人肝癌HepG2细胞培养的体会_费洪新

成分 9:;: 胎牛血清 谷氨酰胺 碳酸氢钠 水 表 " 人肝癌 ./01) 细胞培养液组成 含量 所占百分比 5 S 6 *+\ *( +++ "*+J’ "*( +++ +( )*\ +( +)* +( *+\ +( +*+ ,XX( )*J’ ,X( X)*
# 结果和讨论 #$ ! 适宜的消化方法 如果将 +( +)S ;9ED 和 +( "*S 胰蛋白酶以 " ： " 的体积比 混合后用于消化细胞，则消化液的消化能力太强，消化时间不 好把握 7 传代消化后细胞死亡较多 5 死亡细胞的判断标准是 )V
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分细胞的培养条件 / 培养温度、 ST) 浓度都相对比较固定 / 如有 条件进行人肝癌 4FU7) 细胞单独培养 / 优化培养条件有很重要 的实际意义。 在人肝癌 4FU7) 细胞株培养过程中最为关键的环节是无 菌操作和精细的培养技术 / 而设备的简化不仅节省了开支、减 少了实验材料的费用/ 还免去了更换和补充 ST) 气体的繁琐过 北 程 / 以上培养细胞的一些体会为甘肃亚盛集团博士后科研 （
京 ）工作站的实验室工作人员在大量培养细胞，或者有针对性 地培养某种特定细胞方面提出的部分建议。
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பைடு நூலகம்
实验与实习
卫生职业教育
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微波技术在中药制药中的应用
宋学玲， 袁秀英
? 山东中医药高等专科学校 / 山东 莱阳 ):*)++ M 摘 要： 对近几年来微波技术在中药制药中的应用进行综述， 为进一步研究、 应用提供参考。 文献标识码： R 文章编号： ":," ! ")2: ? )++, M +. ! +"#$ ! +# 子由药材颗粒细胞内部扩散到萃取溶剂界面的时间，从而使萃 取速率提高。 物料干燥灭菌时，高频的电磁波透入干燥灭菌的物料内产 生 ) 种效果：一是与物料中的极性分子相互作用而转化为热 能，使物料内部分子在同一瞬间获得热量迅速升温；二是与物 料中的生物活性组成部分 （ 如蛋白质及酶 ）或化合物 （ 如细菌、 霉菌等 ） 相互作用/ 使它们的生物活性得到抑制或激励。前者称 为微波对物料的加热效应， 后者称为非热效应或生物效应
人肝癌 ./01) 细胞， 并将其广泛地应用于临床毒理性试验研究、 抗肿瘤机制研究及多种肝炎病毒感染机制的研究等方面。 关键词： 实验研究； 细胞培养； 人肝癌 ./01) 细胞 中图分类号： 12)2( #" 文献标识码： 3 文章编号： "4," ! ")24 5 )++, 6 +$ ! +"#$ ! +) 后细胞仍然不贴壁 6 ； 而 +( +)S ;9ED 本身的消化能力太弱 7 消 化 时 间 太 长 且 不 易 将 细 胞 消 化 完 全 8 故 将 +( +)S ;9ED 和 消化效 +( "*S 胰蛋白酶以 , ： # 的体积比混合后用于消化细胞， 果明显， 对细胞的影响小。一般适宜的消化方法是： 用 " T U3C 将细胞洗涤 ) 次 7 再加入适量的 +( "*S 胰蛋白酶 5 含有 +( +)S ;9ED 并以 , ： # 的体积比混合 6 7 覆盖细胞约 )+Q 后吸去胰蛋白 酶 5 含有 +( +)S ;9ED 并以 , ： # 的体积比混合 6 7 在倒置相差显 微镜下可以观察到细胞消化的情况，若消化过度，细胞不容易 贴壁， 大部分细胞会死亡； 若消化不完全， 则用弯头吸管吹打细 胞比较困难，细胞碎片增多，细胞碎片对于培养的细胞而言就 是一种过敏原， 不利于细胞生长和增殖。 #$ " 适宜的复苏方法 从液氮罐中快速取出装有冻存细胞的冻存小管，将冻存小 管快速放于 2+R 水浴摇床中以 4+I0J 的速度慢摇至其溶解 7 溶 解 后 马 上 转 入 #,R 水 浴 箱 7 手 工 慢 摇 恒 温 )J<L7 复 苏 后 以 $++I0J 的速度离心 *J<L7 吸去上清液，加入 "+J’ 含 "*S 胎牛 血清的 9:;: 培养基 7 *S FG) 温箱 #,R 条件下培养。复苏细 胞培养 "+Y 后 7 在倒置相差显微镜下观察复苏后细胞存活的情 况 7 按照已经贴壁细胞为存活细胞、未贴壁细胞为死亡细胞的 原则， 检查人肝癌 ./01) 细胞株复苏的效果。 #$ # 血清含量的要求 由于人肝癌 ./01) 细胞株生长缓慢，恶性程度较高， 对于 血清的要求比较严格，其培养时所需要胎牛血清的浓度要比一 般的肿瘤细胞高一些。血清是细胞培养基中的重要组成部分 7 血清中含有大量的可以吸收的蛋白质和大量的细胞生长因子， 对细胞生长非常重要7 不同细胞株其含量要求有所不同 Z " W ) [ ， 比 如 培 养 人 类 胃 癌 细 胞 C1F,X+" 细 胞 系 要 求 的 血 清 浓 度 是 "+S ，这样既保证了细胞生长良好所需的血清量 7 又不至于浪 费。根据实验者在甘肃亚盛集团博士后科研 （ 北京 ） 工作站的一 些经 验 ， 认为 在 含 "*S 胎 牛 血 清的 9:;: 培养 基 中 人 肝癌 ./01) 细胞生长迅速，但人肝癌 ./01) 细胞培养涉及的面很 广 7 如培养温度、 FG) 浓度等多个条件。对于甘肃亚盛集团博士 后科研 （ 北京 ） 工作站的实验室来说7 一般都是几种细胞在不同 的培养箱中进行培养 7 比如实验培养的细胞有 E 淋巴细胞、 3 淋巴细胞、 人胃癌 C1F,X+" 细胞、 人肝癌 ./01) 细胞、成纤维 细胞等细胞种类，分别在 # 个恒温培养箱中培养。为适应大部
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有资料报道，微波电磁场在杀菌过程中所表现出的非热效应是 细菌致死的主导因素 / 其因素可大大缩短杀菌时间和杀菌温 度。目前， 国内成功地研制了频率为 $"*345 和 ) 2*+345 的微 波干燥机。 ) 2*+345 的微波干燥机在一定条件下兼有灭菌的 作 用 ， 功 率 为 # 6 *;<， 微 波 作 用 "*= 以 上 ， 安 瓿 温 度 接 近 可使细菌全部被杀死。 ""+> ， " 微波技术在中药有效成分提取中的应用 微波技术在中药有效成分提取中的应用简称微波提取，又 称为微波萃取 ? 3@AB&CDEF GHIBDAI@&J， 3G 或 3@AB&CDEF K==@=IFL 它 GHIBDAI@&J/ 3KG M / 是近几年来中草药制剂应用的一种新技术。 是微波和传统的溶剂萃取法结合后形成的新方法。 7DJ5’FB 0 , 1 "$.: 年首先在分析化学制样技术中应用微波萃取法； "$., 年又 用微波萃取技术从棉籽中提取棉实糖， 从豆类中提取豆碱 0. 1 。此 后这方面的研究在国内也不断增加， "$$) 年 NDBF 等 0 $ 1 从薄荷、 海藻中提取有效物质均获成功。以薄荷油为例，微波提取法获 利是水蒸气法的 " 倍左右。 "$$# 年王家强等 0 "+ 1 用微波辐照加热 回流与水浴加热回流重楼粉，提取重楼皂苷。结果微波辐照 而且杂质含量少 / 微波加 *O@J 的效果与水浴加热回流 )P 相当， 热 "+O@J 重楼皂苷提取完全。可见微波提取具有高效节能、杂 质少等优点。"$$$ 年王威等 0 "" 1 将高山红景天 ): 6 .* 目粉末， 以水料 2 ：" 的比例，浸泡 #+O@J 后，微波辐照 "( *O@J，水提
振频率，分子平均动能迅速增加，离子化的物质在超高频电场 中超高速运动，因摩擦会产生热效应，故其间产生的大量的热 量会促使中草药颗粒细胞内温度迅速上升，使细胞内的水汽化 产生一定压力， 将细胞膜和细胞壁冲破， 形成微小的孔洞； 进一 步加热， 将导致细胞内部和细胞壁水分挥发减少， 细胞收缩， 使 表面出现裂纹。孔洞或裂纹的出现使细胞外溶剂容易进入细胞 内， 溶解并浸取细胞内的有效成分。另一方面， 微波所产生的电 磁场会加速被萃取的中草药有效成分向萃取溶剂界面扩散的 速度，用水作溶剂时，在微波场下，水分子高速转动成为激发 态，这是一种高能量不稳定状态或者水分子汽化加强萃取有效 成分的驱动力；或者水分子本身释放能量回到基态，所释放的 能量传递给中药有效成分并加速其运动，缩短了萃取成分的分
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关键词： 微波技术； 微波萃取； 中药制药 中图分类号： Q$,
多年来， 在中药制药生产中常用的浸提方法主要有煎煮法、 浸渍法、 渗漉法、 回流法、 水蒸气蒸馏法等。常用的中药材、 中成 药的干燥方法有烘干法、 沸腾干燥法、 减压干燥法、 冷冻干燥法 等。常用的物理灭菌法有干热灭菌法、 湿热灭菌法、 紫外线灭菌 法等。近几年来， 随着科学的不断发展， 微波技术不仅在食品加 植物油 0) 1 加工、 大蒜 0# 1 制 工方面应用较广泛 / 如在茶叶 0" 1 加工、 品、 牛乳 02 1 保鲜和葡萄干 0 * 1 生产过程中/ 而且在中药制药有效成 分提取和中药材、 中成药干燥灭菌中也不断被应用， 并且取得了 良好的效果。 为了进一步研究、 推广微波技术在中药制药中的应 用， 现综述如下。 ! 微波技术的基本原理 微波是频率介于 #++345 6 #++745 之间的电磁波， 微波加 热是利用微波场中介质的偶极子转向极化与界面极化的时间 与微波频率吻合的特点， 促使介质转动能级跃迁， 加剧热运动， 将电能转化为热能。微波具有很强的穿透力。在提取中药有效 成分时，可以在中草药颗粒内外同时均匀、迅速地加热。一方 面，它可使具有永久偶极的分子产生高达 2( $ 8 "+ 次 9 秒的共