哺乳动物精子获能及其鉴定

哺乳动物精子获能以及鉴定

摘要：精子获能是精卵结合的前提，是哺乳动物受精过程中的关键环节。精子获能

的发现促使体外授精研究取得了突破性进展，为人类研究受精机理奠定了基础。本

文从体内、体外两方面论述了哺乳动物精子获能的培养方法，并且对精子获能的

评价方法进行了总结。

关键词：精子获能；培养；评价

人及哺乳动物的精子在离开生殖道时，还不能立即与卵子受精，它必须经历一系列生理生化及形态的变化才能获得受精能力，这种生理现象称之为获能（capacitation）。精子获能是精子受精前必须经历的一个生理阶段。自然情况下，精子获能是在雌性生殖道内进行，自宫颈开始，经历子宫和输卵管，最后完成于输卵管壶腹部。研究表明，精子获能不仅可以在雌性动物生殖道内进行，也可以在体外适当的培养条件下进行。

1 精子获能的方法

精子获能的方法分为体内获能和体外获能两种。

1.1 体内获能

早期的获能研究，采用体内获能的方法，即从交配母畜的子宫内取出精子用于受精，以受精率为指标，分析获能的部位、时程及其机制。进一步研究发现，获能过程没有种的特异性，即精子不仅在同种生殖道内，而且可以在异种动物生殖道内或液体内进行获能。将牛精子放入家兔子宫和猪输卵管内培养同样能使精子获能。精子在成熟过程中，表面被覆了蛋白质类和多胺类，这些物质的存在对获能具有抑制作用。在体内获能期间，精子在雌性生殖道内运动时，子宫颈黏液输卵管液和卵泡液，以及输卵管上皮细胞等，都有助于清除精子表面的抑制因子，促进获能的发生由于体内获能的研究，经常受到许多条件的限制，在机体生殖道内培养需时间，其环境也受卵巢激素影响，不稳定因素多，且雌性生殖道内，特别是输卵管内回收到的精子数量太少，测定获能精子化学成分的改变更加困难；并且，精子在体内总是与雌性生殖道分泌物接触，而雌性生殖道中存在着影响获

能的因子，对于复杂的体内环境人们又很难控制，因而给研究精子获能带来极大的困难为此，体外获能的研究方法应运而生。

1.2 体外获能

早期研究精子体外获能通常使用各种动物的体液（如输卵管液滤泡液和血清等），而这些体液的成分相对复杂，很难确定何种成分诱发或支持精子获能。自从Toyoda等最先报道了采用一种特定的化学培养基获得体外受精成功以来，分析体外精子获能已成为比较容易的事情以Tyrode KRB HamF10BSA BWW BO等培养液进行哺乳动物精子获能培养均见报道。目前，常用的为 BO液和改良的 Tyrdoe 液（TALP）两大类，许多哺乳动物，如鼠牛猴马等，其精子体外获能的研究越来越多。近年来的研究表明，体外获能发展起来的实验手段几乎可以达到与体内获能相同的效果，这就使得体外获能的研究可以揭示体内获能的本质精子体外获能技术可以较好地控制实验条件，并可逐个分析获能的相关因子，极大地促进了精子获能的研究。

精子体外获能总体包括两个步骤：一是精液的处理，目的是减少或去除精浆内前列腺素免疫活性细胞细菌和碎片，减少精液的黏稠度，以促进精子获能；二是使用某些特定成分诱导精子获能和顶体反应目前，诱导精子体外获能的方法主要有上浮法、沉淀加上游法和不连续密度梯度法。

经上浮法处理可获得活力较强的精子，但精子回收率较低，目前该方法已成为牛精子（尤其是冻精）洗涤与体外获能的主要方法；精子沉淀加上游法适用于精子活力尚可或含有大量白细胞及碎片的精液，此方法有利于分离活动精子与死精子，且回收率较高；不连续密度梯度法是近年用于分离精子的良好方法，密度梯度离心法原理是形态正常精子的密度要高于异常的精子，经平衡离心后得到高受精力的正常精子，该法适用于精子数量正常而活力较差的精液若与精子上浮技术相结合，不连续密度梯度法可获得更高质量的精子。精子的质量不同，获能所使用的处理方法也不同，要根据精子的来源及质量选择相应的处理方法江峰根据所使用人精液的质量，将其处理方法分为7 种：（l）少精子症，离心后再重悬于较小体积营养液中；（2）弱精子症，离心 - 上游技术结合添加咖啡因或血管舒缓素；（3）畸形精子，牛血清白蛋白（BSA ）人血清白蛋白或牛宫颈黏液滤过 Percoll 密度梯度离心；（4）液化不全，玻璃纤维过滤；（5）黏度过高，淀

粉酶处理密度梯度离心等；（6）杂质过多，上游法和 Percoll 密度梯度离心；（7）逆行射精，洗涤加上游处理。

2 获能评价的方法

精子获能是一系列的生理生化反应过程，其步骤分为：（1）超激活运动（hyperactivated motility，HAM ）：精子鞭毛运动的频率及类型发生改变；（2）获能：精子膜结构及特征的精细改变；（3）顶体反应（Arcosomal reaction， AR）：标志着精子获能已经完成根据获能精子在运动形态及代谢等方面的变化特征，创立了多种精子获能的评价方法目前，常用的精子获能评价方法为精子超激活运动顶体反应和精子穿卵试验（sperm penetration test， SPA ）此外还有去能因子鉴定法测定精子呼吸能等方法。

2.1 超激活运动

精子一旦获能，其运动类型即发生显著改变，精子头部侧摆幅度和频率明显增加，尾部振幅加大，频率加快，呈现一种特殊的超激活运动或鞭打样运动。它是精子为适应受精而形成的一种特殊的运动类型，所反映的是精子运动能力和方式的改变其特点是头部运行轨迹呈不规律的 8 字形，并显著地偏离直线精子的超激活运动一般存在两种运动类型：急剧地前向运动（或穿梭运动）和鞭打样运动。Yanagimachi 于 1970 年首先在仓鼠精子获能时观察到这种现象。 Wang等报道，人精子超激活运动的发生率与体外受精率呈高度相关性，并且对于精子穿越输卵管峡部，克服输卵管上皮细胞的阻力，最后穿过卵丘细胞及其细胞外基质和透明带起着重要的作用。

目前，观察精子超激活运动的应用技术有：显微录像技术、连续分步曝光技术和计算机辅助精子分析（CASA ）技术等。CASA分析系统在临床研究时备受青睐，它可达到客观准确地量化精子运动情况，通过对精子头部运动轨迹摆动图形的分析，可获得精子运动的多项参数，使人们对精子运动有更深层次的了解。2.2 顶体反应

顶体反应是精子在获能过程中的生理变化和形态学变化，是哺乳动物的精子具备受精能力的必要条件早期的研究者认为，顶体反应是由精子质膜和顶体外膜相互融合，形成囊泡化，使顶体内含物逸出顶体陈大元等认为质膜并不参与顶体囊泡化，而是双层顶体外膜多位点自我融合而成。虽然顶体反应是获能的终