血液制品病毒灭活及去除工艺进展_宋清爽

［Abstract］ With the development of medical science and improvement of living conditions for human, the safety of plasma derivatives have been receiving much more attention. In order to ensure the safety of plasma deriva⁃ tives, the State Food and Drug Administration issued some guidelines, demanding manufacturing process should has the ability to inactivate and remove virus. Moreover, manufacturing process must include some specific viral in⁃ activation and removal procedures. In this article we reviewed several viral inactivation and removal procedures for plasma derivatives, expecting to provide some reference for production and research. ［Key words］ virus inactivation; virus removal; blood products
［摘要］ 随着医学科学的进步和大众生活水平的提高，血液制品的安全性愈来愈受到关注。为了提高血液制品的安
全 性 ，国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 局 发 布 的 相 关 指 导 原 则 要 求 生 产 工 艺 要 具 有 一 定 的 去 除 /灭 活 部 分 病 毒 能 力 ，生 产 过 程
中 应 有 特 定 的 去 除 /灭 活 病 毒 方 法 。 我 们 对 几 种 适 用 于 血 液 制 品 的 病 毒 灭 活 方 法 及 病 毒 去 除 工 艺 进 行 综 述 ，以 期 对
1 病毒灭活方法
1.1 物理方法
收 稿 日 期 ：2011-11-29 基 金 项 目 ：广 东 省 中 国 科 学 院 全 面 战 略 合 作 项 目（2009B091300101） 作者简介：宋清爽（1983- ），男，助理工程师 通 信 作 者 ：郭 采 平 ，（E-mail）gcpzxy0402@yahoo.com.cn
生产及科ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ提供参考。
［关键词］ 病毒灭活；病毒去除；血液制品
［中图分类号］ R187; R457
［文献标识码］ A
［文章编号］ 1009-0002（2012）04-0627-04
Advance in Virus Inactivation and Removal Processes of Blood Products
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生物技术通讯 LETTERS IN BIOTECHNOLOGY
Vol.23 No.4
Jul.,
2012
热 法 。 早 在 20 世 纪 80 年 代 初 期 ，就 有 人 用 60~80℃ 进 行 10~72 h 加 热 处 理 FⅧ冻 干 浓 制 剂 和 凝 血 酶 原 复 合 物 ，但 现 已 证 明 这 种 方 法 不 能 彻 底 灭 活 HBV、 HCV、HIV，而 80℃、72 h 干 热 法 已 被 证 明 能 有 效 灭 活 HBV、HCV、HIV。最近还有将凝血因子冻干制剂 加热至 100℃处理的报告[5]。 1.1.3 γ射 线 辐 照 法 γ射 线 来 自 核 的 转 变 ，由 光 子 组 成 ，在 放 射 性 衰 变 过 程 中 所 形 成 的 子 核 处 于 激 发 和 不 稳 定 状 态 ，当 由 高 激 发 态 跃 迁 回 到 低 激 发 态 时 即 释 放 出 γ 射 线 。 常 用 的 γ 射 线 放 射 源 2 两 种 ，即 钴-60 和 铯-137。 目 前 已 有 大 量 实 验 证 实γ射 线 辐 照 对 各 种 微 生 物 均 有 杀 灭 作 用 ，包 括 有 包 膜 和 无 包 膜病毒及所有的基因型物质。其机制是通过γ射线 辐 照 的 电 离 作 用 直 接 或 间 接 产 生 游 离 基 ，破 坏 生 物 大 分 子 的 共 价 键 。 一 般 情 况 下 ，20~50 kGy 剂 量 的 γ射 线 辐 照 几 乎 能 灭 活 所 有 病 毒 ，但 辐 照 剂 量 越 大 ， 对 蛋 白 制 品 成 分 的 损 伤 也 越 大 ，如 何 在 灭 活 病 毒 的 同 时 又 保 留 蛋 白 有 效 成 分 、不 破 坏 蛋 白 成 分 的 活 性 ， 这将是γ射线辐照应用于蛋白制品病毒灭活的关键， 如 果 能 研 制 出 效 果 好 的 蛋 白 保 护 剂 ，γ 射 线 辐 照 技 术 将 可 用 于 蛋 白 制 品 的 病 毒 灭 活 处 理 ，蛋 白 制 品 的 临 床 应 用 安 全 系 数 也 会 得 到 明 显 提 高 [6]。 1.1.4 短 波 紫 外 线 灭 活 法 紫 外 线 杀 菌 作 用 显 著 ， 可使 DNA、RNA 的碱基生成二聚体或加成物而抑制 病 毒 复 制 ，病 毒 下 降 滴 度 与 光 辐 射 强 度 及 暴 露 时 间 有关。通常，紫外线可分为 3 个波段：A 波段为 320~ 380 nm（UVA），B 波段为 290~320 nm（UVB），C 波段 为 190~290 nm（UVC）。其中，短波紫外线 UVC 对病 毒的灭活效果最好。以往普遍认为紫外线灭活对血 浆 蛋 白 损 伤 较 大 ，因 而 一 度 被 搁 置 。 最 近 不 断 有 研 究 发 现 ，只 要 掌 握 好 辐 射 剂 量 和 暴 露 时 间 ，短 波 紫 外 线 对 病 毒 ，尤 其 是 无 包 膜 病 毒 可 达 到 很 好 的 灭 活 效 果 ，在 不 加 光 保 护 剂 的 情 况 下 对 血 浆 蛋 白 的 损 伤 也 不大 。 [7] Wang 等[8]报道了一种新的紫外灭活仪，在短 时 间 内 就 能 有 效 灭 活 病 毒 ，尤 其 是 无 脂 包 膜 病 毒 ，同 时对血浆蛋白不会造成损伤。这种紫外灭活仪的围 绕灯管的螺旋形结构使血浆料液在压力泵的推动下 形 成 涡 流 ，进 而 使 每 一 部 分 液 体 分 送 速 率 相 同 ，所 受 辐 射 均 匀 ，从 而 达 到 短 的 暴 露 时 间 ，在 不 添 加 任 何 光 保护剂的情况下，无包膜病毒 B19 灭活大于 4Log 值， 制 品 蛋 白 检 测 不 到 损 伤 ，蛋 白 回 收 率 高 。 1.2 化学方法 1.2.1 有 机 溶 剂/去 污 剂（S/D）处 理 法 该 法 是 由 美 国 纽 约 血 液 中 心 的 Horowitz 等 首 先 建 立 的 ，其 原 理 是 有 机 溶 剂 可 使 类 脂 从 病 毒 表 面 脱 落 ，使 病 毒 结 构 被破坏，从而失去感染活性。S/D 法常使用三磷酸正 丁 酯（TNBP）与 不 同 表 面 活 性 剂 ，如 Tween-80、Tri⁃
血液制品是由健康人血浆或经特异免疫的人血 浆 ，经 分 离 、提 纯 或 由 重 组 DNA 技 术 制 成 的 血 浆 蛋 白 组 分 ，以 及 血 液 细 胞 有 形 成 分 ，如 人 血 白 蛋 白 、人 免 疫 球 蛋 白 、人 凝 血 因 子（天 然 或 重 组 的）等 ，用 于 治 疗 和 被 动 免 疫 预 防 [1]。 在 医 疗 急 救 、战 伤 抢 救 及 某 些 特 定 疾 病 的 预 防 和 治 疗 上 ，血 液 制 品 有 着 其 他 药 物 不可替代的重要作用。由于血液制品来源于人血 浆 ，通 常 由 多 人 份 血 浆 混 合 后 经 特 定 分 离 纯 化 技 术 制 备 而 成 ，理 论 上 经 血 液 传 播 的 疾 病 也 可 经 血 液 制 品 传 播 。 为 了 提 高 血 液 制 品 的 安 全 性 ，根 据 相 关 指 导 原 则 要 求 ，血 液 制 品 生 产 工 艺 要 具 有 一 定 的 去 除 / 灭 活 部 分 病 毒 能 力 ，生 产 过 程 中 应 有 特 定 的 去 除 /灭 活病毒方法。
ton X-100 和 胆 酸 钠 组 合 。 S/D 法 灭 活 血 液 制 品 中 脂 包 膜 病 毒 的 效 果 已 得 到 肯 定 ，如 以 0.3% TNBP 和 0.2% 胆 酸 钠 于 24℃ 处 理 F Ⅷ 浓 缩 制 剂 6 h，灭 活 HBV、HCV 均 大 于 4Log，灭 活 HIV 大 于 4.5Log，灭 活 水 泡 性 口 炎 病 毒（VSV）和 Sindbis 病 毒 均 大 于 4.5Log，而 FⅧ促凝活性的回收率高于 90%。通过长 期 临 床 应 用 ，已 证 明 大 量 经 S/D 法 灭 活 的 血 液 制 品 安 全 可 靠 ，因 此 被 广 泛 采 用 。 但 该 方 法 对 细 小 病 毒 B19、戊 肝 病 毒（HEV）及 其 他 非 脂 包 膜 病 毒 无 灭 活 能 力[9]。 1.2.2 低 pH 值孵放法 其原理是低 pH 值（如 pH4） 条 件 可 使 病 毒 表 面 的 细 胞 抗 原 电 荷 发 生 改 变 ，蛋 白 质 的 空 间 结 构 发 生 不 可 逆 变 性 ，从 而 使 病 毒 丧 失 与 细 胞 受 体 结 合 的 能 力 ，不 能 进 入 细 胞 完 成 侵 染 。 其 灭 活 条 件（如 pH 值 、孵 放 时 间 和 温 度 、胃 酶 含 量 、蛋 白 质 浓 度 、溶 质 含 量 等）可 能 影 响 病 毒 灭 活 效 果 ，国 内企业常用 pH4、24℃、孵放 21 d 来灭活 IVIG[10]。 1.2.3 辛 酸 灭 活 法 辛 酸（caprylic acid，CA；或 oc⁃ tanic acid，OA）又名亚羊脂酸，是一种天然存在于蔬 菜 和 动 物 脂 肪 中 的 八 碳 饱 和 脂 肪 酸 ，也 能 通 过 化 学 方法合成。辛酸钠作为稳定剂用于白蛋白制造已有 50 多 年 历 史 ，其 对 人 体 的 安 全 性 及 耐 受 性 已 无 可 置 疑 。1991 年 Lundblad 等[11]发 现 CA 有 灭 活 脂 包 膜 病 毒 的 作 用 ，辛 酸 盐 在 pH4.5 时 ，离 子 化∶非 离 子 化 比 为 1∶2，辛 酸 盐 呈 最 大 的 非 离 子 化 形 式 ，非 离 子 CA 具 有 亲 脂 性 带 正 电 荷 性 质 ，能 进 入 病 毒 脂 包 膜 ，破 坏 磷 脂 结 构 或 /和 嵌 入 磷 脂 膜 的 蛋 白 质 ，从 而 影 响 病 毒 脂 包 膜 的 完 整 性 ，使 病 毒 失 去 复 制 能 力 而 丧 失 感 染 性，达到最佳的灭活病毒效果；当 pH7.0 时，离子化∶ 非 离 子 化 比 为 130∶1，离 子 形 式 的 CA 是 非 亲 脂 性 带 负 电 荷 的 ，不 能 进 入 病 毒 的 磷 脂 包 膜 ，因 此 无 灭 活 病 毒作用。 1.2.4 光化学法 其原理是某些光敏剂对病毒表面及 病毒核酸结构有强烈的亲和性，在适当波长的光照下 易激活，从而通过光化学作用破坏与其接触的病毒结 构。已使用的光敏剂包括血卟啉衍生物、补骨脂内酯 衍生物、吩噻嗪类化合物、酞菁化合物和部花菁 540 等。 这类方法的主要特点是对脂包膜病毒有高效灭活作用， 能用于全血浆的病毒灭活，对血小板制品的病毒灭活 是当前的研究热点。美国加利福尼亚大学实验医学系 的科学家在 100 多种补骨脂内酯的化学改性产物中， 筛选出一种新的补骨脂内酯衍生物 S-59，用 150 μm 的 S-59 结合 3 J/cm2 UVA 照射处理血小板制品，能灭 活游离的 HIV（>6.7Log）、细胞结合的 HIV（>6.6Log）， 而血小板体外功能保存 7 d 后仍保持良好，现已获美 国 FDA 批准进行临床试验[12]。
SONG Qing-Shuang, WU En-Ying, ZHANG Yun-Jia, GUO Cai-Ping*
Shenzhen Weiwu Guangming Biological Products Co., Ltd, Shenzhen 518107, China *Corresponding author, E-mail: gcpzxy0402@yahoo.com.cn
1.1.1 巴氏消毒法 此方法的理论依据是通过选择 适 宜 的 温 度 及 作 用 时 间 ，使 病 毒 结 构 的 破 坏 速 率 远 大 于 蛋 白 质 结 构 的 破 坏 速 率 。 近 50 年 的 临 床 使 用 结 果 及 近 来 的 动 物 实 验 均 证 实 ，白 蛋 白 在 溶 液 状 态 下 经 60℃ 、10 h 加 热 处 理 [2]，即 巴 氏 消 毒 后 ，不 仅 能 灭 活 乙 肝 病 毒（HBV），也 能 灭 活 丙 肝 病 毒（HCV）和 人 免 疫 缺 陷 病 毒（HIV），使 白 蛋 白 成 为 在 病 毒 安 全 方 面 最 可 靠 的 一 种 血 液 制 品 。 近 来 ，巴 氏 消 毒 法 被 扩 大 应 用 于 生 产 静 脉 注 射 免 疫 球 蛋 白（intravenous immunoglobulin，IVIG）、因 子 Ⅷ（FⅧ）、因 子 Ⅸ（FⅨ）、 纤 维 蛋 白 原 等 产 品 的 处 理 。 Bridonnccu[3]等 在 低 温 乙 醇法生产 IVIG 的工艺中加入此病毒灭活工艺，即在 无 稳 定 剂 、低 盐 、酸 性 条 件 下 实 施 巴 氏 消 毒 法 ，病 毒 滴 度 下 降 5Log（lg LD50/mL）。 Simmonds[4] 等 在 对 英 国临床应用的 FⅧ、FⅨ浓缩制剂进行的输血传播病 毒（transfusion transimitted virus，TTV）检 测 中 发 现 ， 未经巴氏消毒法灭活的产品，其 TTV 检出率为 50%~ 75% ，经 巴 氏 消 毒 法 灭 活 后 的 产 品 阳 性 检 出 率 为 零 。 1.1.2 干 热 法（冻 干 制 品） 干 热 灭 活 法 ，即 冻 干 后 的 制 剂 经 加 热 处 理 、干 热 杀 灭 病 毒 的 方 法 。 常 用 的 干 热 法 有 60~80℃、10~72 h 加 热 法 及 80℃、72 h 加
生物技术通讯 LETTERS IN BIOTECHNOLOGY
Vol.23 No.4
Jul.,
2012
doi: 10.3969/j.issn.1009-0002.2012.04.038
血液制品病毒灭活及去除工艺进展
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宋 清 爽 ，吴 恩 应 ，张 运 佳 ，郭 采 平 深圳市卫武光明生物制品有限公司，广东 深圳 518107