RNA指导的DNA复制逆转录及病毒的复制文稿演示

• Temin提出前病毒假说：原病毒DNA是 RNA肿瘤病毒在复制和致癌中的中间物。
• 1970年，Temin 在Rouse肉瘤病毒、 Baltimore在白血病病毒中发现逆转录酶。
多功能酶：
1、RNA指导的DNA聚合酶活性 2、RNA酶H（RNaseH）活性：水解
RNA-DNA杂交体上的RNA 3、DNA指导的DNA聚合酶活性：合成互
整合至宿主细胞（前病毒）
聚合酶
源自文库
结构蛋白
病毒RNA
装配子代病毒
四、组装
病毒核酸与衣壳装配在一起，形成病毒子。 绝大多数DNA病毒均在细胞核内组装; RNA病毒和痘病毒在细胞浆内组装。
五、释放
绝大多数无囊膜病毒释放，一次同步，破坏宿主细 胞膜，细胞裂解释放病毒颗粒，细胞迅速死亡。 绝大多数有囊膜病毒以出芽方式释出时包上细胞核 膜或细胞膜而成为成熟病毒。逐个释出，非一次同 步，细胞死亡缓慢。
• 从病毒进入宿主细胞开始，经过基因组复制和病毒蛋 白合成，至释放出子代病毒的全过程，称为一个复制 周期。
• 病毒的复制周期主要包括吸附和穿入、脱壳、生物合 成、组装和释放四个连续步骤。
复制周期
病毒的一步生长曲线
病毒的一步生长曲线：以感染时间为横坐标，病毒效价为 纵坐标，绘制出的病毒特征曲线。
一、吸附和穿入
补DNA。 4、没有3`→5`外切酶活性。
特点：
1. 含有Zn2+（是否有锌指结构、DNA结合 功能？）
2. DNA合成反应要求→有模板和引物。 3. 需适当浓度的二价阳离子（Mg2+、Mn2+） 4. 5’ →3’合成方向
逆转录病毒的基因 组复制过程
• 第一阶段：合成负股cDNA的大部分 • 第二阶段：以负股DNA为模板合成一小
毒、单股DNA病毒、单正股RNA病毒、单负股RNA 病毒、逆转录病毒和双股RNA病毒。
双股DNA病毒
复制
病毒DNA
子代病毒DNA
宿主细胞 转录酶
晚期mRNA
早期mRNA
病毒结构蛋白
早期蛋白（酶等）
子代病毒子
单链正股RNA病毒
亲代病毒（+）ssRNA
早期蛋白
（-） ssRNA
（+）ssRNA
dsRNA复制中间型
部分正股DNA链。 • 第三阶段：完成cDNA的全部复制。
乙肝病毒基因组的复制
• 其复制需通过逆转录过程经RNA中间体 实现 ，其DNA聚合酶也是一种逆转录酶。
• 逆转录病毒：RNA → DNA → RNA • 乙肝病毒：DNA→RNA → DNA
试管内cDNA的合成
• 常用于获得或研究真核生物基因的方法。 提取某一种特定的mRNA，经逆转录生 成的cDNA可代表某一特定基因。
Virus Obtaining Its Envelope from Host Cell Membrane by Budding
复制周期
思考题1
• 某种病毒DNA的碱基组成（摩尔百分比） 如下： A=32；G=16；T=40；C=12 该病毒DNA的特点如何？
思考题2
• 简要说明怎样进行构建cDNA文库？
思考题3
• 组织培养的哺乳动物细胞S期长达5 小时， 经放射自显影测定DNA复制的速度是0.5 微米/分，已知哺乳动物细胞DNA全长1.2 米，计算染色体复制时共有多少复制叉 在复制？
• 常用的逆转录酶有两种：
* 来自鸟类成髓细胞瘤逆转录病毒称为AMVRT；
* 来自鼠白血病毒称为MMLV-RT。
病毒RNA复制的主要方式
• 1、病毒含有正链RNA，如灰质炎病毒。RNA （+） →蛋白质（酶）→ RNA复制
• 2、病毒含有负链RNA和复制酶如狂犬病毒。 RNA（-） → RNA（+） →蛋白质、复制病毒 RNA（-）。
（一）吸附(adsorption)
分两个阶段：
1. 静电吸附：病毒体与细胞接触，进行静电结合。
非特异性、可逆。
2. 真正的吸附：病毒体表面位点（蛋白质结构）与
宿主细胞膜上相应的受体结合。是决定病毒感染的 真正开始。
裸露病毒的吸附
囊膜病毒的吸附
（二）穿入(penetration)
病毒体吸附在宿主细胞膜上后，可通过数种穿 入方式进入细胞：
RNA指导的DNA复制逆转录及病毒的复制文稿演示
逆转录酶 （reverse transcription)
• 1964年，Temin发现Rous肉瘤病毒等RNA病毒 所造成的感染可被DNA合成抑制剂遏制。 表明：RNA肿瘤病毒的RNA复制过程中要合成 DNA。
• Temin又发现放线菌素D能抑制致癌RNA病毒的 复制，但不能抑制一般RNA病毒的复制。 表明：转录对于RNA病毒增殖是必需的。
（-） ssRNA
（+）ssRNA
大量子代（+）ssRNA
晚期蛋白 装配子代病毒
单股负股RNA病毒
病毒自身携带依赖RNA的RNA多聚酶。 亲代（-ssRNA） 多聚酶 （+）mRNA
（+）ssRNA
蛋白质
子代（-）sRNA
子代病毒
逆转录病毒
逆转录酶
病毒RNA
RNA:DNA
双股DNA
转录酶
mRNA
• 3、病毒含有双链RNA和复制酶。如呼肠孤病 毒。双链RNA → RNA（+） →蛋白质→ RNA （-） →双链RNA
• 4、逆转录病毒。
讨论题
• 如何知道DNA复制中先要有RNA引物的 合成？
• (原料/新合成DNA序列分析/专一核酸酶 水解)
病毒的复制
• 病毒在活细胞内，以其基因为模板，在酶的作用下， 分别合成病毒基因及蛋白质，再组装成完整的病毒颗 粒，这种方式称为复制（replication)。
1.无囊膜的病毒
一般经过细胞膜吞入，称为病毒胞饮,如腺 病毒、小RNA病毒等
病毒胞饮
2. 有囊膜的病毒
• 囊膜与宿主细胞膜融合，病毒的核衣壳直接 进入细胞浆内
• 病毒胞饮: 细胞膜吞入
(1) 膜融合后进入
(2) 病毒胞饮
二、脱壳(uncoating)
不同病毒脱壳方式不一，多数在宿主细胞溶酶体酶 作用下脱壳，释放出基因组核酸。
三、生物合成(biosynthesis)
• 病毒基因组一旦从衣壳中释放后，就利用宿主细胞提
供的低分子物质合成大量的病毒核酸和结构蛋白。
• 早期，根据病毒基因组转录成mRNA、指令合成转录 合成所必需的复制酶和一些抑制蛋白；
• 生物合成阶段，病毒处于隐蔽期 • 病毒的生物合成过程可基本归为6大类：双股DNA病