哺乳动物精子获能及其鉴定
牛羊精子体外获能技术
获能过程 中发生 了一系列 的过氧化 过程 ， 产生 了过量的氧 自由基是导致体 外受 精率低下 的原 因之 一。本文主要 介绍 了体外受精用精子的筛选及抗氧化方法 、 影响体外获能 的因素等 。 关键词 牛羊 ； 精子 ； 获能技术 ； 抗氧化剂
经 过多 年 的研 究 ，Fra bibliotek精 子 体外 获 能 已取 得 了很 大
去除精清 、 死精 等 ， 为体外获 能创造类 似体 内的获 在 获能 液 中添 加 抗 氧化 剂 ，如 褪 黑 素 、 Ｂ一巯 基 乙
能 环境 。
醇、 半胱氨酸等 ， 来清除体外受精 过程 中产生的过
１ ） 上 浮 筛 选精 子 法 。将 精 液加 入 获 能 液底 部 ， 氧化 物 。 然后静 置 在培 养箱 ３ ０～６ ０ ｍｉ ｎ 。目的是 活力 高 的精
子 会 上 游 到上 层 ，吸 出上层 液 后进 行 离 心 筛选 ， 获
３ 抗 氧 化 剂 种 类
得高活力精子。在此操作过程中要避免室内的操作 氧 自由基 （ Ｒ Ｏ Ｓ ） 产生与消除的平衡是体外受精 温度过低或过高 ， 尽 量 避 免 日光 、 室 内灭 菌 过程 中 的重 要影 响 因素 。精 子 与卵子 体 外受 精 时会受 到氧
佟桂芝 ， 女， １ ９ ６ ７年生 ， 研究员 ， 研究方 向： 反刍动物饲养及繁殖 。
殖与饲料 ２ ０ １ ７年第 ６ 期
殖生产 ． ３ ３．
蝾螺生物学特性及其浅海筏式笼养技术
林 星 福 建省 莆 田市生 物 工程 研 究所 ， 福 建莆 田 ３ ５ １ １ ０ ０
摘要 蝾螺是近年来福建省沿海新开发的一种浅海中大型经济螺类 。简要 介绍 了蝾螺生物学特性 和人工繁
精子获能的分子机制及研究进展
文章 编号 ：０ ５ ２ ３ （０ ８Ｏ — ０ １ Ｏ １０ — ７ ９２ ０ ）２ ０ Ｏ 一 ３
哺乳 动 物 的精子 在 刚 射 入 雌性 生 殖 道 时 ， 从 附 或
许多试验证实 ， 、 、 、 鼠及猫等物种的精子 人 牛 猪 小
睾取 出后 ， 不 具 备 受 精 能力 ， 须 在 雌 性 生 殖 道 内 获 能 与 Ｐ Ｐ相 关 。 并 必 Ｔ 在获 能精 子 中 ， Ｔ Ｐ Ｐ主要 发生 在精 子
制 进行 研 究 ， 得 了～定 的 突破 。 取 １ Ｃ 和 Ｈ ａ Ｃｏ３在精 子 获 能 中的 作 用机 制 ＿
如果培养液组分 中缺乏上述任何一种成分 ，都将阻碍 Ｐ Ｐ和获 能 的发 生 。所 以 附睾 头 部精 子 即使 在 普 通获 Ｔ
能培 养 的条件 下 也不 表 现ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ出 Ｐ Ｐ的改 变 ，说 明这 时 的 Ｔ
维普资讯
Ｓ ＨＥＮＧＺＨＩＳ ＨＥＮＧＬ Ｉ
圈 生 理 殖
中 图分类 号 ：８ ４ ￥ １
精 子获 能 的分 子 机 制 及 研 究进 展
单世梁 ， 金
（ 延边大学农学院 ， 吉林
一
龙井 １３ ０ ） ３ ４ ０
文 献标 识码 ： Ｂ
增加 到 ２ ０ ｍ ｌ ，并 且 之后 不再 有 明显 的增 加 。从 信 号 途 径 调 节 ， 白激 酶 ＡＰ Ａ 对 精 子 Ｐ Ｐ的作 用 ５ ｏＬ ／ 蛋 （Ｋ ） Ｔ
ｃ ２ 精子头部质膜 表面 的分 布来看 ，头部质 膜上 Ｃ ２ 主 要 是 通 过 对 酪 氨 酸 激 酶 或 磷 酸 化 酶 的直 接 或 间 接 ａ在 ＋ ａ
蛋 白酪氨酸磷 酸化（ Ｉ ）。对 Ｃ２作用 的不 同认 识 ， Ｐｐｔ ３ １ ａ 原 腺 苷 酸 环 化 酶 合 成 ｃ ＭＰ Ａ ；对 于 ｃ ２ 钙 调 素 来 说 ， ａ＋ ／ 一 因可 能在于顶 体反应 中 Ｃ２作 用 的不 同 ， ａ 以及研究 Ｃ２ 方 面通 过 腺 苷 酸 环 化 酶 增 加 ｃ Ｐ的 合 成 ， ａ＋ ＡＭ 另一 方 面 作用 和相关 事件 的复杂性 。 １ Ｈ Ｏ一 精子 获 能 中 的作用 机 制 ． ２ Ｃ 。在
哺乳动物精子发生与运动能力的研究
哺乳动物精子发生与运动能力的研究众所周知，精子是哺乳动物生殖过程中至关重要的一部分。
精子的发生和运动能力直接影响了生殖的效率和质量。
因此，对于哺乳动物精子的发生和运动能力进行研究具有重要意义。
一、精子的发生哺乳动物精子的发生是通过睾丸中的精原细胞分化而来的。
精原细胞在不同发育阶段会经历几轮有丝分裂和一次减数分裂，形成四个细胞体。
其中有一个具有发育潜能的原精子细胞，它会经过一系列内部改变并分裂为成熟的精子。
这个过程被称为精子发生。
精子发生的过程是一个高度有序而又复杂的过程。
具体的，我们可以将精子发生的过程分为三个阶段:1.发育前期在睾丸中，每个精原细胞都会分裂成一组精原细胞和一组细胞，这个过程叫做有丝分裂。
在接下来的发育前期，精原细胞会持续经历一系列内部改变，直到分裂成成熟的精子。
2.成熟期在成熟期，精子的核被紧紧压缩成一个小球，这个小球叫做精子头。
精子头中含有一个 DNA 分子，这个 DNA 分子携带了父亲的遗传信息。
精子头的外面有一层叫做顶体的附属结构。
3.精液分泌期精子在进入前列腺之前并不具备精液成分，只有在精液分泌期才开始分泌精液成分。
精液成分的功能是提供精子的营养和移动，有助于精子更快地移动到输精管。
二、精子的运动能力精子的运动能力是指精子在生殖系统中的运动和前进能力。
这个过程需要精子的鞭毛有自我运动能力和流体的支持，也就是说，它们能够在精液中向前移动。
精子的移动能力对于受精过程至关重要。
正常的精子能够自由移动、穿过阻力，寻找和认识卵子。
当精子发生功能障碍或缺乏活力时，它们的运动能力就会受到影响，从而影响受精过程。
近年来，对于精子运动能力的研究越来越深入。
研究人员发现，精子的运动能力可能受到环境和饮食的影响。
比如，高温环境和高脂肪饮食会对精子的形态和运动能力造成负面影响。
此外，最近一些研究表明，压力和睡眠不足也可能会对精子的运动能力造成潜在影响。
因此，良好的休息和减轻压力的方法能够通过提高精子的运动能力来提高生育率。
哺乳类动物精子的获能和顶体反应
哺乳类动物精子的获能和顶体反应
闫文龙;李扬
【期刊名称】《畜牧与饲料科学》
【年(卷),期】2001(022)002
【摘要】介绍了在生殖过程中的2个重要的生理变化--获能和顶体反应,并综述了最近几年来在生殖生物学领域关于获能与顶体反应机制方面的最新成果.结果显示,cAMP、Ca2+、咖啡因等因素对精子获能有促进作用,ZP3、Ca2+、cAMP、肝素等因素对顶体反应有促进作用.所有研究成果表明,精子的荻能和顶体反应与精子膜的生理变化有着密切关系.
【总页数】3页(P20-22)
【作者】闫文龙;李扬
【作者单位】内蒙古大学实验动物研究中心生殖生物学及生物技术国家教育部重点实验室,内蒙古,呼和浩特,010021;内蒙古大学实验动物研究中心生殖生物学及生物技术国家教育部重点实验室,内蒙古,呼和浩特,010021
【正文语种】中文
【中图分类】S8
【相关文献】
1.糖原合成酶激酶3在精子成熟、获能和顶体反应中的作用 [J], 屈夏;王昊;周家豪;赵紫薇
2.人和哺乳类精子的获能与顶体反应及其相关因子 [J], 王云美;贲昆龙
3.钙离子在精子获能和顶体反应中的作用 [J], 宫璀璀;刘影;韩玉春
4.哺乳动物精子获能前后的理化变化及获能机制研究进展 [J], 贺亚南;朱化彬;陈晓丽;郝海生;秦彤;赵学明;路永强;王栋
5.荧光染色法分析17β-雌二醇对获能人精子细胞顶体反应及细胞外Ca^(2+)和蛋白激酶C抑制剂的影响 [J], 王嵘;何彦芳;郑洁
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
哺乳动物的精子获能及其鉴定
配母畜的子宫 内取 出精子用于受精 ，以受精率为指 Ｂ Ａ、ＷＷ、Ｏ等 培养 液 进 行 哺乳 动物 精 子 获 能培 Ｓ Ｂ Ｂ
标， 分析 获能 的部 位 、 时程及其 机制［ 进一 步研究 发 养 均见 报道 。 目前 ， ３ １ 。 常用 的为 Ｂ Ｏ液 和改 良的 Ｔｒｏ ｙｄｅ 现 ， 能过程 没有 种 的特 异性 ， 获 即精 子不 仅在 同种 生 液 （Ａ Ｐ 两 大 类 。许 多 哺 乳 动物 ， 鼠 、 、 、 ＴＬ） 如 牛 猴 马 殖 道 内 ，而且 可 以在 异种 动物 生殖 道 内或 液体 内进 等 ， 其精 子体外 获能 的研 究越 来越 多。近年来 的研究
培养 基获得 体外 受精 成功 以来 ，分 析体外 精 子获 能
精子 获能 的方法分 为体 内获能和体外 获能两种 。 能 。 自从 Ｔｙｄ 等 最先报 道 了采用 一种特 定 的化学 ｏｏａ １ 体 内获能 ． １ 早 期 的获能研 究 ， 用体 内获 能 的方 法 ， 采 即从 交 已成 为 比较容 易 的事 情【 ５ ＿ Ｔｒｄ 、 Ｒ Ｈ ｍＦＯ 。以 ｙｏｅＫ Ｂ、 ａ ｌ 、
经 上浮 法处理 可获 得活 力较 强 的精子 ，但 精子
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
黑龙江动物 繁殖
第 １ ８卷
第 ２期
２１ ０ ０年
回收率较低 ，目前该方法已成为牛精子 （ 尤其是冻 剧 地 前 向运 动 （ 穿 梭 运 动 ）和 鞭 打 样 运 动 ［ 或 ３ １ 。 精） 洗涤与体外获能的主要方法 ； 精子沉淀加上游法 Ｙ ｎｇ ａｈ 于 １７ 年首先在仓 鼠精子获能时观察 ａａ ｃｉ ９０ ￣ ｍ
外授精研 究取得 了突破 性进展 ， 为人 类研 究受精机 理 奠定 了基础 。本 文从体 内、 体外 两方 面论述 了
精子的获能情况了解
发现的，后来被Austin 称为精子获能。
这一现象中精子发生很多生理生化改变，包括一些精子内部和表面的一些变化，如：精浆蛋白的移除、糖蛋白被吸收到精子的表面和精子质膜的改变。
一、体内获能
所有被研究过的哺乳动物的精子必须在雌性动物生殖道内停留一段时间才能获能。精子的获能是通过一系列的膜性能的改变和精子头部和尾部多种酶激活从而激活细胞信号通路的结果。
精子体内获能的最初改变包括：（1）精浆蛋白的移除，糖蛋白被吸收到精子的表面；（2）经过雌性动物生殖道时精子表面分子的改变。精子获能主要是精子质膜蛋白发生多种分子变化和甾醇类物质（主要是胆固醇）的变化改变了精子质膜的性质。胆固醇的流出改变了膜的通透性和流动性导致了离子的流入，从而激活了细胞内第二信使。
白蛋白是雌性生殖道内分泌的主要蛋白质，同时也是体内和体外获能的关键物质。这种蛋白质被认为是通过促进甾醇类（主要是胆固醇）从精子质膜流出从而启动精子获能。甾醇类物质的流出导致了膜性质的改变，增加了膜的通透性和流动性，造成了钙离子和碳酸氢根负离子的流入，同时激活了细胞内的第二信使。
总之，精子获能时质膜经历了一些生理变化并重新定位。
总之，在获能的过程中，这些改变引起了精子蛋白激酶的激活，蛋白酪氨酸磷酸化从而激活精子。
二、体外获能
哺乳动物的精子也能在体外通过在某种包含能量物质，物质中获能。只需放在含有牛血清蛋白、能量物质和电解质的混合液中即能获能。
疑难问题：以前在讲述胚胎工程中精子的获能，一直认为是获得受精的生理状态。对于具体的机理含糊不清，不知所云。今天看了一篇文章《精子获能机理的研究》学习了其中的机理。
射出的精子当经过雌性动物生殖道时必须经历生理变化，这样才能与卵子结合。精子这一系列的生物和功能的改变就叫做精子获能。
驯鹿的人工授精及分子鉴定
摘要摘要我国驯鹿种群是３００年前，随鄂温克人为躲避战乱而迁移到此。
这一驯鹿种群在大兴安岭当地的生态环境中，经过数百年的封闭、隔离饲养，形成了其特有的生活习性，也是栖息在最南部少有的驯鹿种群。
我国一直未开展有关驯鹿人工饲养的科学研究工作。
目前，鄂温克猎民饲养驯鹿仍沿用多年来所形成的固有的传统模式，采用半野生饲养方式，对驯鹿进行租放管理。
把驯鹿散放在暂住点的周围，无人看管，自由采食，不进行补饲，不为其筹备饲料，不论天气多么恶劣，驯鹿仍依赖自然采食而维持其生存。
驯鹿的繁殖是采用自然交配，种群处于自然淘汰状态，近交衰退严重。
这使驯鹿的养殖业的发展受到了极大的限制。
驯鹿人工授精技术的应用，可以极大地提高种鹿的质量，使良种基因得到最大限度地传播，种鹿利用率高：避免疾病传播：避免种公鹿争斗而造成损失。
驯鹿是唯一一种雌雄都长茸的鹿。
驯鹿在传统中药中，一直被作为伪品处理。
现今常用的鉴定驯鹿雌雄鹿茸方法有性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定等，在分子水平上的鉴定一直没有人研究。
驯鹿雌雄鹿茸分子鉴定的研究为茸鹿伪品鉴别试剂盒提供了进一步的完善。
我国驯鹿一直是闭锁繁育，种群退化明显。
驯鹿遗传多样性的研究．为我国驯鹿的育种工作提供了分子基础，为以后的分子育种工作提供了可能，也为我们研究群体遗传和遗传分化、系统发育提供了基础资料。
在本次研究中主要分为三个部分。
第一，驯鹿的人工授精。
通过对１１头母驯鹿人工授精的初步研究，结果同期发情和人工授精的结果都很理想，同期发情率和受精率均为１００％。
第二，驯鹿的分子生物学鉴定。
本次试验采用分子生物学鉴定的方法，对雌、雄驯鹿茸的ＳＲＹ基因进行扩增，从扩增的图像可以看到，我们采用的引物能够准确的对雌、雄驯鹿茸进行区分。
应用ＤＮＡＭＡＮ４．０对驯鹿、梅花鹿、马鹿进行聚类分析，结果梅花鹿与马鹿同源性为Ｏ．９９，梅花鹿、马鹿与驯鹿同源性为０．３７。
第三，驯鹿的遗传多样性研究。
本次试验采用２４个引物进行ＲＡＰＤ—ＰＣＲ扩增，在其中筛选出１４个扩增条带清晰引物。
精子的获能整理
精子的获能整理整理者：苗振学号1510736PART1研究的历史：⑴张明觉发现：精子需要在雌性生殖道中停留一段时间才能与卵子受精。
⑵后来，许多科学家都证明精子获能是哺乳类动物精子都必须经历的一个生理成熟过程。
⑶早期的获能研究仅限于体内实验，即自然交配或人工受精(即从交配母畜的子宫内取出精子用于受精，以受精率为指标，分析获能的部位、时程及其机制)。
⑷但体内手段常受到某些条件的限制。
为此，亟待发展另外一种研究获能的方法——体外获能。
⑸精子体外获能技术可以较好地控制实验条件，并可逐个分析获能的相关因子，极大地促进了精子获能的研究。
因此半个世纪以来，已建立了较为理想的获能技术及评价方法，获能机制研究也取得了一定进展。
⑹体外获能的研究，为人工授精提供了理论的依据，极大的方便了优良种畜的繁殖。
PART2 体内的获能：⑴经过附睾成熟，精子表面被覆了蛋白和多胺类等对获能有抑制作用的去能因子。
（获能精子一旦与精浆和附睾液接触，可去获能，表明精浆和附睾液中都存在去能因子。
）⑵获能过程是子宫液和输卵管液之间出现的一种协同作用, 自然情况下，精子获能是在雌性生殖道内进行，自宫颈开始，经历子宫和输卵管，最后完成于输卵管壶腹部。
⑶精子获能是一系列的生理生化反应过程，其步骤大致可区分为：①激活精子鞭毛运动的频率及其类型发生改变【有的作者称作超激活运动】（运动活跃，尾部振幅大而有力，获能后精子由直线前进变为激烈的曲线运动，即超活化。
其特征为头部侧向曲线运动，鞭打幅度加宽和沿星状自旋轨道运动。
）；②获能精子膜结构及其特征的精细改变，以促进顶体外膜和质膜之间的融合；③顶体反应：研究者认为，顶体反应是由精子质膜和顶体外膜相互融合，形成囊泡化，使顶体内含物逸出顶体。
陈大元等认为质膜并不参与顶体囊泡化，而是双层顶体外膜多位点自我融合而成。
顶体反应表示精子获能已经完成。
【不过也有作者认为顶体反应并不属于精子的获能，他认为精子获能与顶体反应是精子完成受精必须经历的两个重要阶段，多方比较发现这个争论颇多。
浅谈哺乳动物体外受精技术的研究进展
浅谈哺乳动物体外受精技术的研究进展【摘要】哺乳动物体外受精是哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。
长期以来，国内外学者对哺乳动物体外受精技术做了大量研究，取得了突破性进展。
本文分别对哺乳动物体外受精技术的研究历史、现状及方法进行探讨，以期通过本文的阐述对该技术发展进行总结。
【关键词】哺乳动物；体外受精；卵母细胞；精子获能1.哺乳动物体外受精技术研究历史和现状哺乳动物体外受精技术的研究在世界科学史上已有100余年的历史了。
德国科学家Scnenk在1878年就开始对家兔和豚鼠进行研究实验，在实验中他对哺乳动物受精进行了大胆的研究，开始了哺乳动物体外受精的探索。
但在此期间哺乳动物的体外受精研究并没有长足的进步，该技术进入科研的新纪元是在1951年美籍华人张明觉和澳大利亚人Austin发现了哺乳动物的精子获能现象以后。
1959年，张明觉和Austin以家兔为实验材料，在受体外进行受精，接着把受精卵移植到母兔体内，最后母兔产出健康正常的兔仔，而且产出的兔仔发育正常。
张明觉进行哺乳动物体外受精研究的成功，这只兔仔成为世界上第一个试管哺乳动物。
20世纪60年代初至8O年代中期，界内科研工作者在进行了大量的基础研究后，取得了长足的进步，对今后体外受精技术的应用奠定了基础。
研究从最初的精子在同种或异种雌性生殖道内完成体内获能过程，发展到用化学成分明确的溶液培养获能。
这一系列的研究成果大大推动了体外受精技术的发展并获得成功。
20世纪80年代中期以后，以牛为代表的家畜体外受精技术迅速发展，研究从理论向实践应用发展。
此后，牛的卵母细胞体外成熟和胚胎培养体系逐步趋于成熟，胚胎体外生产效率得到很大提高。
20世纪8O年代后期，体外受精技术成为发展畜牧业的重要手段，利用此技术保留了良种家畜的遗传基因，在欧美等发达国家中得到了广泛的应用并且在效益上取得了显著的效果。
2.哺乳动物体外受精的研究方法及进展2.1卵母细胞的采集卵母细胞的来源及质量如何直接影响了体外受精的成功率，在进行卵母细胞的采集上我们通常采用3种方法，先对这三种方法进行如下介绍：（1）超数排卵直接获得成熟卵母细胞。
哺乳动物精子获能及其鉴定
哺乳动物精子获能以及鉴定摘要：精子获能是精卵结合的前提，是哺乳动物受精过程中的关键环节。
精子获能的发现促使体外授精研究取得了突破性进展，为人类研究受精机理奠定了基础。
本文从体内、体外两方面论述了哺乳动物精子获能的培养方法，并且对精子获能的评价方法进行了总结。
关键词：精子获能；培养；评价人及哺乳动物的精子在离开生殖道时，还不能立即与卵子受精，它必须经历一系列生理生化及形态的变化才能获得受精能力，这种生理现象称之为获能（capacitation）。
精子获能是精子受精前必须经历的一个生理阶段。
自然情况下，精子获能是在雌性生殖道内进行，自宫颈开始，经历子宫和输卵管，最后完成于输卵管壶腹部。
研究表明，精子获能不仅可以在雌性动物生殖道内进行，也可以在体外适当的培养条件下进行。
1 精子获能的方法精子获能的方法分为体内获能和体外获能两种。
1.1 体内获能早期的获能研究，采用体内获能的方法，即从交配母畜的子宫内取出精子用于受精，以受精率为指标，分析获能的部位、时程及其机制。
进一步研究发现，获能过程没有种的特异性，即精子不仅在同种生殖道内，而且可以在异种动物生殖道内或液体内进行获能。
将牛精子放入家兔子宫和猪输卵管内培养同样能使精子获能。
精子在成熟过程中，表面被覆了蛋白质类和多胺类，这些物质的存在对获能具有抑制作用。
在体内获能期间，精子在雌性生殖道内运动时，子宫颈黏液输卵管液和卵泡液，以及输卵管上皮细胞等，都有助于清除精子表面的抑制因子，促进获能的发生由于体内获能的研究，经常受到许多条件的限制，在机体生殖道内培养需时间，其环境也受卵巢激素影响，不稳定因素多，且雌性生殖道内，特别是输卵管内回收到的精子数量太少，测定获能精子化学成分的改变更加困难；并且，精子在体内总是与雌性生殖道分泌物接触，而雌性生殖道中存在着影响获能的因子，对于复杂的体内环境人们又很难控制，因而给研究精子获能带来极大的困难为此，体外获能的研究方法应运而生。
哺乳动物精子获能的分子机制
也表明
H 2 O2 能 激 活 腺 苷 酸 环 化 酶 ( Adenylat e cy clase , AC) , 促进 cAM P 的生成 , 导致 P T P 。 ROS 在精子 获能中的作用具有剂量依赖性特点 , 低剂量 ROS 对 精子获能是必须的 ; O 2 、H 2 O 2 及 OH 皆可启动精 子获能 , Lin S C 等在 含 有果 糖 的获 能 液 中添 加 0. 025 m mol/ L ～ 5 mmo l/ L 的 H 2 O 2 , 结果表明浓度 为 0. 3 mm ol/ L 的 效 果 最 好 , 当 浓 度 超 过 0. 3 mm ol/ L时不利于受精 , 这是由于精子中含有大 量不饱和脂肪酸和低的抗氧化酶 , 从而对氧化作用
。 试验表明并非所有精子都发生 P T P ,
只有附睾尾部精子在获能时促进分子质量为 40 ku ～ 120 ku 的一 系列蛋白 发生 P T P , 在获能精 子中 Leclere P 等观察到 p105 和 p81 蛋白 P T P 比未获能 精子高 , Healt h E 等
[ 2]
证实热激蛋白 86 和 90 也发
参考文献 :
[ 1] Fran coi se U , Denny S . Protein p hosphorylat ion in mammalian spermatozoa[ J] . R eprod , 2003 , 125 : 17 - 26 . [ 2] Heath E , Ru ssel C , A it ken J . Tyrosine phos phorylation of H SP90 during mam mali an sperm capaci tat ion [ J] . Biol Reprod , 2003 , 69 : 1801 - 1807 . [ 3] Dorval V , D uf our M , Leclerc P . Regu lat ion of t he phos photyrosine con tent of human sperm p roteins by i nt racell ular Ca 2 + : role of Ca 2 +-adenosi ne t riphosp hatases[ J] . Bi ol Rep rod , 2002 , 67( 5) : 1538 -1545 . [ 4] Vi scon ti P E , G alant ino h omer H , M oore G D , et al . Th e m olecular basi s of sperm capacit ation[ J] . J A ndrol , 1998 , 19( 12) : 242 -248 . [ 5] S hadan S , James P S , How es E A , et al . Cholest erol ef flu x alters lipid raf t st abili ty and dis t rib uti on du ri ng capacit ati on of boar spermat ozoa[ J] . Biol R eprod , 2004 : 71( 1) : 253 -265 . [ 6] Ri vli n J . M endel J , Rubin st ein S . Role of Hyd rogen peroxide in sperm capacit at ion and acrosome react ion [ J ] . Biol Reprod , 2004 , 70 : 518 - 522 . [ 7] Zeng Y , Clark E N , Florman H M . Sperm mem bran e potent ial : hyperpolari zation during capaci tion regu lat es zona pellu cide-dependent acrosom al s ecret ion[ J] . Develo Bi ol , 1995 , 171 : 554 563 . [ 8] D emarco I A , Espinosa F , Edw ards J , et al . Invol vement of a N a +/ HCO 3 - cot rans porter i n mou se sperm capacit ati on[ J] . J Boil Ch em , 2003 , 278( 9) : 7001 - 7009 . [ 9] Baker M A , Het heri ngt on L , Ecroyd H , et al . A nalysis of t he mechanism by w hich calciu m negati vely regulat es t he t yrosine phosph ory lation cascade associat ed wi th spermcapacit ation[ J] . J Cell S ci , 2004 , 117 : 211-222 . [ 10] D a R os V G , M unuce M J , Cohen D J , et al . Bicarb on at e is required f or mig rat ion of sperm epididymal prot ei n D E ( C RISP-1) to the equat orialsegment and ex pres sion of rat sperm f usion abilit y[ J] . Bi ol Rep rod , 2004 , 70 : 1325 -1332 . [ 11] G reet F U , Sakkas D . Prot ein Tyrosine Ph osphorylati on in sperm du ri ng gamet e i nt eract ion i n th e mouse : t he inf luence g lucose[ J] . Biol Reprod , 2001 , 64 : 1350-1357 . [ 12] Is abelle T , put tasw amy M . E ff ect of progenst erone on bovine sperm capacit ation and acrosome reaction [ J] . Bi ol Reprod , 2003 , 69 : 1408-1415 . [ 13] Nat haly C , J ani ce L B . A D iff erent ial M echanis m Is Involved D uring Hepari n - and C ry op reservation-Induced Capaci tat ion of Bovine S perm at ozoa[ J] . Biol Reprod , 2003 , 69 : 177 - 185 .
哺乳动物受精作用的具体过程（以人为例）
哺乳动物受精作用的具体过程（以人为例）哺乳动物受精作用的具体过程（以人为例）1.精子的结构和功能精子获能是指精子借以获得受精能力的一系列生理变化过程。
精子在穿过子宫颈时就开始了获能进程。
当到达输卵管峡部时，获能过程已接近完成。
获能后期的精子发生“超激活”，即出现强烈鞭打样运动，头、尾的摆动幅度显著加大，运动方向也变得灵活多变，使精子得以穿越输卵管峡部。
同时，精子的细胞膜系的稳定性降低，细胞膜表面某些与受精密切相关的受体暴露，具备了与卵母细胞进行相互作用和产生顶体反应的条件。
顶体反应是精子完成获能后所发生的结构功能变化，类似于体细胞的胞吐现象。
精子开始发生顶体反应时，顶体首先膨胀，精子的细胞膜与顶体外膜紧贴，发生多点融合，融合处破裂，顶体通过破裂口与精子外部相通，顶体内容物中的水解酶被激活并通过破口扩散出精子头表面，顶体内膜暴露。
顶体反应是精子在受精时的关键变化，只有完成顶体反应的精子才能与卵母细胞融合，实现受精。
2.卵母细胞的结构和功能女性排卵时，卵子从破裂的卵泡中随卵泡液一起从卵巢排出(排卵)，被输卵管伞端所拾取并运送至输卵管壶腹部，等待精子受精。
这时的卵子其实是卵冠丘复合体（图2-1）。
该复合体的中心是卵母细胞以及一个体积相对小得多的极体，其外包裹着一层主要由卵母细胞分泌物形成的细胞外基质，称为透明带（简称ZP)，卵母细胞与透明带之间留有一狭窄的空隙即卵周间隙。
透明带之外还围绕着若干层卵泡细胞，其最靠近透明带的一层被称为放射冠。
透明带在受精中起着至关重要的作用，其结构主要由三种糖蛋白(ZP1、ZP2、ZP3)组成。
其中，ZP3能识别同物种精子并与之结合，继而诱导精子发生顶体反应，启动受精过程。
若未受精，卵母细胞将在排卵后12～24 h退化。
3.受精过程受精过程分为三个阶段，即精子与卵泡细胞相互作用、精子与透明带相互作用和精子与卵母细胞相互作用。
（1）精子与卵泡细胞相互作用女性排卵时所释放的卵冠丘复合体和卵泡液，通过输卵管伞端进入壶腹部。
【doc】常用哺乳动物精子质量检测方法
常用哺乳动物精子质量检测方法经济动物2004,8(4):198～201,204JournalofEconomicAnimal常用哺乳动物精子质量检测方法'田恒玖,刘志平,白玉妍(东北林业大学野生动物资源学院,哈尔滨150040)摘要:根据精子的特性,利用光学显微镜,荧光显微镜,流式细胞记数仪等仪器,结合常规染色技术或荧光探针技术,通过检测精子染色质的状态,运动能力,质膜的完整性,顶体的状态,线粒体的活性,获能,顶体反应以及与卵子的结合能力等指标来评价精子的功能状态,以便准确预测精子的受精能力.关键词:精子:顶体;获能;线粒体;精子质量中图分类号:$814.8文献标识码:A文章编号:1007—7448(2004)04—0198—04 TheMethodsoftenUsedforEvaluatingtheMammalianSpermQuality TINAHeng—jiu,LIUZhi—ping,BAIYu—yan(CollegeofWild.elifeResources,NortheastForestryUnivers,Harbin150040,China) Abstract:Inordertoaccuratelypredictspermfertilizingpotential,spermqualityisestimatedt houghchromatinstructure,motility,integatyofplasmamembrane,acrosomalstatus,mitoehondria activity,Ca—pacitation,acrosomereactionandbindingooc~emainlybylightmicroscopy,fluorescentmic roscopyorflowc)rt0metrycombiningwithclassicstainingorfluorescentprobetechnology.. Keywords:spermatozoa;acrosome;capacitation;mitoehodfia;spermquality随着人工授精和体外受精技术的不断发展,以及这些技术在生产实践中的应用,如各种哺乳动物的繁育,濒危野生动物的拯救,人类不孕症的解决等,使得精子质量的评价方法也在不断改善.客观,准确的评价精子的功能状态,对于科研和生产实践具有重要的意义.它不仅可以预测雄性动物的繁殖力,而且可以节约精子的用量,使雄性动物的遗传资源得到充分利用,优良的基因得到最广泛传播.评价精液质量的目的就是要快速准确地预测精子的受精能力.在过去的几十年里,主要是通过光学显微镜来评价精子的常规指标,如精液量,精子的密度,精子的运动能力,形态和活力等.这些方法虽然比较简单,但准确性不高.随着生物学的不断发展,精子质量的评价方法不断被改进.现在主要是利用光学显微镜,荧光显微镜,流式细胞记数仪(flowcytometry)等仪器,应用常规染色技术或荧光染色技术来分析精子的功能状态.评价的指标主要是染色质的状态,运动能力,质膜的完整性,顶体的状态,线粒体的活性,获能,顶体反应以及与卵子的结合能力等.这些方法是现在实验室和生产中常用的方法,下面对这些方法进行简单概述.1染色质的结构许多因素可以导致畸形精子的产生,如各种有毒的药剂以及阴囊内温度的偏差等.异常染色质的结构会导致精子的核材料在包装过程中产生差错,这可能与畸形精子的产生有关.牛精子不基金项目:农业科技成果转化资金项目资助(020～413218)作者简介:田恒玖(1978.).男,在读硕士,主要从事野生动物繁殖研究. 收稿日期:2004.08.28第8卷第4期田恒玖等:常用哺乳动物精子质量检测方法正常的染色质结构与精子核的形态之间就有着重要的联系.但在光学显微镜下,通过视觉检查精子的形态并区分精子是否正常,所得的畸形精子数要低于染色质结构试验所得的结果.畸形精子的染色质结构,可以通过染色质结构试验来评价(SCSA).因为DNA的变性位点具有感光性,用异源性的染料吖啶桔(AO)染色,通过流式细胞记数仪,可以看到插入没变性的双链DNA的AO染料发绿色荧光,而与变性的单链DNA结合的AO染料发红色荧光.用SCSA来确定DNA的变性程度,可以准确的预测各种雄性动物精子的受精能力包括人类的精子'.与显微镜观察作比较,SCSA是一种比较灵敏的试验.Karabinus等的研究表明,与阴囊隔离3d的荷斯坦牛的精子经过加热处理后,就可以观测到其染色质结构的变化,而用光学显微镜观察要等到隔离lld后.2质膜的完整性精子的质膜是最易损伤的部位.功能完整的质膜是精子能够新陈代谢,完成获能和顶体反应,以及与透明带(ZP)结合并穿过ZP的基础.在过去的几十年间,人们就已经意识到精子的质膜功能是否完整是区分精子死活的一个重要特征.因而在此基础上发展了许多评价精子质量的方法.2.1常规染色法由于活精子的质膜是完整的,所以不易被台盼兰(typanblue),碘化丙锭(PI)等染料染色.用这些染料来孵育精子,可以使死精子着色,而活精子不着色或只吸收了少量的染料.一些复合的染料像台盼兰一吉姆萨(trypanblue—giemsa),伊红一苯胺蓝(eosin—anilineblue)以及其他一些常规的染料被广泛的用来区分精子的死活.这些染料通常只能为新鲜的精液染色,而冷冻的精液中含有甘油,会影响这些染料的作用.所以,现在常用荧光染料来对冷冻精液进行染色,用荧光显微镜或流式细胞记数仪来分析精子质膜的完整性.用流式细胞记数仪进行评价,可在很短时间内检测大量的精子,比用荧光显微镜检查快得多,但该方法耗资较高,限制了其在实际中的应用.2.2荧光探针染色法荧光探针染色技术的发展,为评价精子的功能状态提供了新的工具.单一或复合的荧光探针都可以被用来评价精子质膜的完整性.使用最多的核酸荧光探针是Hoechst33258(H258),Hoechst33342(H342)以及菲啶类染料,如溴化乙锭(EtBr),碘化丙锭(PI)和溴乙菲啶二聚体(EthD.1).这些染料对于质膜完整的精子不具有渗透性,因此,他们被用来作为死精子的标记,并且在多种荧光染料结合分析时作为对比染料. H258被广泛用来进行核的体外活体染色,现已应用于人类,山羊,绵羊,牛,猪等动物.H258,H342非常适用于多种染料混合时的标记试验.通常这两种染料与具有更长发射波长的染料结合使用. 但H258,H342对于质膜完整的精子具有半渗透性,并且具有广泛的发射光谱易与其他染料的发射光谱重叠,所以在与其他染料结合使用时需要使用过滤器.另外,紫外光对精子和分析人员还具有损害作用.因此在实际中,这些染料不被经常使用.精子的质量也可以用各种双重荧光标记来评价,如用非特异性酯酶基质羧基荧光素双醋酸盐(CFDA)或钙黄绿素乙酰基甲基酯(CAM)与没有膜渗透性的核酸染料结合使用.这两种探针结合使用不但可以测定出精子活力的2个参数——精子内酯酶的活性以及质膜的完整性,同时还可以测定出精子的死活.现已被用来评价多种动物的精子活力,如牛,羊,猪,马等.目前,一种新的具有膜渗透性的核染料SYBR一14被用于活精子的染色.其只能鉴定活精子,一般要与PI结合起来用以评价精子的活力.这2种探针结合起来使用具有染色速度快,染色稳定等一些优点.另外,这2种染料用可见光就可以激发,避免了用紫外光激发对精子和操作者带来的伤害.在可见光的照射下,与活精子结合的SYBR一14发绿色荧光,而与死精子结合的PI发红色荧光.这2种探针结合使用评价精子的活率非常有效,目前认为,SYBR—l4一PI是最适合于各种动物精子死活鉴定的荧光探针. 2.3低渗肿胀试验精子质膜的功能完整性也可以通过低渗肿胀试验(HOST)来测定.精子的细胞膜允许水分子选择性通过,以使精子内外的渗透压达到平衡.在低渗环境中,水分子通过细胞膜流入精子内,为了达到细胞内外的平衡,质膜完整的精子发生肿经济动物2OO4焦胀.由于质膜的肿胀而使精子的尾部发生弯曲, 这种变化在相差显微镜下就可以很容易观察到, 而质膜不完整的精子没有这种现象发生.因此发生肿胀的精子数越多,精子的质量越好.HOST 简单,迅速,对于检验质膜的完整性非常实用.所以被用于人,狗,牛,羊,猪,小鼠和马等动物精子质膜完整性的检测.3精子膜的去稳定精子膜的去稳定可以通过精子内的ca2分布来评价,目前有两类ca2指示剂.一类主要是金霉素(CTC),它能够在ca2浓度高的细胞器内沉积,并与Ca2结合;另一类主要是一些能够进入细胞液等液体环境内的分子颗粒,这些颗粒与ca2结合后会使他们的光谱发生改变.中性的CTC可以很容易的穿过细胞膜,在那里它可以电离出1个阴离子并与ca2结合成螯合物.ca螯合物易与疏水部位优先结合,如膜部位,并能够使其荧光性增强.由于精子质膜状态的不同,精子的功能状态可以区分为几种不同的染色类型.许多研究者发现,人类,小鼠,牛,猪以及其它一些动物具有相同的CTC染色类型.这些染色类型共有3种:①F型,精子的头部具有相同的荧光,为未获能,顶体完整的精子;②B型,在顶体后区无荧光或有非常弱的荧光,为获能且顶体完整的精子;③AR型,整个精子头部无荧光,只在赤道区域有一条荧光带,为顶体反应的精子.可见,CTC不但可以检测精子获能的比例,还可以检测顶体反应的比例.为了证明精子膜的去稳定以及去稳定的程度与受精力成负相关,已进行了许多研究.现已证明,牛精子中F型的发生率与受精力之间负相关.4线粒体的活性线粒体能够不断产生精子运动所需要的ATP来提供能量,因此,线粒体的功能状态是精子质量的一个关键指标.由于活精子的线粒体上存在着跨膜电位,所以阳离子成分的染料若丹明(Rh123) 能在其上沉积.Rh123的吸收速度快,平衡时间短,对温度依赖性小,而且冲洗时无残留,因此一直与EtBr结合使用来评价精子的线粒体的活性. 用Rh123培养精子,活精子的线粒体鞘会被染成绿色,而死精子可以用EtBr或其他荧光染料来区分.在试验中Rh123并不是十分合适的探针,用其染色时,精子必须用乙醛或其他药剂固定,这会影响线粒体的活性.分子探针可以解决这个问题,如已发展的线粒体示踪探针,可以选择性的对有活性的线粒体进行染色,并且精子固定时线粒体的活性也不受影响.虽然Rh123和线粒体示踪探针可以证明线粒体膜电位的存在,但另一种染料JC一1具有独特的特性,能够区分膜电位的高低.用其染色膜电位高的线粒体发桔红色荧光,膜电位低的线粒体发绿色荧光.这些染料经常被用来研究马,牛,羊,猪和大鼠等动物精子的线粒体功能和活性.研究表明,用荧光法测定线粒体的活性与SYBR一14以及显微观察法之间正相关.5顶体的状态哺乳动物精子的顶体反应是受精过程中非常重要的一个过程.具有完整顶体的精子是受精成功的关键.目前,有2类常规的荧光探针可以评价顶体的状态.一类主要是CTC以及一些与细胞外暴露的抗原结合的抗体;另一类主要是外源植物凝集素及一些与精子内顶体抗原结合的抗体,其中的外源植物凝集素常被用来评价顶体的状态.现在用的最多的是异硫氰荧光素(FITC)与豌豆凝集素(PSA),花生凝集素(PNA)或伴刀豆凝集素(ConA)结合使用.这些凝集素被用来评价人类,马,猪,牛,羊等动物精子的顶体状态.用FITC—PSA,FITC—PNA,FITC—ConA来评价顶体的状态简单,迅速,但不能区分精子的死活.因此在用凝集素进行体外活体染色时,一些荧光性的核染料像H258,PI或EthD一1等也被用来结合使用.Ozaki等用H258和FITC—PSA结合使用来评价人类精子的活力以及顶体反应.染色后用荧光显微镜观察,可以看到4种类型的精子:①活的,顶体完整的精子;②活的,顶体反应的精子;③死的,顶体完整的精子;④死的,顶体反应的精子.通过这种方法可以很容易的评价精子的活力和顶体的状态,对评价精子的受精力有着重要意义.FITC—PSA与PI也经常结合起来使用,同时评价质膜的完整性和顶体的完整性H...对于没有渗透性的精子FITC—PSA能够提供精子顶体完整性的信息:顶体完整的精子没有荧光.顶体缺失第8卷第4期田恒玖等:常用哺乳动物精子质量检测方法或发生顶体反应的精子发绿色荧光.PI可以用来作为死精子的标记.用这两种染料来评价精子的活力和顶体的完整性,对于新鲜的,体内获能的精子非常可靠,但不适用于冷冻精液,因为冷冻精液中有蛋黄颗粒,而影响了分析结果的准确性.为了克服蛋黄颗粒的影响,SzabolcsNagy等研究了一种三重染色技术,他们用SYBR一14/PI与藻红素(PE)花生凝集素的结合染料PE—PNA来同时评价质膜的完整性和顶体的完整性, 并结合流式细胞记数仪来检测,分析结果非常准确,还减少了洗去蛋黄颗粒带来的损伤和不便,是一种非常简单,实用的方法,此法将对哺乳动物精子的低温保存的研究有着重要的影响.6精卵之间的相互关系受精过程的各个步骤以及胚胎发育的情况都可用来评价精子的质量,这些或许能对精液的受精能力提供一些有价值的信息.我们知道一个成功的受精过程包括一系列连续的步骤.即:①精子在雌性生殖道内获能;②获能的精子与zP的结合;③精子顶体反应;④精子穿过ZP;⑤精子与卵子质膜融合.受精过程的一个关键步骤就是精子与ZP的结合能力.由于在动物排卵过程中ZP外的多层基质没有了,ZP就成了精子进入卵子的第一道屏障.获能的精子与ZP以一种十分精确的方式相互作用.大量的研究表明,精子与zP的结合分为2个步骤.第一步精子变疏松并不断地转动与卵子的ZP黏附;第二步精子不再转动而与zP紧密的结合.许多精子都可以与ZP黏附并进入ZP,但只有1个精子能够穿透ZP与卵子质膜融合.在透明带结合试验(ZBA)中,精子与同源zP结合的本质特征已经被用来评价精液的受精能力.实际上在ZBA可以用完整的ZP,也可以用半透明带即半透明带结合试验(HZA)来与精子结合.因为要考虑卵子各个不同的结合部位, 所以在ZBA中需要大量的卵子,才能测出精子的受精能力.但有些动物不易获得大量的卵子,反而影响了最后结果的可靠性.在HZA中,卵子被分为两半,用每半来评价精子的结合能力.但对卵子进行等份分割具有一定的难度,目前已经应用于人,马和猪精子能力的分析".就实际操作而言,ZBA和HZA都比较繁琐,而且对操做者的熟练程度依赖性高.用溶解的ZP来评价精子,需要相对少的卵子,是一种非常有前景的方法.其可以克服ZP结合位点的变化所带来的结合精子数目不准确的问题.并且可以用流式细胞计数仪来进行大量精子的检测.总之,精液的质量检测在生产实践中具有重要作用,其首要目的就是要快速,准确的确定精子的受精能力.常规的检测方法可重复性差,准确性低,易受操作者的主观影响,不能准确的反应精子的功能状态.而以上所提到的检测染色质结构,顶体完整性,线粒体活性,以及获能的荧光探针染色技术具有简单,易行和可靠等特点.在精液的质量评价中具有很高的应用价值.如能结合流式细胞记数仪来分析,则能更为客观,准确的评价精子的质量,但流式细胞记数仪价格昂贵,限制了其在实际生产中的应用.准确的预测精子的受精能力,是受精成功的关键.随着动物精子体外保存技术的不断发展,体外评价精子质量的方法吐王在不断的进步.尽管人们做了许多努力来提高预测精子受精能力的准确性,但到目前为止还没有单一的方法或技术能准确的预测精子的受精能力,必须几种方法结合使用,这些方法也只应用人,家畜及试验动物,在野生动物方面还有待进一步研究.参考文献:lIjEvensonDP.Lossoflivestockbreedingefficiencyduetoutleonl—pensablespermnucleardefects[J].ReproductionFertilityandDe velopment,1999,11:1—152jKarabinusDS,V olgerCJ,SaackeRG,eta1.Chromatinstruetural changesinspermafterscrota]insulationofHolsteinbulls[J].Jour—nalofAndrolo~v,1997,18:549555.13jHammerstedtRH,GrahamJK.NolariJP.Cryopreservation0f mammaliansperm:Whatweaskthemtosurvive[J].Journal0f Andrology,1990,11:73—88l4]KrogenesA,Andersen—BergK,HafneAL.et31.Membranealter—ationsnbullspermatozoaafterfreezingandthavdngandafterin vitrofertilization[J].ActaV eterinarySeandinavia,1994,35:17.26?[5]ChengFP,GadellaBM.V oorhoutWF.eta1.Progesterone,in—ducedacrof~mereactioninstMlionspermatozoaismediatedbya plasmamembraneprogesteronereceptor[】].BiologyofReproduc. tion.1998.59:733.7426jNieGJ,WenzelJGWAdaptationofthehypoosmoticswelling testtoasses$functionalintegrityofstallionspermatozoalplasma membranes[J].Theriogenolo~v,2001.55(4):1005.1018.(下转第204页)204经济动物2004矩(TD—PCR)才能扩出目的片段来,但产量甚微,于是决定放弃此对引物,又重新设计并合成了1对新引物(RPN.,RPN).应用新引物扩增时多次扩增出1条约750bp的片段,而"目的片段不出现".针对上述问题,对4种引物进行了分析,发现PN.,PN可作为套式PCR的外引物,而PN,作为内引物,并且3个引物之间无交叉错配现象,不能形成发卡结构和引物二聚体,故此决定采用半嵌套式PCR进行扩增,研究也因此得到了意外的收获,即当产物用EB染色检测不到,而产物中又存在大量的假象带时,应用套式引物来检测目的片段是否已经被扩增出.这合理地解释了为什么第1轮仅扩增出1条约750bp的片段,在第2轮扩增时才出现目的片段.但不可否认第1轮就已经扩增出目的片段,只是产物量少,用EB检测不到(上接第201页)[7]GarnerDL,ThomasCA,JoergHW,eta1.Fluorometricassess—ment~ofmitoehondrialfunctionandviabilityincryopreservedbo? vinespermatozoa[J].BiologyofReproduction,1997,57(6):l40l—l4O6.[8]霍立军,杨增明.哺乳动物精子质量的评价方法[J].动物学杂志,2002,37(2):89—93.[9]OzakiT,TakabashiK,KanasakiH,eta1.Evaluationofacrosome reactionandviabilityofhumanspermwithtwofluorescentdyes【JJ. ArchGy'necolObstet,2002,266:114—117.【10]GrahamJK,KunzeE,HammerstedtRH.Analysisofspermcell viability,acrosomalintegrityandmitochondrialfunctionusingflowcytometry【JJ.BiologyofReproduction,1990,43:55—64. [11]SzaszF,SirivaidyapongS,ChengFP,eta1.Detectionofcalci—umionophorcinducedmembranechangesindogspermasasimple methodtopredictthecryoprcservabilityofdogsemen[J].Molecu—larReproductionDevelopment,2000,55:289—298而已.参考文献:吴乃虎.基因工和原理(第2版)[M]+北京:科学出版社, 1998:105一lo7.罗廷荣,源宣之.NestedPCR检测狂犬病病毒方法的建立及病毒在小鼠体内的移行动态[J]中国兽医,2O(}O,20 (6):535—538.聂立欣,孔小明,刘海,等.半套式PCR检测石蜡包埋组织中猪圆环病毒2型方法的探讨[J].动物医学进展,2004, 25(1):80-82.高荣琨.用套式PCR检测空气样品中猪肺疫霉形体[J].李彦明摘译.中国畜牧兽医,2004,31(6):3741.沈海娥,郭福生,张影,等.应用套式PCR法检测和区分猪传染性胃肠炎病毒和猪呼吸道冠状病毒的试验[J].试验研究,2003:22(7):21—23.[12]SzabolcsNagy,JohannesJansen,EinkoK. flowcytometrlcmethodtoassessplasma—and[13][14][15]eta1.Ap】e—stain integrityofcryopreservedbovinespermimmediatelyafterthawing inpresenceofegg-yolkparticles[J].BiologyofReproduction, 2003,68:l828.1835.FazeliAR,SteenwegW,BeversMM,eta1.Developmentofaspermzonapellucidabindingassayforbull~men[J].TheV eteri—naryRecord,1993,132:14—16.FazeliAR,HoltC,SteenwegC,eta1.Developmentofsperm hemizonabindingassayforboarsemen[J].Theriogenology, 1995,44(1):17—27.StromHolstB,LarssonB,Linde—ForsbergC,eta1.Evaluationof chilledandfrozen-thawedcaninespermatozoausingzonapelluci—dabindingassay[J].JReproductionFertility,2000,l19(2):20j一206L=J。
哺乳动物精子顶体反应检测方法研究进展
流式细胞仪检测精子的活力和顶体状态
A) 绿箭头所指区域属于PI 标记精子，为死精子； B) 蓝箭头所指代表FITC-PNA 标记精子，为顶体反应精子； C) 黑箭头所指代表未发生顶体反应活精子。
荧光显微镜下观察精子的活力和顶体状态
A)
B)
C)
A) H33342 标记所有精子细胞核呈现蓝色荧光； B) PI标记死精子的细胞核呈现红色荧光； C) 发生顶体反应或顶体膜破损的精子被FITC-PNA 标记,呈现绿色顶
哺乳动物精子顶体反应检测方法 研究进展
精子顶体反应
顶体反应是指获能精子在 穿越卵丘细胞与透明带之前或 穿透这些结构期间，精子被激 活，在很短的时间内顶体要发 生一系列变化，从而导致顶体 内容物释放，以溶解卵丘细胞 和透明带，进而穿过透明带与 卵细胞融合完成受精的过程。
精子顶体结构
哺乳动物精子顶体是一个膜结合 的帽状结构，它覆盖在精子核的前
金霉素染色法
原理：金霉素( chlortetracy2cline，CTC) 是常用抗菌素之 一，活精子或戊二醛固定后的精子均可结合 CTC 并发出较强 荧光。它可根据精子不同的获能和 AR 阶段或精子表面差异 进行染色。
F
“F”型为未获能精子，顶体帽完整，整个顶体布满黄绿色荧光
CTC B
“B”型精子为已经获能精子，顶体依然存在，在顶体后区出现一条无或暗淡的荧光区带
异硫氰酸荧光素分子 式
主要表现为 4 种类型: ① 整个精子都有荧光 － 死精子; ② 顶体区有荧光 － 顶体完整精子; ③ 顶体区和顶体后区均无荧光 － 表示全顶体破 裂，是早已完成 AR 者; ④ 顶体后段和赤道段有荧光 － 表示刚发生 AR 不久，顶体内容物尚未完全丢失。
该技术与透射电镜 AR 技术高度相关，稳定 可靠实用可行，一直沿用并成为其他新方法的标 准对照。
哺乳动物精子质量评定方法研究进展[1]
![哺乳动物精子质量评定方法研究进展[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/a51c34c505087632311212b3.png)
收稿日期:2006-01-22 基金项目:中国大熊猫繁育研究基金“提高大熊猫冷冻精子受精能力研究”项目资助,No 12003010第一作者简介:张明(1975～),讲师,博士研究生,主要从事动物繁殖生物技术相关研究。
3通讯作者哺乳动物精子质量评定方法研究进展张明1,2,鲜红3,朱庆1,侯蓉23,郑鸿培1(11四川农业大学动物科技学院胚胎工程实验室,四川雅安625014;21成都大熊猫繁育基地,濒危野生动物繁殖与保护遗传四川省重点实验室;31成都市妇产科医院生殖不孕研究所) 摘要:哺乳动物精子质量的评估,对于人工授精技术和体外受精技术的应用具有重要意义。
目前,可用于反映精子质量的指标和评估方法有:精子活力、精子活率、顶体膜完整性检测、顶体状态与获能的检测、精子线粒体活性、受精能力检测以及其他一些相关的精子质量检测方法。
在生产上,进行多指标联合检测,是目前评定精子质量有效的方法。
随着技术的进步,更加快速、准确、安全和高效的精子质量检测的新方法将被应用到人类生殖临床和畜牧生产中。
关键词:精子质量;评定;哺乳动物;受精能力中图分类号:Q492 文献标识码:A 文章编号:1000-7083(200)01-0230-05Progesses on the Methods for Assessing Mammalian Spermatozoa Q u alityZHAN G Ming 1,2,XIAN Hong 3,ZHU Qing 1,HOU Rong 23,ZHEN G Hong 2pei 1(1.The Laboratory of Reproductive Biology and Technology ,College of Animal Science &Technology ,SichuanAgricultural University ,Y aan ,Sichuan Province 625014;2.The K ey Laboratory of Reproduction and Conservation G enetic of Endangered Wildlife of Sichuan Province ,Chengdu Research Base of G iant Panda Breeding ;3.The Department of HumanReproduction and Sterility ,Maternity Hospital in Chengdu ) Abstract :It πs very important to assess mammalian s perm quality for artificial insemination and in vit ro fertilization.Atpresent ,the items or parameters such as s perm motility ,sperm viability ,acrosomal membrane integrity ,acrosomal and capacitation state ,mitochondrion activity ,fertility and other relative techniques are used for evaluating sperm quality.In practice ,multi 2parameters and multi 2methods are used for evaluating sperm quality which is the most effective and exact technique.The fster ,the exacter ,the safer and the more effective method will be develo ped and applied to human repro 2ductive clinic and farming production with technique developing. K ey w ords :sperm quality ;assessment ;mammalian ;fertilizing capacity 哺乳动物精子质量直接关系到精子的受精能力与受胎率,如何评定精子质量一直是人们关心的问题。
鉴定用于实现哺乳动物受精的途径和授精时期的方法[发明专利]
![鉴定用于实现哺乳动物受精的途径和授精时期的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/9db0e53fc1c708a1294a44bb.png)
专利名称：鉴定用于实现哺乳动物受精的途径和授精时期的方法
专利类型：发明专利
发明人：A.J.特拉维斯,C.卡多纳,M.A.穆迪,A.J.辛普森,G.C.奥斯特梅尔
申请号：CN201680082394.7
申请日：20161222
公开号：CN108700494A
公开日：
20181023
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：雄性不育的诊断主要基于对浓度、总能动性、前进能动性、体积、pH、粘度和/或形态学的标准精液分析结果。
当精子进入雌性生殖道时，其必须经历一系列生理学变化，称为获能，以使卵受精。
该过程涉及质膜变化，其响应雌性道中的刺激发生。
这些变化包括去除甾醇类和神经节苷脂G 再分布。
精液分析仅鉴定一半的雄性不育病例，这是因为标准精液分析提供很少的关于精子功能能力的信息。
先前的数据证明神经节苷脂G的定位鉴定能够经历称为获能的功能成熟过程的精子亚群并且强力跟踪能育性。
申请人：安卓威尔生命科学有限责任公司
地址：美国新泽西州
国籍：US
代理机构：中国专利代理(香港)有限公司
更多信息请下载全文后查看。
哺乳动物精子质量评定方法研究进展
哺乳动物精子质量评定方法研究进展
张明;鲜红;朱庆;侯蓉;郑鸿培
【期刊名称】《四川动物》
【年(卷),期】2007(26)1
【摘要】哺乳动物精子质量的评估,对于人工授精技术和体外受精技术的应用具有重要意义.目前,可用于反映精子质量的指标和评估方法有:精子活力、精子活率、顶体膜完整性检测、顶体状态与获能的检测、精子线粒体活性、受精能力检测以及其他一些相关的精子质量检测方法.在生产上,进行多指标联合检测,是目前评定精子质量有效的方法.随着技术的进步,更加快速、准确、安全和高效的精子质量检测的新方法将被应用到人类生殖临床和畜牧生产中.
【总页数】5页(P230-234)
【作者】张明;鲜红;朱庆;侯蓉;郑鸿培
【作者单位】四川农业大学动物科技学院胚胎工程实验室,四川雅安625014;成都大熊猫繁育基地,濒危野生动物繁殖与保护遗传四川省重点实验室;成都大熊猫繁育基地,濒危野生动物繁殖与保护遗传四川省重点实验室;四川农业大学动物科技学院胚胎工程实验室,四川雅安625014;成都大熊猫繁育基地,濒危野生动物繁殖与保护遗传四川省重点实验室;四川农业大学动物科技学院胚胎工程实验室,四川雅安625014
【正文语种】中文
【中图分类】Q492
【相关文献】
1.哺乳动物精子分离方法的研究进展 [J], 韦鹍;潘娟
2.常用哺乳动物精子质量检测方法 [J], 田恒玖;刘志平;白玉妍
3.哺乳动物精子质量检测原理及方法 [J], 白修云;王有柱;李向臣;关伟军
4.哺乳动物精子顶体反应检测方法研究进展 [J], 陈军;韩东;曾黎;程相鲁
5.哺乳动物精子质量的评价方法 [J], 霍立军;杨增明
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
哺乳动物精子获能以及鉴定
摘要：精子获能是精卵结合的前提，是哺乳动物受精过程中的关键环节。
精子获能
的发现促使体外授精研究取得了突破性进展，为人类研究受精机理奠定了基础。
本
文从体内、体外两方面论述了哺乳动物精子获能的培养方法，并且对精子获能的
评价方法进行了总结。
关键词：精子获能；培养；评价
人及哺乳动物的精子在离开生殖道时，还不能立即与卵子受精，它必须经历一系列生理生化及形态的变化才能获得受精能力，这种生理现象称之为获能（capacitation）。
精子获能是精子受精前必须经历的一个生理阶段。
自然情况下，精子获能是在雌性生殖道内进行，自宫颈开始，经历子宫和输卵管，最后完成于输卵管壶腹部。
研究表明，精子获能不仅可以在雌性动物生殖道内进行，也可以在体外适当的培养条件下进行。
1 精子获能的方法
精子获能的方法分为体内获能和体外获能两种。
1.1 体内获能
早期的获能研究，采用体内获能的方法，即从交配母畜的子宫内取出精子用于受精，以受精率为指标，分析获能的部位、时程及其机制。
进一步研究发现，获能过程没有种的特异性，即精子不仅在同种生殖道内，而且可以在异种动物生殖道内或液体内进行获能。
将牛精子放入家兔子宫和猪输卵管内培养同样能使精子获能。
精子在成熟过程中，表面被覆了蛋白质类和多胺类，这些物质的存在对获能具有抑制作用。
在体内获能期间，精子在雌性生殖道内运动时，子宫颈黏液输卵管液和卵泡液，以及输卵管上皮细胞等，都有助于清除精子表面的抑制因子，促进获能的发生由于体内获能的研究，经常受到许多条件的限制，在机体生殖道内培养需时间，其环境也受卵巢激素影响，不稳定因素多，且雌性生殖道内，特别是输卵管内回收到的精子数量太少，测定获能精子化学成分的改变更加困难；并且，精子在体内总是与雌性生殖道分泌物接触，而雌性生殖道中存在着影响获
能的因子，对于复杂的体内环境人们又很难控制，因而给研究精子获能带来极大的困难为此，体外获能的研究方法应运而生。
1.2 体外获能
早期研究精子体外获能通常使用各种动物的体液（如输卵管液滤泡液和血清等），而这些体液的成分相对复杂，很难确定何种成分诱发或支持精子获能。
自从Toyoda等最先报道了采用一种特定的化学培养基获得体外受精成功以来，分析体外精子获能已成为比较容易的事情以Tyrode KRB HamF10BSA BWW BO等培养液进行哺乳动物精子获能培养均见报道。
目前，常用的为 BO液和改良的 Tyrdoe 液（TALP）两大类，许多哺乳动物，如鼠牛猴马等，其精子体外获能的研究越来越多。
近年来的研究表明，体外获能发展起来的实验手段几乎可以达到与体内获能相同的效果，这就使得体外获能的研究可以揭示体内获能的本质精子体外获能技术可以较好地控制实验条件，并可逐个分析获能的相关因子，极大地促进了精子获能的研究。
精子体外获能总体包括两个步骤：一是精液的处理，目的是减少或去除精浆内前列腺素免疫活性细胞细菌和碎片，减少精液的黏稠度，以促进精子获能；二是使用某些特定成分诱导精子获能和顶体反应目前，诱导精子体外获能的方法主要有上浮法、沉淀加上游法和不连续密度梯度法。
经上浮法处理可获得活力较强的精子，但精子回收率较低，目前该方法已成为牛精子（尤其是冻精）洗涤与体外获能的主要方法；精子沉淀加上游法适用于精子活力尚可或含有大量白细胞及碎片的精液，此方法有利于分离活动精子与死精子，且回收率较高；不连续密度梯度法是近年用于分离精子的良好方法，密度梯度离心法原理是形态正常精子的密度要高于异常的精子，经平衡离心后得到高受精力的正常精子，该法适用于精子数量正常而活力较差的精液若与精子上浮技术相结合，不连续密度梯度法可获得更高质量的精子。
精子的质量不同，获能所使用的处理方法也不同，要根据精子的来源及质量选择相应的处理方法江峰根据所使用人精液的质量，将其处理方法分为7 种：（l）少精子症，离心后再重悬于较小体积营养液中；（2）弱精子症，离心 - 上游技术结合添加咖啡因或血管舒缓素；（3）畸形精子，牛血清白蛋白（BSA ）人血清白蛋白或牛宫颈黏液滤过 Percoll 密度梯度离心；（4）液化不全，玻璃纤维过滤；（5）黏度过高，淀
粉酶处理密度梯度离心等；（6）杂质过多，上游法和 Percoll 密度梯度离心；（7）逆行射精，洗涤加上游处理。
2 获能评价的方法
精子获能是一系列的生理生化反应过程，其步骤分为：（1）超激活运动（hyperactivated motility，HAM ）：精子鞭毛运动的频率及类型发生改变；（2）获能：精子膜结构及特征的精细改变；（3）顶体反应（Arcosomal reaction， AR）：标志着精子获能已经完成根据获能精子在运动形态及代谢等方面的变化特征，创立了多种精子获能的评价方法目前，常用的精子获能评价方法为精子超激活运动顶体反应和精子穿卵试验（sperm penetration test， SPA ）此外还有去能因子鉴定法测定精子呼吸能等方法。
2.1 超激活运动
精子一旦获能，其运动类型即发生显著改变，精子头部侧摆幅度和频率明显增加，尾部振幅加大，频率加快，呈现一种特殊的超激活运动或鞭打样运动。
它是精子为适应受精而形成的一种特殊的运动类型，所反映的是精子运动能力和方式的改变其特点是头部运行轨迹呈不规律的 8 字形，并显著地偏离直线精子的超激活运动一般存在两种运动类型：急剧地前向运动（或穿梭运动）和鞭打样运动。
Yanagimachi 于 1970 年首先在仓鼠精子获能时观察到这种现象。
Wang等报道，人精子超激活运动的发生率与体外受精率呈高度相关性，并且对于精子穿越输卵管峡部，克服输卵管上皮细胞的阻力，最后穿过卵丘细胞及其细胞外基质和透明带起着重要的作用。
目前，观察精子超激活运动的应用技术有：显微录像技术、连续分步曝光技术和计算机辅助精子分析（CASA ）技术等。
CASA分析系统在临床研究时备受青睐，它可达到客观准确地量化精子运动情况，通过对精子头部运动轨迹摆动图形的分析，可获得精子运动的多项参数，使人们对精子运动有更深层次的了解。
2.2 顶体反应
顶体反应是精子在获能过程中的生理变化和形态学变化，是哺乳动物的精子具备受精能力的必要条件早期的研究者认为，顶体反应是由精子质膜和顶体外膜相互融合，形成囊泡化，使顶体内含物逸出顶体陈大元等认为质膜并不参与顶体囊泡化，而是双层顶体外膜多位点自我融合而成。
虽然顶体反应是获能的终
点，但获能过程本身还存在着不同阶段，需要采用相应的判断指标随着细胞生物学、分子生物学和免疫学以及显微镜技术的发展，许多检测精子顶体反应的技术相继建立，如普通光镜中的三色染色法（TST）和考马斯亮蓝染色法（CBB），电子显微镜检查法（TEM）荧光显微技术中的金霉素荧光染色法（Chlortetracycline，CTC ）Hoechst33258 结合的植物凝集素标记法顶体酶释放测定法单克隆抗体间接免疫荧光法和豌豆凝集素（FITC- PSA ）标记法等。
近年来，金霉素荧光染色法技术越来越受到人们的重视，它是根据精子不同获能状态进行染色，并可将精子分为 3 种 CTC荧光染色类型，即 F B和AR 型F 型为未获能精子，其顶体帽完整，整个顶体布满黄绿色荧光；B 型精子为已获能精子，其特点是顶体帽仍然存在，但在顶体后区出现一条暗淡的荧光区带；AR 型精子，顶体帽缺，如整个精子头部显示淡绿色或无荧光，即为完成顶体反应的精子。
目前此法已广泛应用在小鼠牛猪猴和狗等哺乳动物和人顶体反应机理研究中并且 Hewitt 等将金霉素与活体荧光染料 H33258 对活精子进行双色染色用于观察整个体外受精获能和顶体反应过程中顶体的变化。
2.3其他方法
去能因子鉴定法和测定精子呼吸能法也是精子获能的鉴定方法。
去能因子鉴定法是用 T- HCl（Tetracycline）标记去能因子，获能处理后，在显微镜下观察，如果没有荧光说明精子表面的去能因子已被除去，精子可能已获能；如果还可以看见荧光，则精子还没有获能由于荧光的易淬灭性，使得这一方法并不可靠。
测定精子呼吸能法所依据的原理是获能精子比新鲜精子代谢能量要大但是由于其操作繁琐，结果不稳定，可信度不高，应用较少。
3 结语
精子获能是受精的重要因素。
精子获能被发现以来，对精子获能的研究特别是体外获能、获能的评价等已经取得了很大的进展。
对精子获能的变化，包括精子质膜结构与生物化学特性发生系列改变，质膜胆固醇含量减少，膜的离子渗透性增加，膜的超极化，胞内pH 升高，Ca2+和 cAMP含量增加，超氧阴离子生成量增多，以及特异蛋白质的酪氨酸磷酸化增强等现象进行了研究。
而由于精子获能的分子机制相当复杂，且受到多种细胞信号途径的调控，目前尚未明确，有待
进一步研究。
参考文献：
[1]Austin CR.Observations on the Penetration of the Sperminto theMammalian Egg[J] .SciRes SerB,1951,4(4):581- 596.
[2]石其贤,袁玉英.精子获能及其发展[J].生理科学进展,1998,29(3) :243- 245.
[3]陈大元.受精生物学[M].北京:科学出版社， 2000.
[4]薛庆善.体外培养的原理与技术[M].北京科学出版社，2000.
[5]江峰. 精液体外处理方法的选择 [J]. 中国男科学杂志，2000,14:134-147.
[6]顾一群.WHO人类精液及精子-宫颈黏液相互作用实验检验手册[M].北京:科学出版社,1992.
[7]王琨,艾群.用精子异种穿卵方法检测牛冷冻精液精子的质量[J].中国奶牛,2000，（2）:32- 33.。