RGS1对RAW264.7细胞共刺激分子和细胞因子表达的调节

RGS1对RAW264.7细胞共刺激分子和细胞因

子表达的调节

【摘要】目的: 研究RGS1基因对细胞表面分子表达以及细胞因子分泌的影响。方法: 通过克隆RGS1基因、转染RAW264.7细胞、建立稳定转染的细胞系, 利用流式细胞术检测, 基因芯片分析初步探讨RGS1基因的功能。结果: RGS1基因能够抑制NFκB转录因子活性; RGS1基因明显增加RAW264.7细胞表面CD86分子的表达, 降低CD80表达; 在不同Toll样受体配体刺激后, CD40、 CD80和PD1水平低于对照组。同时, RGS1基因使IL6、 IL15的表达明显升高, IL

10、 IL1的表达明显降低。结论: RGS1基因可调节免疫相关细胞表面分子和细胞因子的分泌, 影响Toll 样受体信号通路,表明RGS1可能在免疫调节方面起重要作用。

【关键词】免疫调节 RGS1基因免疫相关细胞

免疫细胞表面刺激分子和由此产生的细胞因子在调节免疫反应过程中起关键作用, 对肿瘤免疫, 移植排斥反应和自身免疫性疾病的发生、发展、转归有着重要的影响。已经发现免细胞中有多种基因表达的改变［1］。我们前期研究中发现卵巢肿瘤细胞能够导致抗原提呈细胞RGS1上调, 提示了RGS1可能在免疫调节过程中起作用。RGS1（regulator of G protein）是GTPase激活蛋白, 由许多成员组成。这个家族的成员能在免疫细胞如T细胞、 B细胞和树突细胞表达。有

研究表明, RGS1基因与趋化因子诱导的免疫细胞迁移有关, 从而对免疫功能进行调节［2］。我们通过建立RGS1基因稳定转染的RAW264.7细胞系, 观察其对细胞表面分子表达的影响和细胞因子分泌模式的改变外, 为RGS1在免疫相关疾病治疗的潜在应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料 RAW264.7细胞购自美国ATCC公司。NFκB荧光素酶质粒和NFκB碱性磷酸酶(seap)质粒由美国约翰霍普金斯大学免疫实验室赠与; 鼠RGS1pcDNA 3.1/V5质粒由本实验室构建; pcDNA3.1/V5His TOPO TA Expression试剂盒购自Invitrogen 公司; PCR缓冲液、 dNTPs、 Taq、 Agarose Gel DNA 纯化试剂盒购自TaKaRa公司。LipofectaminTM2000, SuperScript. One Step RT PCR with Platinum Taq购自Invitrogen公司。RNA TRIzol 试剂购自北京鼎国公司。Great EscAPeTM SEAP 购自Clontech 公司。TritonX100, 羊抗鼠抗体为Sigma公司产品。Trypsin 胰酶（Lot: AMG 16843）为HyClone公司产品。OPTI MEM I 无血清培养基购自Invitrogen公司。PRMI1640 购自HyClone公司。类标准胎牛血清购自兰州民海生物公司。G418硫酸盐, 硫酸卡那霉素购自Amresco公司。

1.2 方法

1.2.1 克隆RGS1基因测序并建立稳定转染的RAW264.7细胞系按照Invitrogen公司提供步骤,从肿瘤相关树突状细胞扩增提取RGS1基因片段并克隆到pcDNA 3.1 His/V5 Topo 载体, 测序确定RGS1基因。RPMI1640培养基加入100 mL/L新生牛血清培养RAW264.7细胞。取4×105细胞加入24孔板培养过夜。1 μg 鼠RGS1pcDNA 3.1/V5质粒溶于50 μL OPTI MEM培养基, 颠倒混匀。2 μL Invitrogen LipofectaminTM2000溶于50 μL OPTI MEM培养基, 颠倒混匀后室温孵育5 min。混合DNA溶液与LipofectaminTM2000溶液, 颠倒混匀后室温孵育20 min。吸出24孔板中培养基, 加入100 μL混合溶液培养8 h。加入500 μL含血清培养基培养24 h。用400 mg/L 浓度的 G418和 100 mL/L血清培养基筛选培养15 d。

1.2.2 检测稳定转染细胞系转染率取4×105稳定转染细胞于流式染色管中1 600 r/min 离心5 min, 弃上清, 加入2 mL PBS 1 600 r/min离心5 min, 弃上清, 用1 mL (1 g/L)多聚甲醛固定细胞。加入2 mL PBS 1 600 r/min离心5 min, 弃上清。加入TritonX100 室温静置5 min, 加入2 mL PBS 1 600 r/min离心5 min, 弃上清。染色: 2 mL PBS 1 600 r/min, 离心5 min, 弃上清后加入100 μL PBS 吹散细胞,用1 g/L多聚甲醛固定, 然后1 g/L Triton 穿透, 加入1 μL FITC标记的anti V5抗体, 避光放置15 min。加入2 mL PBS 1

600 r/min离心5 min后弃上清, 加入100

μL PBS吹散细胞, 取50 μL滴于载玻片上, 荧光显微镜观察。

1.2.3 RGS1基因对转录因素活性的影响 NFκB seap质粒与RGS1基因共转染RAW264.7细胞, 通过化学发光方法检测RGS1基因对转录因素NFκB活性的影响。准备细胞: 100 mL/L 新生牛血清DMEM培养基培养RAW264.7细胞, 细胞计数后按每孔4×105细胞铺入24孔板, 加入 1 mL培养基（不含抗生素）培养过夜。按照Invitrogen LipofectaminTM2000使用说明书方法共转染RGS1基因及NFκB seap质粒。转染36 h后每孔收集110 μL细胞上清液于0.5 mL 微量离心管中, 12 000 g离心10 s, 去除细胞沉淀, 吸取100 μL上清液于新0.5 mL微量离心管, -20℃保存。通过化学发光强度检验（Clontech Great EscAPeTM SEAP）,利用化学发光分析仪检验化学发光强度, 并处理数据。

1.2.4 FCM检测RGS1基因对免疫相关细胞RAW264.7表面分子表达水平的影响培养RGS1基因稳定转染的RAW264.7细胞及未转染的RAW264.7细胞（对照）,实验组与对照组分别用不同的Toll 样受体配体脂多糖（LPS）, Poly I: C, 肽聚糖（peptioglycan, PGN）, 细菌 DNA （BDNA）刺激48 h后, 细胞计数后取1×107细胞与15 mL 离心管中, 1 600 r/min离心5 min, 加入5 mL PBS冲洗后, 1 600 r/min 离心5 min, 弃上清。离心管中加入700 μL PBS缓冲液, 平均分入7个预先标记好的流式管中, 加入相应抗体后, 避光放置15 min。每管