱里20、加入500ul HBC Buffer 注意加入异丙醇21、最大转速（大于13000XG），离心1min,22、弃去滤液，重新放回23、加入700ul DNA wash buffer 注意加入无水乙醇24、最大转速（大于13000XG），离心1min,25、弃去滤液，重新放回26、重复步骤23-25，27、最大转速空载离心2min,使管干燥，残余乙醇有干扰28、将滤柱放于1.5ml EP管中29、加入80ul洗脱缓冲液或者无酶水，直接加到中间，主要看穿着和穿着的悬液。
质粒提取常见问题解析
质粒提取常见问题解析质粒, 解析本帖引用网址：/thread-29246-1-1.html涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。
蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。
建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。
同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。
原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常?参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。
解决办法：1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。
2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。
3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下！【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常：1、利用你的嗅觉。
只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。
而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。
2、肉眼观察活化菌株。
对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。
】未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？参考见解：1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。
3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。
例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。
另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
质粒扩增、提取、转化和转染
质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序60质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序一、感受态细菌制备（CaCl2法）1. 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于5ml不加Amp的LB 培养基中，37℃振荡培养过夜（200r/min，至OD=1.5左右）。
2. 取0.5ml上述振荡过夜的菌液，转入含50ml的LB的三角烧瓶（1%）中，37℃条件下振荡培养2~2.5小时左右（200r/min），使OD600达到0.2~0.4左右（100μl测600nm时OD值）。
3. 将培养液50ml分装到4个10ml的离心管中，每管10ml，冰上放置10min，4. 4℃条件下，4000r/min离心10分钟，弃上清。
将离心管倒扣在吸水纸上，尽量倒尽管中的培养基。
5. 每管加入预冷的0.1mol/l CaCl2溶液2ml，用枪轻轻吹打，重悬沉淀。
转移到一个离心管中，共8ml。
6. 冰上放置10min后，4℃条件下，4000r/min离心10min。
7. 沉淀用预冷的1.6ml 含有15%甘油的0.1mol/l的CaCl2溶液悬浮。
分装成200μl的小份，共8管（40ml变为1.6ml浓缩25倍），-70℃保存备用。
二、溶液的配置1. LB培养基：1%蛋白胨（typtone）、0.5%酵母提取物（yeast extract）、1%NaCl，即10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH调PH至7.0，在补足水至1L。
高压灭菌20分钟备用。
2. 0.1mol/l的CaCl2溶液：1.1g/100ml，称取1.1g CaCl2，加入双蒸水定容至100ml，滤膜过滤或高压灭菌，分装成10ml/小份，4℃保存。
另取8.5ml+1.5ml已灭菌甘油，甘油含量为15%甘油，分装成1ml/小份（10份）4℃保存。
3. 配置液体培养基时，高压灭菌20min备用；4. 配置固体培养基时+（1.5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌20min。
实验五 转化后细菌菌落的快速裂解及质粒大小的检查
实验五转化后细菌菌落的快速裂解及质粒大小的检查一般情况下，可以根据质粒的大小来确定它是否带有插入片段。
以下方法足以产生在琼脂糖凝胶的单个泳道上加样所需的DNA量。
操作方法如下：1. 使转化得到的细菌在含有氨卞青霉素的琼脂培养基(LB)上生长至菌落直径达1mm左右。
2. 用灭菌的牙签挑取单菌落的一小部分，在含氨卞青霉素的LB琼脂平板上划线。
至少挑选20个左右的菌落照此划线，平板于37℃培养过夜，然后保存于4℃，直到相应菌落的回收。
3. 在划线培养的同时，将每一菌落的剩余部分用牙签一一转移并洗脱到事先加有50mL 灭菌的10mmo1／L EDTA(pH8.0)的1.5mL离心管中。
4. 每管加50mL配制的0.2mo1／L NaOH、0.5％SDS、20％蔗糖溶液，振荡30秒。
5. 于70℃温育5分钟，然后冷却到室温。
6. 加3mL 2mol／L KCl、0.2％溴酚蓝的溶液，振荡30秒。
7. 冰浴5分钟。
8. 用微量离心机于4℃以12000g离心3分钟，使细菌碎片的沉淀。
9. 制备1％的琼脂糖凝胶(5mm厚)，将50mL上清液加入样品槽内(5×2.5mm，长×宽)。
10. 染料迁移到凝胶全长的2／3—3／4时，于室温将凝胶放入溴化乙锭溶液(0.5ug／mL水溶液)中，浸泡20—30分钟。
11. 紫外灯下观察、拍照。
通过与同时点样的载体质粒的比较，不难发现重组子：比载体质粒迁移慢的很可能是含有插入片段的重组DNA。
可从保存于4℃的重新划线的平板上挑出相应的菌落，接种于2mL含抗菌素的LB培养液中培养过夜，然后提取质粒，用做重组时相同的限制酶做酶切鉴定。
重组子应该可以切下预期大小的插入片段。
提取质粒的方法
提取质粒的方法提取质粒是分子生物学实验中的常见步骤之一，其目的是将细菌中的质粒分离出来，以进行后续的实验操作。
提取质粒有多种方法，本文将介绍其中的几种常用方法及其优缺点。
一、CACl2热激转化法CACl2热激转化法是经典的提取质粒方法之一。
其过程如下：1. 将含有目的质粒的细菌培养物进行扩增，使细菌数达到一定程度。
2. 离心将细菌沉淀下来，将培养液中的菌落去除。
3. 用无菌水洗涤细菌沉淀，用CACl2溶液缓慢重悬细菌，使CACl2浓度达到0.1M。
4. 加入pH 6.5的冷缓冲液，浸泡在冰上15分钟。
5. 在热水浴中40-45℃，热激转化。
6. 加入含有抗生素的琼脂糖平板上进行筛选。
该方法的优点是操作简单，不需要特殊设备，且质粒提取量较大。
但其缺点也显而易见，即有毒化学物质CACl2使用，对质粒构建的影响较大，在序列克隆等需要高质量的质粒时不适用。
二、碱裂解法碱裂解法是一种有效的质粒提取方法，是利用质粒DNA与蛋白质的不同耐碱性，将质粒分离出来的方法。
其操作流程如下：1. 将细菌沉淀用含50mM Tris-HCl（pH 8.0）的盐水洗涤。
2. 加入含50mM Tris-HCl（pH 8.0）、25mM EDTA和1%SDS的Lysis Buffer（血浆蛋白）溶液，充分振荡混合，放在65℃水浴中加热，使细胞破裂并释放DNA和蛋白质。
3. 加入冷异丙醇，低温离心，使DNA和蛋白质分开。
注意此步骤中异丙醇的体积比例对DNA的提取量有较大影响，需根据实验需要酌情设置。
4. 倒出上清液，将沉淀用50%异丙醇洗涤。
5. 将洗涤后的沉淀用无菌水重悬，进行后续实验操作。
碱裂解法优点较多，其操作简单、快捷，可以得到较纯的质粒DNA，适用于后续实验需要高质量的DNA。
三、亲水性亲油性法亲水性亲油性法又称酚-氯仿法，其原理是利用亲油性有机溶剂和亲水性酚盐在酚-氯仿-异丙醇三相体系中分离质粒和其它细胞成分。
其操作流程如下：1. 培养含有质粒的细菌，并进行扩增。
提取质粒实验学习整理
提取质粒实验学习整理1.菌液OD值越高，质粒产量越高2.大肠杆菌OD值越高，提取的质粒的浓度就越高吗还要看质粒纯度，纯度一般在1.8-1.9最适合，再高了就是蛋白污染3.一般而言gene 导入原核细胞称转化，导入真核细胞称转染。
4.用QIANGEN质粒提取试剂盒提取质粒，我没有提不出来的经历，有以下几点要注意，从细胞、试剂盒及操作三个方面考虑：1..确定细菌是阳性转化子，应该含有你的质粒，过夜摇菌已足够，记得加抗生素。
2.关于试剂。
溶液2中是否浑浊，SDS在低温产生结晶，使用前用37度水浴。
溶液3中的醋酸钾可能产生结晶，使用前应该温水溶解。
确认洗脱液1中的乙醇没有挥发，闻一闻就知道了。
洗脱液2是否在使用前已加乙醇，加乙醇后在盖子上打钩，以免与没加的混淆。
3.抽提过程中，加溶液1（放4度保存）后应该充分悬浮菌体，以便裂解充分；加溶液2和3应该快，加溶液2后打开盖有丝状物，加溶液3出现絮状沉淀，离心要充分。
请严格按说明书操作。
如果你觉得以上几点你都做的很好，试剂盒是新的，换含其它质粒的菌株试一试，如pUC18的转化子。
如果试剂和是用过的，放置太久，换其它试剂盒吧，要不换土法试试！5.Qiagen我卖这么多个，到目前还是零投诉。
不过出现问题基本如下：1。
如果是质粒超纯试剂盒，得率偏低，因为Qiagen自己得专利树脂填料，对纯度得要求比对得率得要求高，在超纯质粒的抽提过程中，得率比同类产品要低些，不过OD 得比值很好，就是纯度很高。
2。
如果是质粒小提，快速提取等，基本不出什么问题。
有些操作要注意，1。
Solution 2,3有没有沉淀。
2。
细菌培养过程中，有没有抗生素选择压力，不然质粒丢失。
4。
收获细菌有没有测OD值，有些仅凭目测，呵呵，又差异得。
不过，有个建议，质粒小提，快速提取，就不要用Qiagen得了，偏贵。
6.从你跑的电泳来看，你的质粒不是很多，差不多就是300ng,可能你的小片段太少，所以你的小片断那就看不出来了，不知道你大片段分子是小片段的多少倍，一般跑电泳能看到在50ng左右,标准的MARK是每条带是50ng,如果你即使切下来了，但你的小片段太小，也是什么都看不到的，这里有一个大约估计量的公式，小片段的纳克数等于大片段纳克数乘他们分子量的比值7.提取质粒失败的可能的原因：1：克隆有问题；2：提质粒时裂解时间过长；3：质粒提取试剂盒的溶液有问题；4：有点可能本身拷贝数就比较低，可换感受态重新转化后提质粒8.做重组质粒转化大肠杆菌，质粒用的pGL3-Basic (长度4818bp),连接的目的片段为1.8kb，通过抗性平板筛选每次都有几个单菌落长出，挑单菌落于LB培养基扩增，之后摇菌提取质粒想做酶切验证是都阳性克隆，但是提取到的质粒具有多个条带，这样的话也就没法做酶切验证了。
细菌转化实验步骤
1.将质粒和感受态细胞从冰箱中取出，放入冰上
2.在无菌操作台中，将质粒1微升加入到感受态菌20-30微升中（不要用手捂菌，手也不要碰到EP管盖）
3.冰上30min，每隔5min轻摇EP管
4.将混合液在42℃中热激90s，将质粒粘附在感受态细胞表面，立即冰上静置1min
5.加入200微升LB培养基，轻轻摇匀，37℃振荡1-2h(45min)，使菌恢复正常
扑灭酒精灯：盖的时候多盖几下
在倒扣平板前要先让培养基吸收菌，故先正放十几分钟，然后再倒扣起码14h让菌张起来。这个过程中不要开摇晃，直h
7.挑取单克隆，扩大培养（培养基中加入相应抗生素，每100ml培养基加100微升抗生素）
37℃摇菌（不超过16h）
8.提质粒
Attention：涂布平板时三角涂布棒刚烧完后记得冷却一下！！！！！
涂布平板的方法：用枪将液体滴加到中间，然后从内往外画圆稀释菌，以便最后在边缘处得到单克隆
质粒抽提详细步骤
质粒抽提详细步骤质粒提取实验步骤摇菌：（先倒入锥形瓶再消毒）1 将配好的LB培养液高温消毒后，放入40C冰箱，冷却；2 在酒精灯旁操作，向锥形瓶中加入100mlLB，加入150ul氨苄（看抗性）；3 再向锥形瓶中挑入少量菌（液体：60~80ul；固体：绿豆大小）；4 放入摇床，摇一夜。
LB培养液的配方1）胰化蛋白胨（）10g/L(tryptone)2）酵母提取物5g/L（yeast extract）3）Nacl 10g/L4）去离子水（双蒸水）950ml 终体积为1000ml5）配好后，需高温消毒（纱布或报纸包）质粒提取：QIAGEN plasmid Midi kit（25）试剂盒准备2个50mlEP管，提2个质粒一共要6个50mlEP管。
使用前注意事项：1）P1在使用前要加入RNAase，终浓度为100ug/ml，P1一直放40C。
2）事先溶解P2（天冷时P2会出现沉淀，应放37 0C水浴溶解）。
3）预冷至P1、P3（P2作用为裂解细胞）至4 0C。
4）提质粒前一天消毒50ml，20ml管子及2mlEP管及LB，干燥待用。
5）摇菌和保菌都要开酒精灯，尽量保持无菌，用酒精灯擦桌子和瓶口，不能讲话或者戴口罩。
步骤：1 摇菌100ml过夜（100ml菌分两次离心，锥形瓶中剩余的菌留作保菌用）；2 酒精灯旁操作，倒入50ml管子，6000g、15min（离心力/RCF）、40C（配平及记得更换转子/Rootor）,离心完后弃去上清收集细菌；3 用3ml P1重悬细菌沉淀物（充分溶解，沉淀可通过枪反复上下吸打混匀）分两管离心，各加3ml P1，后再混合为一管，保证100ml 菌液用了3ml P1重悬。
4 加3ml P2（P2比较粘稠，用之前要晃匀），充分混匀到整个液体都变蓝（上下轻柔颠倒4~6次），室温放置5min（混匀时不可过猛，以免弄断genemic DNA；裂解物是粘性的，溶解时间切勿超过5min，一旦加入P2就应立即将管子盖上，以防酸化）；5 加入预冷的P3 3ml，立即温和的混匀至蓝色消失（上下轻柔颠倒4~6次），放置冰上避光孵育15~20分钟P3后，产生蓬松白色物质，沉淀物变得不粘（沉淀物包括genemic DNA、蛋白质、细胞碎片、SDS）；6 4 0C、≥20000g、30min离心，将上清液放入另一10ml的EP 管（注意移动时不能晃，以免将沉淀转入），直接在离心室加，加完一个扔一个，注意一点沉淀都不能吸进去，吸时用双枪头，黄枪头套在蓝枪头外，减少冲击；7 离心同时，用4mlQBT润洗QIAGEN-tip100（平衡膜），弃去脱下上液；8 用2×10mlQC洗QIAGEN-tip100两次，弃去滴下的液体（注意滤膜不要干燥，管中液体满了就弃去，液面不要触及TIP下部，如果触及则用双蒸水冲洗），加入离心后并经过萃取的上清液，萃取步骤如下图；20000g、15min、4 0C离心把离心后的上清液直接加到TIP中过滤（TIP标记）；9 待液体差不多滤过时，用5ml的QF洗脱膜上的DNA，用10mlEP管收集洗脱物（最先流出来的3~4滴弃去），收集后混匀，可用摇床10min；10 每管用3.5ml的室温异丙醇沉淀DNA，混匀10min，然后4 0C、≥15000g、离心30min，沉淀在管底的异丙醇沉淀物有玻璃样外观，非常松软，弃去上清时小心；11 先加1ml的70%乙醇洗DNA沉淀，移入1.5ml的EP管（把沉淀打散后再移入，能不用2mlEP尽量不用，TIP的架子要回收），15000g离心10分钟，倒去上液，不要触及沉淀，重复洗一次（把沉淀吹打到液体中，轻柔）；12 空气中干燥沉淀5~10分钟，待干燥后（无色透明）用合适体积（50ul）的AE溶解沉淀（560C水浴10min，加快溶解），放入4 0C冰箱过夜；13 第二天测浓度（DNA），稀释到1ug/ul，待转染用。
质粒DNA的转化及提取
[材料]1. LB液体培养基的配制:胰蛋白胨(bacto-tryptone): 10.0 g酵母提取物(bacto-extract): 5.0 gNaCl: 10.0 g加蒸馏水至1000 ml, pH 7.0, 高压灭菌。
2. 铺板培养基的配制：取200 ml LB培养基，加Agar A 3 g （1.5%），氨苄青霉素（100 μg/ml），于锥形瓶中，此时液体为浑浊状。
高压灭菌后，液体变清亮。
在液体降温但凝固之前，倒入培养皿中，铺满皿底即可。
待培养基冷却凝固后，用封口膜将培养皿封住。
3. PⅠ液:Glucose 2252gTris·Cl(PH 8.0) 1M 6.25mlEDTA 0.5M 5ml250ml容量瓶定容高压。
4. PⅡ液：NaOH 10M 5mlSDS 10% 25ml250ml容量瓶定容。
5. PⅢ液：6M KAc 50ml×2冰乙酸11.5ml×2三蒸水38.5ml×2200ml 高压。
6. PⅣ液：无水乙醇500ml0.5M EDTA 20ml1M Tris·Cl 50ml5M NaCl 4ml1000ml定容分两瓶。
7. 树脂：10mg/ml (终浓度)母液：200mg/ml应用液： 20g 异硫氰酸胍2.5ml树脂母液定容至50ml,使用前混匀。
[质粒DNA的转化]1. 将滤纸上的质粒( pRNA-U6.1/neo) 沿所画圆圈剪下,共8 μg，剪1/4，即为2 μg。
取一1.5 ml EP管，加入无菌高压蒸馏水50 μl，将剪好的滤纸浸泡入蒸馏水中。
2. EP管放入金属浴，55℃×10 min，取出后10000 rpm×1 min，取上清2 μl（约80 ng）。
3. 取解冻后的感受态细菌DH5a 100 μl，加质粒2 μl（约80 ng），加质粒时轻柔吹打2-3次即可，然后轻轻旋转，冰上静置30 min。
载体构建的基本步骤
载体构建
一、原理
依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
二、操作步骤
5、载体与目的基因连接
如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。
置于温箱，12-16℃，保温8-16h
6、转化（连接产物转化到感受态细胞中）
依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，
12-16h。
7、单克隆检测
（1）挑单克隆
先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的
AMP，用枪头混匀；取1.5mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种。
质粒转化步骤
质粒转化步骤SOB培养基（用于菌种扩增）胰化蛋白胨20g酵母提取物5gNaCl 0.5 gKCl 0.186gMgCl2 0.95g用去离子水定容至1L，在121℃高压下蒸汽灭菌20min。
琼脂SOB培养基（用于制备固体培养基）胰化蛋白胨20g酵母提取物5gNaCl 0.5 gKCl 0.186gMgCl2 0.95g琼脂粉15g用去离子水定容至1L，在121℃高压下蒸汽灭菌20min。
SOC培养基（用于菌种复苏）除含有20 mmol/L的葡萄糖外,其他成分与SOB培养基相同。
SOB培养基经高压蒸汽灭菌后,让其冷却至60℃或60℃以下，加入20mL无菌的1mol/L葡萄糖(该溶液的配方是将18g葡萄糖溶解于90mL去离子水中。
待完全溶解后，用去离子水定容至100mL，0.22um滤器过滤除菌)。
操作步骤：1.从-70℃冰箱中取出一管感受态细胞。
用手掌握住小管解冻细胞。
待细胞解冻后，将小管转移到冰浴中。
将细胞置于冰上10min。
2.使用预冷的无菌吸头将感受态细胞转移到预冷的1.5ml聚丙烯管。
加入转化DNA(每50μL感受态细胞中最多加入10ng)，体积不超过感受态细胞的5%。
轻轻旋转小管多次，混匀。
将管子置于冰上30min。
将细胞置于冰上应避免使用玻璃管，因为它们可降低约10倍的转化效率。
注：细菌转化必要的对照在每次实验中应设有阳性对照，以测定转化效率；并设置阴性对照，以排除污染的可能性，以及确定实验失败的潜在原因。
阴性对照：转化实验中设置一份感受态细胞不添加DNA。
将此份细胞平铺于一个含有适当抗生素的、用于筛选转化体的琼脂平板上。
此平板上应该无茵落长出，没有涂布细菌的选择性平板也应如此。
如果有茵落长出,考虑以下可能性。
a在实验过程中感受态细胞被具有抗生素耐药性的细茵菌株污染。
可能转化方案中使用的溶液/试剂被污染。
b选择性平板有问题。
可能是忘记了在平板中添加抗生素或者加入抗生素时琼脂太热。
c选择性平板被具有抗生素耐药性的细茵菌株污染。
质粒的提取与转化
所用试剂的ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ用 酚和氯仿
酚和氯仿都是表面变性剂，非极性分子，可以使蛋白质失去水合状态而变性。 10%间甲酚，降低酚溶点，增加对蛋白质变性。 氯仿与水不互溶,能加速有机相与液相分层，去除植物色素和蔗糖。 在抽提DNA过程中，由于酚与氯仿是互溶的，所以用酚氯仿混合液效果好。
酚的质量与保存
在提取DNA过程中，酚的质量很重要。酚容易被空气氧化变成粉 红色，这种酚易降解DNA，不能用。 酚应该重蒸馏，并及时加入pH8.0的Tris水溶液或TE缓冲液饱 和酚，酚经水饱和后在抽提DNA时，不会吸收DNA样品中水份，减少 DNA的损失。加入Tris水溶液或TE缓冲液也可以使酚隔绝空气。 另外也可加入巯基乙醇和8-羟基喹啉至最终浓度为0.1%目的是 抗氧化和抑制RNase酶活性。经这样处理后，将酚分装在棕色瓶中， 盖紧后，-20℃保存。可使用数月。
感受态细胞的保存
新鲜感受态细胞用于质粒DNA转化最好。但新鲜感受 态细胞0℃~ 4℃贮存不超过3天。长期保存，必须将细胞在70℃干冰或液氮气体部分速冻5分钟，再置于-80℃冰箱中 保存，一般可保存1年。
质粒的转化
感受态细胞新鲜配制的或从-80℃冻存取出后置于冰水中融化。 ① 感受态细胞新鲜配制的或从 ℃冻存取出后置于冰水中融化。 取出分装到Eppendorf管中，每管 管中， ② 取出分装到 管中 每管100~200uL。 。 加入需转化的DNA溶液 溶液2~5uL充分混匀 充分混匀(1~5ng/uL DNA)。 ③ 加入需转化的 溶液 充分混匀 。 冰水中放置30分钟 分钟。 ④ 冰水中放置 分钟。 热休克) ⑤ 42℃水浴 秒。(热休克 ℃水浴90秒 热休克 冰浴2min。 ⑥ 冰浴 。 每管再加入1mL LB培养基，37℃振荡培养 小时。 培养基， ℃振荡培养1小时 小时。 ⑦ 每管再加入 培养基
细菌转化,单克隆挑选及摇菌
细菌转化,单克隆挑选及摇菌细菌转化，单克隆挑选及摇菌1.接种50~100ul菌液于5 ml LB试管中，37℃ 250转/分震荡约3小时，至OD600≈0.2-0.6时停止振荡（透过管能看到手指要挑选细菌活力强时）2、取1.5ml离心管与菌液放冰浴冷却15min3.将细菌转移至1.5mL的离心管中，4℃，4000转/分离心15min （防止菌体破裂），弃上清液4.以1ml 0.1M（0.2倍菌液体积）预冷的CaCl2重悬细菌沉淀，冰浴30min，4℃，4000转/分离心15min，弃上清液5.用250μl（0.05倍菌液体积）预冷的CaCl2重悬细菌沉淀6.1ng质粒DNA加入到感受态细菌中，轻轻旋转几次以混匀内容物，冰上放置30分钟7.将离心管放入42℃的循环水浴中，90秒8.将离心管置于冰上，10分钟9.加入200ulsoc 培养基（加入了葡萄糖等物质，比LB培养基更营养，更利于热激后细菌恢复），200转37℃45min，同时将培养平板放入孵箱10.用一无菌玻璃推板轻轻将转化的细菌均匀地涂于培养基上。
（玻璃推板充分火焰消毒，待充分冷却后再进行涂板，可将推板贴在平板盖内侧，再用手隔板盖感觉温度）11. 37℃培养箱中正置平板，待液体完全干后再倒置平板，培养16小时，将平板取出4℃放置约2小时后观察。
挑选单个肉眼能见菌落，坐上在平板上做上标记（菌落不易太大，否则有杂菌混入，培养箱中培养不超过16个小时）12、在超净台内，将细菌挑入LB培养基，一个菌落一支管，180~200转/分钟过夜（12~16个小时，以菌体浑浊为佳）。
抽取质粒（抽取质粒时每支LB管也应对应相应的EP管）备注LB培养基制备蛋白胨 1%（g/ml）NaCl 1%酵母粉 0.5%到此配方为LB培养基（液体）若配制平板则加琼脂粉 1.5%氨苄青霉素的储存浓度是50~100ug/ul，使用时稀释1000倍，以下步骤在超净台进行，培养液高压灭菌后，待容器不烫手时加入氨苄，轻摇混匀，倒入平板，每板大约20ml。
转化摇菌提质粒
一、感受态细胞XL-1转化实验（1）5ng DNA+100μl感受态细胞XL-1于离心管中,混匀，冰浴30min。
（2）42o C, 45s。
（3）冰浴2min。
（4）涂布于固体LB平板上(含50mg/ml 氨苄青霉素, 37 o C预热)。
（5）放入37 o C恒温孵育箱，待液体吸收完全后，倒置孵育16-18h。
（6）保鲜袋密封后，倒置放于4o C冰箱保存。
二、菌液的培养与质粒的提取1.每个样本挑取5个细菌，进行摇菌，提取质粒。
（一个细菌一支管）在50ml离心管里加入5ml液体LB和5μl 50mg/ml氨苄青霉素，用200μl 枪头挑取过夜培养LB平板上的单克隆，枪头打入离心管中，置于37o C摇床，250r/min培养16～18h，质粒提取。
（老师，这里要先挑取一个细菌进行摇菌后再分成五支离心管重新摇菌，还是直接挑取5个菌落直接摇菌）质粒提取(采用天根质粒小量多次提取试剂盒提取，步骤如下)：（1）吸附柱中加入500μl平衡液BL，13000rpm离心1min。
倒掉收集管中废液，吸附柱放回收集管，备用。
（2）收集5ml菌液，13000rpm/min, 离心10min，收集沉淀。
（3）加入500μl溶液P1(含RNase A), 使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
（4）加入500μl溶液P2, 温和地上下翻转6～8次，使菌体充分裂解。
（5）加入700μl溶液P3, 立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀，此时会出现白色沉淀。
（6）13000rpm/min离心10min，收集上清分次加入过滤柱中(800μl/次)。
（7）13000rpm离心2min后将上一步得到的滤液分次加入吸附柱中(800μl)。
（8）13000rpm离心1min，弃掉滤液。
（9）加入500μl去蛋白液PD, 13000rpm/min离心1min后弃滤液。
（10）加入600μl漂洗液PW, 静置5min, 13000rpm/min离心1min后弃滤液。
质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序
质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序；一、感受态细菌制备（CaCl2法）；1.从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种；2.取0.5ml上述振荡过夜的菌液，转入含50m；3.将培养液50ml分装到4个10ml的离心管中；4.4℃条件下，4000r/min离心10分钟，；5.每管加入预冷的0.1mol/lCaCl2溶液；6.冰上放置10min后，4℃条件下质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序一、感受态细菌制备（CaCl2法）1. 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于5ml不加Amp的LB 培养基中，37℃振荡培养过夜（200r/min，至OD=1.5左右）。
2. 取0.5ml上述振荡过夜的菌液，转入含50ml的LB的三角烧瓶（1%）中，37℃条件下振荡培养2~2.5小时左右（200r/min），使OD600达到0.2~0.4左右（100μl测600nm时OD值）。
3. 将培养液50ml分装到4个10ml的离心管中，每管10ml，冰上放置10m in，4. 4℃条件下，4000r/min离心10分钟，弃上清。
将离心管倒扣在吸水纸上，尽量倒尽管中的培养基。
5. 每管加入预冷的0.1mol/l CaCl2溶液2ml，用枪轻轻吹打，重悬沉淀。
转移到一个离心管中，共8ml。
6. 冰上放置10min后，4℃条件下，4000r/min离心10min。
7. 沉淀用预冷的1.6ml 含有15%甘油的0.1mol/l的CaCl2溶液悬浮。
分装成200μl的小份，共8管（40ml变为1.6ml浓缩25倍），-70℃保存备用。
二、溶液的配置1. LB培养基：1%蛋白胨（typtone）、0.5%酵母提取物（yeast extract）、1%NaCl，即10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠溶解在950ml水中，用1mo l/LNaOH调PH至7.0，在补足水至1L。
高压灭菌20分钟备用。
转化、提质粒
转化1、取50μL冰浴上融化的感受态细胞加入目的质粒（质粒的终浓度100ng即可，通常取1μL即可），冰浴上放置30S2、42℃，热激45s,冰浴上放2-5min3、向每个EP管中加入500μL LB培基（不含抗生素），混匀后置于37℃，摇床孵育1h,使细菌复制。
4、涂板：大皿：80μL，小皿：30-50μL玻璃棒用前烘3次，待冷却后均匀涂菌。
将涂好的板置于37℃孵箱中，过夜培养，1h后将平板倒过来（防止水分蒸发）提质粒：做储备菌：700ul菌液+600ul 100% 甘油用无菌的ＥＰ管封口后放于-20℃１.配平（加ＤＤＷ）２.离心5000g,5min，弃上清，1ml PBS吹匀，移至2mlEP管，vertex混匀，离心5000g,5min３.去上清，加500μL Solution I（确定加RNAase），vertex混匀４.加500μL Solution II，轻轻颠倒7-10次，静置2min,开低温高速离心机。
５.加250μL N3 buffer（冰上放置）轻轻晃动，充分混匀，直到出现白色絮状物６.12000r,4℃,10min （开水浴）７.吸取上清至1.5ml EP管中重复6、7，量吸取上清的体积8.加1/10体积的ETR Solution ,颠倒混匀，置于冰上10min ,放置过程中每2-3min 颠倒一次。
（加ＥＴＲ后，溶液变的混浊，置于冰上，变得澄清）９.４２℃水浴5min，溶液再次变浑浊．12000r,室温3min１０.转移顶部水样的溶液至2mlEP 管中，加入0.5倍体积的无水乙醇，轻轻颠倒6-7次，混匀，室温1-2min. １１.激活柱子，3M NaOH 100ul,12000r,1min１２.将液体转移至柱子中，700μL一次，12000r,1min１３.加入500μL HB Buffer,12000r,1min１４.DNA wash buffer 700μL,12000r,1min /2次１５.空甩12000r.2min１６.更换1.5ml EP管，加Eudotoxin-Free Elution buffer30-100μL,静置3min１７.12000r,1min。
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转化摇菌提质粒
SANY标准化小组 #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#
一、感受态细胞XL-1转化实验
（1）5ng DNA+100μl感受态细胞XL-1于离心管中,混匀，冰浴30min。
（2）42o C, 45s。
（3）冰浴2min。
（4）涂布于固体LB平板上(含50mg/ml 氨苄青霉素, 37 o C预热)。
（5）放入37 o C恒温孵育箱，待液体吸收完全后，倒置孵育16-18h。
（6）保鲜袋密封后，倒置放于4o C冰箱保存。
二、菌液的培养与质粒的提取
1.每个样本挑取5个细菌，进行摇菌，提取质粒。
（一个细菌一支管）
在50ml离心管里加入5ml液体LB和5μl 50mg/ml氨苄青霉素，用200μl枪头挑取过夜培养LB平板上的单克隆，枪头打入离心管中，置于37o C摇床，250r/min培养16～18h，质粒提取。
（老师，这里要先挑取一个细菌进行摇菌后再分成五支离心管重新摇菌，还是直接挑取5个菌落直接摇菌）
质粒提取(采用天根质粒小量多次提取试剂盒提取，步骤如下)：
（1）吸附柱中加入500μl平衡液BL，13000rpm离心1min。
倒掉收集管中废液，吸附柱放回收集管，备用。
（2）收集5ml菌液，13000rpm/min, 离心10min，收集沉淀。
（3）加入500μl溶液P1(含RNase A), 使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
（4）加入500μl溶液P2, 温和地上下翻转6～8次，使菌体充分裂解。
（5）加入700μl溶液P3, 立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀，此时会出现白色沉淀。
（6） 13000rpm/min离心10min，收集上清分次加入过滤柱中(800μl/次)。
（7） 13000rpm离心2min后将上一步得到的滤液分次加入吸附柱中(800μl)。
（8） 13000rpm离心1min，弃掉滤液。
（9）加入500μl去蛋白液PD, 13000rpm/min离心1min后弃滤液。
（10）加入600μl漂洗液PW, 静置5min, 13000rpm/min离心1min后弃滤液。
（11）重复步骤10。
（12）13000rpm/min离心2min，彻底去除柱子中残留废液。
（13）将DNA吸附柱放入新的离心管，悬空滴加100μl无菌双蒸水，静置5min。
13000rpm/min离心1min，所得到的液体即为高纯度的DNA溶液，置于-20o C保存。
七．定点突变的鉴定
质粒提取后用限制性内切酶酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.1.6亚克隆
对成功突变的突变体和质粒载体进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳，按照胶回收试剂盒步骤回收载体和目的片段，用T4连接酶进行目的片段和表达载体的连接，产物转化细菌感受态细胞，挑取阳性克隆，按照质粒试剂盒说明书提取质粒，用限制性内切酶进行酶切鉴定，送质粒进行测序鉴定。