选修1生物技术实践知识点整理

选修1《生物技术实践》

第一部分微生物的利用

实验1大肠杆菌的培养和分离

一、大肠杆菌

1．大肠杆菌属于革兰氏阴性细菌，为兼性厌氧的肠道杆菌。

2．用途：是基因工程技术中被广泛采用的工具。

二、本实验的内容是将大肠杆菌扩大培养和划线分离。分离后，一个菌体便会形成一个菌落，这是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。

本实验用LB液体培养基（通用的细菌培养基）扩大培养大肠杆菌，培养后用LB固体平面培养基进行划线分离。

三、细菌的培养和分离

1．细菌的培养：

（1）繁殖方式：细菌以分裂的方式繁殖，分裂速度很快，约20min分裂一次。

（2）培养的方法：需要将已有细菌的培养物转移到新的培养基中，一般用接种环来转移带菌的培养物。

2．细菌的分离

分离的方法与特点：

划线分离法：操作简单。（接种环）

涂布分离法：操作复杂，单菌落更易分开。（玻璃刮刀）

四、灭菌操作

1．灭菌操作的原因：获得纯净的培养物的关键是防止外来杂菌的入侵污染。

2．无菌操作的条件：

（1）各种器皿必须是无菌的。（首要条件）

（2）各种培养基必须是无菌的。

“细菌喜荤，霉菌喜素”

细菌培养基要用蛋白胨和酵母提取物来配制，还要加入一定量的氯化钠，以维持一定的渗透压。在中性偏碱的环境中生长（制备培养基时需调节培养基的酸碱度）。

霉菌培养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可。在中性偏酸的环境中生长（制备培养基时需调节培养基的酸碱度）。

如果培养基中有葡萄糖，为防止葡萄糖分解碳化，要用500g/cm2压力（90 ℃以上）灭菌30min.

3．灭菌的方法：是指杀灭病原微生物的方法。

（1）灼烧灭菌

（2）干热灭菌：160-170 ℃下加热1-2h。

（3）高压蒸气灭菌：100kPa、121 ℃(1kg/cm2)下维持15min.

（4）过滤灭菌：G6玻璃砂漏斗过滤（用于有些不能加热灭菌的化合物，如尿素加热会分解）4．消毒的方法：是指杀灭或清除环境中一切微生物（包括芽胞、孢子）的方法

（1）煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min

（2）巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min或 80 ℃下煮15min

（3）化学药剂消毒法：用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源

（4）紫外线消毒

五、大肠杆菌的培养和分离实验

1．实验步骤：

（1）培养基灭菌：将50mlLB液体培养基、50mlLB固体培养基加上封口膜和培养皿用牛皮纸包好进行高压蒸汽灭菌。（封口膜的作用是既通气又不使菌进入）

（2）倒平板：将有培养基的三角瓶和培养皿放到超净台上，打开紫外灯和过滤风

（3）接种：接种环接种，在37℃振荡培养12h

（4）划线分离：在酒精灯火焰上灼烧接种环，接种环只在菌液中蘸菌液一次，然后在固体培养基的平板上连续划线，盖好培养皿，将培养皿倒置，放在37℃恒温培养箱中培养

12-24h，可看到在划线的末端出现不连续的单个菌落。

（5）菌种保存：用接种环取出单菌落，用划线法接种在斜面上，37℃培养24h后，置于4℃冰箱中保存

实验2分离以尿素为氮源的微生物

一、脲和脲酶

1．脲或称尿素，是蛋白质降解的产物。

2．脲酶：有些细菌可以尿素为氮源，这些细菌含有脲酶

（1）可降解尿素的酶

（2）作用原理：细菌合成的脲酶能将尿素分解成NH3，致使pH升高，使酚红指示剂变红。

二、实验设计及步骤

1．实验中的对照设置：

实验组：以全营养LB固体培养基进行培养（蛋白胨，酵母提取物，氯化钠，琼脂糖，水）

对照组：以尿素固体培养基进行培养（葡萄糖，氯化钠，K2HPO4，酚红，琼脂糖，水）

加入通过G6玻璃漏斗过滤（使之无菌）的10ml尿素溶液（内含2g脲）

2．实验步骤：

（1）制备培养基：将已灭菌的LB固体培养基和尿素固体培养基在酒精灯旁分别倒入两个培养皿中，在水平的超净台上摇匀，平放至凝固。

（2）制备细胞悬液：用1g土样配制不同浓度的细胞悬液（加无菌水稀释）。

（3）用涂布分离法分离细菌：将不同浓度的土壤稀释液分别加入到有LB培养基和尿素培养基的培养皿中，再将保存在70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上，待刮刀上火焰

熄灭。在酒精灯火焰旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。

（4）培养：倒置培养皿，在37℃恒温培养箱中培养24-48h

（5）观察：培养基中的菌落数。

实验4果汁中的果胶和果胶酶

一、果胶

1．化学组成：半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯

2．作用：（1）植物细胞壁的主要成分（2）将植物细胞粘合在一起（去掉果胶植物组织变得松散）3．鉴别方法：果胶不溶于酒精

二、果胶酶

1．来源：黑曲霉、苹果青霉等微生物

2．作用：

3．应用：

（1）应用原理：水解果胶，使水果组织的分散性加大。

（2）果汁生产：提高出汁率和澄清度。

三、探究制作果汁的最佳条件

实验流程：

95%的乙醇用于检验是否有果胶

如果有浑浊（或者沉淀），说明果胶还没有被完全水解。

如果澄清，说明果胶被完全水解

实验6 α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测

一、酶

1．功能：是生物体内各种化学反应的催化剂

2．特性：专一性和高效性

3．应用的特点：在水溶液中很不稳定，且不利于工业化使用。

二、固定化酶

1．概念：将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。

2．酶固定化的方法：吸附法、共价偶连法、交联法、包埋法等。将固定化酶装柱，当底物经过该柱时，在酶的作用下转变为产物。

三、α-淀粉酶的固定化

1．固定化原理：利用吸附法将α-淀粉酶固定在石英砂上。一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精，用淀粉指示剂溶液测试，流出物呈红色表明水解产物糊精生成

这里使用的是枯草杆菌的α-淀粉酶，其作用的最适温度为50~75℃；最适PH为~

2．固定化过程：

（1）在烧杯中将5mgα-淀粉酶溶于4ml蒸馏水中（由于酶不纯，可能有些不溶物）。

（2）再加入5g石英砂,不时搅拌

（3）30min后装入1支下端接有气门心并用夹子封住的注射器中(石英砂体积约4ml)

（4）用10倍体积的蒸馏水洗涤此注射器以除去未吸附的游离淀粉酶,流速为1ml/min

3．步骤：

（1）淀粉溶液流经固定化酶柱：将灌注了固定化酶的注射器放在注射器架上,用滴管滴加淀粉溶液,使淀粉溶液以min的流速过柱。

（2）接取流出物：在流出5ml后接收流出液。

（3）流出物的鉴定：加入1~2滴KI-I2溶液,观察颜色.用水稀释1倍后再观察颜色。

（4）洗涤、保存固定化酶柱：用10倍柱体积的蒸馏水洗涤此柱,放置在4℃冰箱中保存。

（5）几天后取出冰箱中该固定化酶柱，再重复上述实验,看是否有相同的结果。（可重复使用）