常用菌种的分离、选育和保藏

（五）毒性试验
• 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的， 将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品 工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定， 微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米 曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外， 其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒 性试验。
第二节 培养分离
常用菌种的分离、选育和保藏
第一节 菌种的分离简介
一、菌种的来源
• 根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂 或菌种保藏部门索取或购买；
• 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
二、分离思路
• 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照 生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法， 快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
一、成功的分离培养方法
(1)认真考它所需产品的特征和生产过程； (2)制订初步的筛选标准； (3)将生态学方法运用到分离和筛选过程。
二、培养分离中要解决的问题
1、“分离什么和从哪里分离出?”
2、必须充分考虑所分离微生物的生产能力、生 长速度、生物群体培养和产品生产工艺及其提 纯的难易和费用，工业生产发酵罐中稳定性及 遗传操作的难易程度等。
• 从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要 和基础的步骤。
• 到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示 一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。
• 在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种 类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调 整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之 微生物相适应。
• 因此，建立一更为科学的和针对性不强的分离方 法是必要的。
2．植物体采集方法
• 在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、 安全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一 小块，并注意不要损伤周围边缘。
• 选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在 一片叶上的取样部位。
• 采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法 相似。将洗净的根装入采样袋中，采集根系时， 一般与根际土样一起保存。
采样的注意事项
1、采样时应尽可能保持相对无菌； 2、所采集的样本必须具有某种代表性； 3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集
日期、地点以及采集地点的地理、生态参数 等； 4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为 真正的原地菌群的出现可能是短暂的；
• 5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应 贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。这是因 为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离 了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生 变化，微生物群体之间就会出现消长
3．水样采集方法
• 用于细菌检测的水样应收集于100m1干净、灭菌 的广口塑料瓶中。
• 由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的 静水层中采集水样。
• 方法是：握住采样瓶底浸入水中30-50cm处，然后 瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存 在的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水 中取出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装 满采样瓶。所有水样都应在24h之内迅速进行检测， 或者4℃下贮存。
包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特 性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温 度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工 艺等。
（一）采样
1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作
过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主， 富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵 母和霉菌较多，如一些野果生长区和果 园内。采样的对象也可以是植物，腐败 物品，某些水域等。
（二）增殖培养
• 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物 至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性 培养基，选择一定的培养条件来控制。
• 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维 素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那 么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长， 而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段 的纯种分离就会顺利得多。
(二)培养基的组成原则
• 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必 须重新进行分离纯化。
• 有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合 理先进的设备与之配合。
三、新种分离与筛选的步骤
• 定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生 长培养特性。
• 采样：有针对性地采集样品。 • 增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需
菌种增殖培养后，在数量上占优势。 • 分离：利用分离技术得到纯种。 • 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性
1．土样采集方法
• 森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层 顺序采集；
• 水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆 筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面5～ 15cm处的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻 璃瓶中。
• 在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢 慢拔出植物根，在大量无菌水中浸渍约20min，洗 去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根 部残留的土，这部分上却为根际土样。
（三）培养分离
• 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微
生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。 在这—步，增殖培养的选择性控制条件还应进 一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种 分离的方法有划线分离法、稀释分离法。
（四）筛 选
• 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条 件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以 求得适合于工业生产用菌种。
• 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。
• 3、采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去 表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的 牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时 间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样 中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步 分批寄回，以便及时分离。
3、选择适宜的培养分离方法和检测方法。
四、自然界中细菌的分离
(一)采样和采集方法
• 为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的 细菌菌群，特别是分离那些在唯一微环境区域 中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。
• 样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样 采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋 和塑料瓶等。