细胞生物学之笔记--第6章

第六章线粒体mitochondion与细胞的能量转换第一节线粒体的基本特征一、线粒体的形态、数量&结构（一）线粒体的形态、数量与细胞的类型和生理状态有关线状、粒状、杆状etc 直径0.5~1.0μm。

（二）线粒体是由双层单位膜套叠而成的封闭性膜囊结构1.外膜是线粒体外层单位膜outer membrane5~7nm厚，50%脂类、50%蛋白（重量）外膜蛋白多为转运蛋白，形成跨膜水相通道（直径2~3μm），允许分子量10kD以下分子通过，包括小分子多肽（氨基酸平均分子量128D）2.内膜的内表面附着许多颗粒inner membrane4.5nm厚，20%脂类、80%蛋白✧内腔/基质腔（matrix space）由内膜包裹的空间✧外腔/膜间腔（intermembrane space）内、外膜之间的空间✧嵴（cristae）内膜大量向内腔突起性折叠形成✧嵴间腔（intercristae space）嵴与嵴之间的内腔部分✧嵴内空间（intracristae space）由于嵴向内腔突起，造成的外腔向内伸入的部分内膜通透性很小，分子量大于150D，就不能通过内膜有高度的选择通透性，膜上转运蛋白控制内外腔的物质交换内膜内表面附着许多颗粒，数目：104~105个/线粒体，称基粒elementary particle =A TP合酶复合体（A TP synthase complex）3.内外膜相互接近所形成的转位接触点是物质转运到线粒体的临时性结构转位接触点translocation contact site 电镜观察揭示内外膜有些接触点转位接触点分布有蛋白质等物质进出线粒体的通道蛋白和特异性受体，称内膜转位子translocon of the inner membrane, Tim; 和外膜转位子translocon of the outer membrane, Tom4.基质是氧化代谢的场所✧基质matrix 内腔中充满的电子密度较低的可溶性蛋白质和脂肪等成分✧基质中含各种酶：三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸分解、蛋白质合成✧基质中含有双链环状DNA、70S核糖体有1~多个DNA拷贝，有独立遗传物质复制、转录、翻译5.基质的化学本质是ATP合酶基粒，又称A TP合酶复合体，头部直径9nm，柄部长5nm，宽4nm二、线粒体的化学组成三、线粒体的遗传体系（一）线粒体DNA构成了线粒体基因组mtDNA(mitochondrial DNA) 裸露、不与组蛋白结合，基质内一个线粒体平均5~10个DNA分子，编码线粒体的t RNA、rRNA及一些线粒体蛋白质但大多数酶和蛋白质仍由细胞核DNA编码，在细胞质中合成，转送到线粒体中线粒体基因组共16 569 bp，双链环状DNA，一条重链，一条轻链。

只含少量非编码序列两条链编码物不同，共编码37个基因（线粒体中约有1000个基因产物）13个蛋白质37个基因24个其他：2种rRNA分子（12S& 16S 重链）& 22种tRNA分子（14个重链8个轻链）（二）重链和轻链各有一个启动子启动线粒体基因的转录✧线粒体基因组的转录从两个主要启动子处开始：重链启动子heavy- strand promoter, HSP和轻链启动子light-strand promoter, LSP✧线粒体转录因子1(mitochondrial transcription factor 1, mtTFA) 参与线粒体转录调节✧线粒体基因转录类似原核生物，产生一个多顺反子（polycistron）✧线粒体mRNA不含内含子，少有非翻译区✧起始密码AUG/AUA，起始氨基酸甲酰甲硫氨酸(原核) 终止密码UAA✧线粒体DNA基因在线粒体内的核糖体上进行翻译，线粒体编码的RNA、蛋白质不运出线粒体✧线粒体核糖体蛋白质，在细胞质中合成，转入线粒体内✧线粒体的所有tRNA都由mtDNA编码（线粒体的遗传密码和核基因的不完全相同）（三）线粒体DNA的两条链有各自的复制起点✧重链复制起始点origin of heavy-strand replication, OH 控制重链的自我复制，先复制✧轻链复制起始点origin of light-stand replication, OL 控制轻链的自我复制，后复制✧mtDNA的复制需要ＲＮＡ引物作为DNA合成的起始✧线粒体的环状DNA复制过程持续2个小时；其复制周期不受细胞周期影响，可分布在整个细胞周期四、线粒体核编码蛋白质的转运（一）核编码蛋白向线粒体基质中的转运1.输入到线粒体基质的蛋白质N（或名：导肽）富含带正电荷的精氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸(缺少酸性氨基酸)，20～80个氨基酸2.前体蛋白在线粒体外保持非折叠状态线粒体蛋白可溶性前体在核糖体内形成以后，1)新生多肽相关复合物（nascent-associated complex，NAC）少数与之结合。

NAC增加了蛋白转运的准确性2)热休克蛋白70（constitutive heat shock protein 70，hsc70）大多与之结合。

防止前体蛋白形成不可解开的构象，防止已疏松的前体蛋白聚集（aggregation）3)导肽结合因子（presequence-binding factor，PBF）增加hsc70对线粒体蛋白的转运4)线粒体输入刺激因子（mitochondrial import stimulatory factor，MSF）不依赖hsc70，单独发挥ATP酶的作用，为聚集蛋白的解聚提供能量3.分子运动产生的动力协助多肽链穿过线粒体膜布朗棘轮模型Brownian Rachet model（S.M.Simon提出作用机制）：转移多肽在线粒体膜上的蛋白孔道内，做布朗运动摇摆不定，一旦自发进入线粒体腔，立即有线粒体内的mtHsp70结合上去，防止肽链退回细胞质中；随着肽链进一步伸入线粒体腔，更多mtHsp70结合 mtHsp70（被描述为“转运发动机”，有牵拉作用）以一种高能构象结合前导肽，然后松弛为一种低能构象，促使前导肽进入，并迫使后面的肽链解链并进入4.多肽链需要在线粒体基质内重新折叠才形成有活性的蛋白✧肽链进入线粒体基质后，其导肽序列被基质作用蛋白酶matrixprocessing protease, MPP 所切除✧mtHsp70、mtHsp60、mtHsp10 协助肽链重新折叠，形成天然构象（二）核编码蛋白向线粒体其他部位的转运包括转进膜间腔、内膜上、外膜上；除含有MTS（matrix-targeting sequence），还有额外信号序列1.蛋白质向线粒体膜间腔转运膜间腔导入序列intermembrane space-targeting sequence, ISTS 膜间腔蛋白质均有，引导肽链进入膜间腔膜间腔蛋白质N端先进入基质，并被酶切去MTS序列，然后依照ISTS的不同，有两种转运方式：①整个肽链进入基质，结合mtHsp70折叠，并在ISTS引导下，通过内膜上通道，进入膜间腔②ISTS起转移终止序列的作用，肽链C端不能转入内膜，并固定于内膜上，在膜间腔蛋白酶作用下，切除内膜上的ISTS部分，C端落于膜间腔（在此发挥作用）第③种膜间腔蛋白质的转运方式：以直接扩散的方式，从胞质中通过线粒体外膜上的类孔蛋白P70——类似原核生物孔蛋白，进入膜间腔2.蛋白质向线粒体外膜和内膜转运外膜蛋白类孔蛋白P70 研究较多，其MTS后有一段长的疏水序列，起着转移终止序列的作用，使之固定于外膜上内膜上的蛋白质转运基质尚不清楚五、线粒体的起源线粒体可能起源于与古厌氧真核细胞共生的早期细菌。

（共生假说）还有非共生学说。

六、线粒体的分裂&融合（一）线粒体是通过分裂方式实现增殖的自从线粒体DNA发现后，普遍接受线粒体是以分裂方式进行增殖的线粒体的发生分两个阶段(接受细胞核、线粒体遗传系统的调控)：①分裂增殖②新生线粒体的分化线粒体的分裂增殖方式：①出芽分裂②收缩分裂③间壁分裂无论哪种增殖方式，线粒体分裂都不绝对均等，受细胞分裂一定影响（二）mtDNA随机地、不均等地被分配到新的线粒体中同一个线粒体内，mtDNA可能有天然的野生型，还有少量突变型复制分离：分裂时，mtDNA随机分配到新的线粒体中，导致mtDNA 异质性变化①在分裂旺盛的细胞中，野生型与突变型比例发生遗传漂变，向同质性方向发展，只有野生型存在（分裂旺盛的细胞往往有排斥突变mtDNA的趋势）②在分裂不旺盛的细胞中，突变型mtDNA具有复制优势，在胞质中积累越来越多，形成突变型的同质性细胞（三）线粒体融合是有一系列相关蛋白介导的过程线粒体的融合有利于促进线粒体的相互协作，可以使不同的线粒体之间的信息和物质得到相互交换。

七、线粒体的功能1)主要功能：营养物质在线粒体内氧化并与磷酸化耦联生成ATP2)在摄取Ca2+和释放Ca2+起着重要的作用，线粒体和内质网共同调节胞质中Ca2+浓度3)与细胞死亡有关。

有时，线粒体是细胞死亡的启动环节；有时，是其一条通路（access）。

线粒体在能量代谢和自由基代谢过程中产生大量朝氧阴离子，并通过链式反应形成活性氧（reactive oxygen species，ROS），当ROS水平较低时，可促进细胞增生；当ROS水平较高时，使得线粒体内膜非特异性通透性孔道开放，不仅使得跨膜电位崩溃，也是细胞色素c外漏，在启动caspase的级联活化，启动凋亡。

第二节细胞呼吸与能量转换在细胞内线粒体的参与下，利用O 2，分解各种大分子，产生CO 2，并将代谢释放的能量储存于ATP 的过程，称 细胞呼吸，或 生物氧化 /细胞氧化细胞呼吸是细胞内产生能量的主要途径，本质同燃烧一样，终产物都是：CO 2和H 2O ，释放的能量也相等细胞呼吸的特点：①线粒体中进行的 一系列由酶系催化的 氧化还原反应②产生的能量储存于A TP 的高能磷酸键中③整个反应分步进行，能量逐步释放④反应在 恒温（37℃）恒压条件下进行（体内生理条件下）⑤反应需要H 2O 的参与细胞能量的转换分子——A TPATP 是一种 高能磷酸化合物，细胞呼吸释放的能量 储存于A TP 的高能磷酸键中当细胞活动需要能量时，去磷酸化，断裂一个（或两个）高能磷酸键，释放能量去磷酸化A-P~P~P A-P~P + Pi + 能量磷酸化随着细胞内能量的释放、储存，能量转换的 中间携带者，在ATP 与ADP 之间 不断进行互变ATP 是 细胞内 直接供能者，是细胞内 能量获得、转换、储存、利用的 联系纽带产生ATP 大概分为糖酵解、三羧酸循环、氧化磷酸化三大过程. 图6-10一、葡萄糖在细胞质中的糖酵解1个葡萄糖分子，经过十余步反应，生成2分子丙酮酸；形成2分子NADH+H+，净生成2分子ATP如果从糖原开始糖酵解，不需要消耗1分子ATP，进行葡萄糖的磷酸化，则总反应净生成3分子ATP底物水平磷酸化（substrate-level phosphorylation）由高能底物水解放能，直接将高能磷酸键从底物转移到ADP上，使ADP磷酸化生成ATP的作用丙酮酸进入线粒体，推断是靠自身的脂溶性，简单扩散入线粒体丙酮酸在线粒体内，在丙酮酸脱氢酶作用下，生成乙酰辅酶ANADH+H+ 进入线粒体的方式：①苹果酸-天冬氨酸穿梭基质，借助苹果酸脱氢酶、谷氨酸经谷-草转氨酶的作用，以草酰乙酸、苹果酸等作载体……（肝脏、肾脏、心肌细胞etc）②α-磷酸甘油穿梭系统（脑、昆虫的飞翔肌）3分子H2O1分子GTP 可转换为1分子ＡＴＰ2分子CO24对H ３对以NDH+为受体，1对以FAD为受体苹果酸-天冬氨酸穿梭基质葡萄糖32个ATP苹果酸-天冬氨酸穿梭基质糖原33个ATPα-磷酸甘油穿梭系统30个ATP脂肪酸、氨基酸从胞质进入线粒体，转化为乙酰CoA 或三羧酸循环的其他中间产物，并进行完全氧化、提供能量(完全氧化唯一途径)这些中间产物可用来合成氨基酸、卟啉、嘧啶核苷酸等三、氧化磷酸化耦联&ATP形成线粒体内，NADH和FADH2把电子转移到氧分子，就是氧化磷酸化，是放能的主要环节，绝大多数释放的能量用于生成A TP，少部分以热能形式释放（一）呼吸链和ATP合酶复合体是氧化磷酸化的结构基础1.呼吸链是一系列能够可逆地接受H+和e-的酶体系✧呼吸链（respiratory chain）=电子传递呼吸链（electron transport respiratory chain）=是一系列能够可逆地接受和释放H+和e-的在线粒体内膜上有序排列成相互关联的链状酶体系✧1分子葡萄糖经无氧氧化、丙酮酸脱氢、三羧酸循环，产生：6分子CO2、12对H；这些H必须完全氧化成水，整个有氧氧化过程才结束✧H先离解为H+和e-，e- 经过线粒体内膜酶系的逐级传递，最终传递给O2，成为2O2-，+，生成2个H2O醌类UQ(ubiquinone, 泛醌)=辅酶Q(CoQ) 脂溶性分子，UQ/UQH2定位脂双层中，能迅速进行侧向扩散细胞色素Cyt C(细胞色素C) 可溶性蛋白质在膜间腔中，沿内膜移动铁硫蛋白2.ATP合成酶复合体（=F0F1ATP合成酶）催化ATP的合成1)头部具有酶活性蘑菇样蛋白质复合体，在细菌与线粒体中高度保守，三部分组成：球形F1头部，直径9nm，由5种亚基组成：α3β3δγε，自然状态下（结合态）催化A TP 合成2)柄部连接头部和基片对寡霉素敏感的蛋白，抑制A TP的形成3)基片是质子（H+）流向F1的膜通道F0基片(basal section)，包埋于内膜中，由3种亚基组成：ab2c10–14F0基部有一通道，允许质子(即H+)从膜间腔经F1头部进入基质（二）氧化过程伴随着磷酸化的耦联氧化磷酸化耦联=氧化磷酸化作用=NADH和FADH2是两种还原性电子载体，所携带的电子经内膜上的呼吸链逐级定向传递给O2，此过程中释放出的能量被F0 F1ATP酶复合体用来催化ADP磷酸化成ATP呼吸链中有3个主要的质子由基质转运到膜间腔能量释放部位：NADH→FMN、（细胞色素）Cyt b→Cyt c、Cyt a→O21分子NADH+H+经过电子传递，释放的能量可以形成2.5分子ATP1分子FADH2 经过电子传递，释放的能量可以形成1.5分子A TP1分子葡萄糖完全氧化，共可以形成32分子ATP底物磷酸化生成4分子ATP=糖酵解2ATP+TCA循环2A TP氧化磷酸化生成28分子ATP→12对H=10对以NAD+为载体+2对以FAD为载体（三）电子传递时H+穿膜形成电化学梯度①NADH和FADH2提供一对电子，经电子传递链，最后被O2接受②电子传递链同时起到H+泵作用，在传递电子过程中，将H+从线粒体基质转移到膜间腔③线粒体内膜对H+和OH-不能通透，造成内膜两侧的H+浓度差④膜间腔里的H+顺浓度梯度，借助这个势能通过A TP合酶复合体的F0质子通道，驱动F0 F1ATP 酶复合体合成ATP（四）电化学梯度所包含的能量转换成A TP的化学能F0 F1ATP合酶如何利用H+的电化学梯度，催化ADP与Pi 形成ATP？1979年Paul D. Boyer 提出结合变构机制binding-change mechanism：当H+穿过F1因子活性部位，F1颗粒构象变化，导致底物ADP与Pi 紧密结合，产物ATP释放（Boyer 因此获得1997年诺贝尔化学奖）根据结合变构机制，ATP合成步骤如下：①质子(H+)跨膜释放的能量，用来改变F1头部活性位点对ATP结合力②每个活性位点按3个状态依次变构，每种构象跟底物亲和力不同③A TP的合成被旋转催化，γ亚基相对于其它亚基旋转线粒体本身依靠质子动力proton-motive force 驱动质子动力驱动ADP与Pi 从胞质进入内质网基质，而换出ATP与H+此外，质子动力也驱动Ca2+进入线粒体基质、介导线粒体融合、协助核编码蛋白跨线粒体膜的运输第三节线粒体与疾病一、疾病过程中的线粒体变化✧中毒或病毒入侵→线粒体肿胀、破裂✧原发性肝癌→线粒体嵴的数目下降，最终成为液泡状✧缺血性损伤→线粒体凝聚、肿胀✧坏血病病变组织→几个线粒体融合成球✧某些细胞病变→线粒体内积累大量蛋白质、脂肪、或基粒✧氰化物、CO等可阻断线粒体的电子传递呼吸链，造成氧化中断、细胞死亡✧随年龄增长，线粒体氧化磷酸化能力下降，可作为病变指标二、mtDNA突变&疾病突变的mtDNA 当进行异常复制时，机体的免疫系统不能对此识别、阻止，细胞靠加快分裂来稀释突变mtDNA带来的细胞损害但是这种策略终将无效，导致疾病——线粒体疾病mitochondrial disorder，表现为线粒体结构和功能缺陷线粒体疾病主要影响神经、肌肉系统，称线粒体脑肌病分子生物技术发展，使得明确诊断线粒体疾病成为可能，然而治疗尚待突破三、线粒体融合&分裂异常相关的疾病四、线粒体疾病的治疗目前的治疗措施：补充疗法(补充呼吸链所需辅酶，如辅酶Q)、选择疗法(用促进细胞排斥突变线粒体的药物，以增加正常线粒体比例，比如用氯霉素对抗ATP合酶)、基因疗法(将正常线粒体基因转入患者体内，以替代mtDNA发挥作用：胞质mtDNA表达法、线粒体转染法、异质性细胞正选择法)复习题1.线粒体外膜蛋白所占比例，多为什么蛋白，多大的分子可以通过？2.线粒体内膜通透性如何？多大的分子可以通过？3.线粒体内外膜有些接触点，叫什么，那里分布了什么？4.线粒体DNA形状如何？每个线粒体有多少DNA拷贝？是否结合组蛋白？5.线粒体内膜上有何独特的膜脂？6.线粒体内膜、外膜、基质、膜间腔的标志酶各是什么？7.mtDNA共编码多少个基因？其中多少个是编码蛋白质的？8.大多线粒体蛋白由什么编码，在哪里的核糖体上合成？9.mtDNA跟原核生物DNA有哪些相似处？10.mtDNA的复制时机，跟核DNA有何不同？11.核基因编码的线粒体蛋白，能被转运进线粒体，因为含有什么序列？此序列有何特点？12.核基因编码的线粒体蛋白，在转入线粒体时，mtHsp家族是如何起作用的？13.核基因编码的线粒体蛋白，是怎样向线粒体膜间腔、外膜转运的？14.线粒体怎样起源的？如何增殖？15.名词解释：细胞呼吸、呼吸链、A TP合酶复合体16.A TP分子在能量转换中的作用是什么？17.从葡萄糖到ATP形成，经过哪三个步骤？18.葡萄糖在细胞质中的糖酵解总反应式是？19.糖酵解产生的NADH，可以通过哪两个穿梭机制进入线粒体？20.丙酮酸进入线粒体后，在丙酮酸脱氢酶作用下，生成什么进入三羧酸循环？21.线粒体基质中，三羧酸循环的第一个也是最终反应物是什么酸？22.一次完整三羧酸循环，1分子乙酰CoA 氧化生成什么？23.什么是各种有机物最后氧化、相互转换的枢纽？24.1分子葡萄糖完全氧化，生成多少分子A TP？25.1分子NADH或FADH2 经电子传递，各生成多少A TP？26.化学渗透假说内容是什么？27.结合变构机制是如何解释质子电化学势能转化为A TP化学能的？28.线粒体靠什么驱动ADP与Pi从细胞质进入线粒体内的？29.mtDNA突变主要影响什么系统？。