2021年杆状病毒介绍

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核型多角体病毒侵染及其与宿主免疫系统互作的研究进展

环境昆虫学报2021, 43 (2)： 329 -339Joornal cf Eavironmental Einomologyhttp ：〃hjkcxb. alfournals. netdoi ： 1023969 Fii s n21674 -08582202120226黄博，朱梦瑶，丘需珊，张若男，张文庆，余小强，卢玉珍•核型多角体病毒侵染及其与宿主免疫系统互作的研究进展[J ].环境昆虫学报，2021, 43 (2) : 329 -339.核型多角及其与宿主免疫系统互作的研究进展黄博1,3,朱梦瑶1,丘需珊1,张若男1,张文庆2,余小强1,卢玉珍1(1.华南师范大学生命科学学院，广东省昆虫发育生物学与应用技术重点实验室，广州510631；2.中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室，广州510275；3.华中师范大学生命科学学院，武430079)摘要：核型多角体病毒(NucmopXyhedavirus , NPV )应用广泛，已被开发成微生物杀虫剂和用于重组蛋白表达等。

NPV 具有两种病毒颗粒：包埋型病毒粒子(occlusion - derived virus , ODV)和芽生型病毒粒子(budded virus, BV),两的构成和在差异。

病毒包涵体在肠道中溶出ODV 进感染,子衣壳通出生BV 引发全身性的次级感染。

病毒感染昆虫引发宿主的免疫反应，同 NPV 病毒已进化出多种策略抑制或逃避宿主的免疫反应，如免疫信号、黑和凋亡。

总结鳞翅目特异性NPV 与宿主的研究，着重介绍NPV 的制、NPV 与宿疫的研究进展。

关键词：角体病毒；杆状毒；包埋型病毒粒子；芽生毒粒子；先天免疫中图分类号：Q965； S476 文献标识码：A文章编号：1674 -0858 (2021) 02 -0329 -11Advance in the researchi of nucleopolyhenrovirus infection and its interaction with host immune systemHUANG Be 1,3, ZHU Meng-YaX , QIU Pei-Shan 1, ZHANG Rue-Nan 1, ZHANG Wen-Qiny 2, YU Xiav- Qiany 1, LU Yu-/hen 1"(1. GuangdongProvincial Key Laboratoy of Insect Developmental Bmioxy andApplied Technomyy , School of Life Sciences , South China Nomiai University , Guangzhou 510631, China ；2. State Key Laboratoy of Biocontai , Sun Yat-sen Universip , Guangzhou 510275, China ；3. School of LifeSciences , Centea4ChinaNoema4Uniieesity , Wuhan 430079, China )Abstraci : Nuteoplyhedavirus ( NPV ) has been widely used as a bioloyicxi control ayent and anexpression system for recombinant proteins. Thera arc tpv viuon phenotypes , occlusion -devved virus(ODV )and the budded virus ( BV ) , that arc distinct in the composition and osembiy during tPvinfection cycle. The pvmaa i nfection occurs when occlusion bodies ( OBs ) arc disassembled tv release ODV viuons inta lumen of Pa midyut. The payeny nucleocapsids arc transported tv the plasma membraneP yenerata BV phenotype. The BV viuons may infect other tissues and cxusa secondary phase of infection. Insects possess efficient innate immune defenses tv viral infection , whereas NPV has evolved vavous 9teategie9to9uppee 9oeaioid ho9timmuneee9pon9e9.Theinteeaction peoce 9e9between NPV and ho9timmune system includa immune siynaliny pohway , melanization and apoptosis. In thu paper , wvsummavav recent studies on the interactions betpeen Lepidopteran-specific nucleopolyhedavirus and their基金项目：国家自然科学基金(31901941)；国家重点研发计划(2019YFD1002100)；中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室开放课题(2018SKLBC-KF03)作者简介：黄博，男，1994年生，湖北省黄冈市人，硕士生，研究方向为昆虫与病原菌的免疫互作，E-mail ： ******************通讯作者Author for correspondence :卢玉珍，女，博士，副研究员，主要研究昆虫病原微生物，E - mail ： luyuzhen2015@ outlook, com收稿日期 Received ： 2020 —08 —19 (接受日期 Accepted ： 2020 -12-22330环境昆虫学扌&Journal eg Environmental Entomology43insect hosts,mainly focus on the mechanisms of infection,and the interaction between NPV and host immunesystem.Key words：Nucleopolyhedmvirus;baculovirus;occlusion-deCved virus;budded virus;innale immunity杆状病毒(baculovirus)是具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒，基因组大小为80-180kb,只专一性感染昆虫，主要以鳞翅目、双翅目和膜翅目昆虫为宿主(Lange ei al.,2004;HarCson ei al,2018)。

颗粒病毒(GV)简介

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昆虫病毒的生产
❖ 病毒为专性寄生病原，至今尚未研究出能在人工培养基上生长，只能在活细胞中增殖。因此，目前国内外应用于害虫防治的昆虫病毒制剂主要是通过活虫体增殖和细胞培养法繁殖。
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在昆虫活体中大量增殖昆虫病毒
3种途径：
❖ 直接在自然种群中繁殖 ❖ 从野外采回大量活虫接种繁殖 ❖ 在室内条件下饲育大量害虫接种繁殖
❖ 6 产品质量检验
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GV在害虫防治上的应用
加拿大研究菜青虫的黄绒茧蜂能在寄主种群中传播GV。
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利用病毒防治害虫一方面可以起到微生物杀虫剂的短期防治作用，另一方面使用后有可能使病毒长期存在于农林生态系中，作为一类被引入的生态因子而起调节害虫种群密度的作用。
2021/的生产
❖ 菜粉蝶为世界性重要害虫。其幼虫又名菜青虫，是我国分布最普遍，为害最严重，经常成灾的害虫，幼虫偏嗜十字花科蔬菜，幼虫将叶片咬成孔洞和缺刻，严重发生时可将叶片全部吃光。
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菜粉蝶GV的生产工艺
❖ 1 人工饲料饲养菜青虫
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GV的感病特征
❖ 染病幼虫常于幼虫期即死，有时也可活至蛹期或成虫期。从染病到死亡所经时间因虫而异。一般4～5天，可长至34天，如粘虫。幼虫龄期、侵染剂量、温度等因素也能影响这段时期的长短。
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GV的感染途径
❖ 通过口服进入易感虫体，颗粒体在中肠中溶解，游离的病毒粒子通过肠道柱形细胞的微绒毛而侵入，在这些细胞核中增殖，新形成的颗粒体病毒释放于血淋巴中而导致对其他组织的继发感染。

杆状病毒介绍

杆状病毒介绍杆状病毒关键词：昆虫病毒，杆状病毒，核型多角体病毒，颗粒体病毒，质型多角体病毒杆状病毒是一类在自然界中专一性感染节肢动物的DNA病毒，病毒粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180 Kb之间。

目前杆状病毒作为高效、安全的无公害生物虫剂广泛应用于害虫防治。

杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。

杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。

DNA 复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。

其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。

该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。

核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。

它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。

包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。

②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。

昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。

BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。

近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是mùxu苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。

杆状病毒资料

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杆状病毒：基本概念与深入研究
01
杆状病毒的基本概念及其特征
杆状病毒的分类与分布
杆状病毒属于病毒科
• 包含多个属，如昆虫杆状病毒属、哺乳动物杆状病毒属等 • 病毒分布广泛，包括昆虫、哺乳动物、鸟类等
昆虫杆状病毒属
• 主要感染昆虫，如果蝇、蚊子、蝴蝶等 • 具有宿主特异性，不同病毒针对不同的昆虫宿主
杆状病毒与宿主免疫系统具有相互影响的关系
• 病毒可通过抑制宿主免疫反应，逃避宿主免疫清除 • 宿主免疫系统可通过识别和清除病毒，抑制病毒复制和扩散
04
杆状病毒的应用与研究进展
杆状病毒在基因治疗中的应用
• 杆状病毒可作为基因载体，将目的基因导入宿主细胞 • 病毒具有宿主范围广、基因容量大等优点，适用于多种基因治疗策略 • 通过基因编辑技术，改造病毒载体，提高基因导入效率和安全性
哺乳动物杆状病毒属
• 主要感染哺乳动物，如猴子、松鼠、蝙蝠等 • 部分病毒可引起人类疾病，如出血热、脑炎等
杆状病毒的形态与结构
• 杆状病毒呈长棒状形态，直径约20-30纳米，长度可达几百纳米
• 病毒核衣壳由核壳蛋白组成，具有螺旋对称结构 • 病毒基因组为单链DNA或双链RNA，线性或环状 • 病毒基因组两端具有反向重复序列（ITR），有助于病毒复制和组装 • 杆状病毒具有包膜结构，包膜上含有病毒蛋白，有助于病毒感染宿主细胞
杆状病毒通过吸附、内吞和解包等过程感染宿主细胞
• 病毒吸附在宿主细胞表面，通过受体结合进入细胞 • 病毒通过内吞作用进入细胞，形成内质网或溶酶体内的病毒颗粒 • 病毒在细胞内解包，释放基因组，开始病毒复制和表达

杆状病毒-课件

杆状病毒杀虫剂的研究杆状病毒表达系统杆状病毒作为基因治疗的载体
杆状病毒杀虫剂的研究
杆状病毒杀虫剂作为农作物、森林害虫防治的新型安全的生物农药，已经得到了人们的重视。与传统的化学农药相比，杆状病毒对宿主昆虫具有高度的病原性，对非靶生物十分安全，能够在环境中长期存活，对人、畜及其他脊椎动物无害，不污染环境，能和其他化学农药混合使用，同时具有防效时间长、使用方便等优点，所以早在 1973年就已被联合国粮农组织和世界卫生组织推荐作为化学农药的理想替代品。
除了和复制相关的基因以外, 在AcMNPV基因组
中共鉴定出10个基因与晚期基因的转录有关,它们是lef4, lef-5, lef-6, lef-8, lef-9, lef-10, lef-11, lef-12, 39K和p47等基因。其中4个保守基因( lef-4, lef-8, lef-9和p47)的产物
病毒基因表达
早期基因的表达早期时相向晚期基因表达的过渡晚期基因的表达
早期基因的表达
早期基因的转录是由宿主RNA聚合酶Ⅱ 介导的。早期基因迅速表达以满足病毒复制周期所需条件：
控制宿主细胞的代谢机器为病毒DNA复制提供必需条件突破或阻断宿主细胞防御机制提供下一时相病毒基因表达所需基因产物
HaSNPV ）
杆状病毒的分类
Baculoviridae 杆状病毒科
NPV Nucleopholyhedrovirus 核型多角体病毒属
GV Granulovirus 颗粒体病毒属
MNPV SNPV
Baculoviridae
NPV GV
组I 组 II
AcMNPV OpMNPV BmMNPV
LdMNPV SeMNPV HaSNPV

杆状病毒表达系统简介-9页精选文档

体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。

原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞，它操作简便、周期短收益大及表达产物稳定，但是表达基因的相对分子质量有限，不宜过大，且不能对表达产物进行一些翻译后加工、修饰。

真核细胞系统包括 CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等。

昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性，日益受到人们的重视。

1、杆状病毒的生物学特性杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。

杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。

DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。

其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。

该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m 的包含体病毒，呈多角体形状。

核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。

它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。

②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。

昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。

BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。

近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是苜蓿银蚊夜蛾(autogra— phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。

杆状病毒表达系统00000001

昆虫杆状病毒系统高效表达重组蛋白●杆状病毒表达系统介绍●杆状病毒蛋白表达系统的优势●杆状病毒表达载体系统（BEVS）●杆状病毒表达宿主细胞●表达优化条件●翻译后修饰对蛋白表达的影响●高通量表达●总结杆状病毒介绍1.杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒。

2.杆状病毒在其生命周期中有两种不同的形态：一种为出芽型病毒（budded virus, BV），另一种为包含体病毒（Occlusion‐derived virus, OV）。

3. BV由糖蛋白GP64包裹的单一囊膜蛋白和膜蛋白构成。

4. OV由蛋白结晶基体包裹的多囊膜病毒粒子。

5. 研究最多的杆状病毒株为苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclearpolyhedro‐sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。

6. AcMNPV只侵染鳞翅类幼虫。

杆状病毒生命周期●早期（0‐6h PI）•核衣壳迁移到细胞核•病毒DNA释放•开始早期基因表达●晚期（6‐24h PI）•更多DNA复制•新产生的核衣壳离开细胞核，随后在离开细胞质•的过程中得到囊膜蛋白•产生新的出芽病毒●极晚期Courtesy: Dr. Linda Lua, The University of Queensland, Australia •出芽病毒减少•核衣壳在细胞核内得到囊膜蛋白形成MNPVs•MNPVs以多晶体形式出芽，主要是多角体蛋白，形成包含体病毒。

多角体启动子是杆状病毒表达载体系统的主要元件。

优点缺点大肠杆菌成本低、表达量高。

缺乏蛋白质翻译后加工机制；目的蛋白不可溶，蛋白生物活性低。

酵母表达量高，可以翻译后加工，易实现高密度发酵。

蛋白质量不理想。

哺乳动物细胞重组蛋白生物活性高。

成本高；表达水平低，技术和环境要求高。

昆虫细胞重组蛋白生物学活性高；表达水平高；能同时表达多个基因。

重组蛋白糖基化程度低。

杆状病毒及其持续性感染细胞的研究现状及展望

杆状病毒及其持续性感染细胞的研究现状及展望黄磊（贵州师范大学生命科学学院，贵州贵阳550001）摘要：杆状病毒（Baculovirus）是一类专一性寄生于节肢动物，且具囊膜包被的双链闭环DNA病毒，是一种具有潜力的生物杀虫剂，也是生态系统的一个组成部分，是调节昆虫种群密度大小的重要病原因子。

了解杆状病毒持续性感染细胞的研究现状，对后续研究病毒-宿主关系、杆状病毒的持续感染及激活的机制、利用杆状病毒作为真核表达载体、开发杆状病毒应用于农林业病虫害防治、控制昆虫种群密度等方面具有重要意义。

关键词：杆状病毒；病毒的持续性感染；现状及展望Baculovirus And Baculovirus Persistent Infection Cells Status AndProspectsHuang Lei(School of Life Sciences, Guizhou Normal University, Guiyang 550001, China) Abstract: Baculovirus are a class of specific parasitic arthropods, and capsular bag closed by a double-stranded DNA virus. It is a potential of the bio-pesticides, is an integral part of the ecosystem, also the important etiologic agent to regulation of insect population density size. Understanding Baculovirus persistent infected cells research status, on the follow-up study the relationship of virus-host ,the baculovirus persistent infection and activation mechanisms, use baculovirus as a eukaryotic expression vector, and develop baculovirus to use in pest control of agroforestry, as well as control insect population density and other aspects of great significance. Key words: Baculovirus;Baculovirus persistent infection; research status and prospects 杆状病毒专一性寄生于节肢动物，对人类和环境安全，且昆虫一般不产生抗性，因而在害虫治理中受到极大关注[1]。

杆状病毒AcMNPV p48基因的研究的开题报告

杆状病毒AcMNPV p48基因的研究的开题报告一、研究背景及意义：杆状病毒AcMNPV是一种广泛应用于生物工程中的病毒。

其p48基因编码的蛋白质是其感染宿主细胞和复制病毒所必需的一个关键因子。

近年来，关于p48基因结构和功能的研究越来越受到关注，长期以来一直是杆状病毒的研究热点之一。

因此，深入了解AcMNPV p48基因的结构和功能，对于提高病毒生产效率、提高病毒基因工程技术的成功率以及开发新的抗病毒策略等方面有重要的意义。

二、研究目的：本研究旨在探究AcMNPV p48基因的结构和功能，为其在生物制药与生命科学等领域的应用提供理论基础与科学依据，并为制定适当的抗病毒策略提供有用信息。

三、研究内容：1.利用生物信息学和分子克隆技术来克隆AcMNPV p48基因的序列；2.通过多种分子生物学技术对AcMNPV p48基因进行表达和纯化；3.利用免疫荧光、Western blot等技术对AcMNPV p48基因进行免疫检测；4.对AcMNPV p48基因的结构和功能进行深入研究，探究其作用机制和生物学功能；5.研究AcMNPV p48基因在病毒复制和宿主感染过程中的表达调控机制。

四、研究方法：1.生物信息学分析利用BioEdit、DNAMAN等软件进行AcMNPV p48基因序列的比对和多序列分析，预测基因的功能和结构等。

2.分子克隆技术采用PCR和RACE技术克隆AcMNPV p48基因全长序列，然后构建全长表达质粒作为表达载体，并利用细胞培养和蛋白质纯化等技术提取重组蛋白。

3.免疫学实验采用Western blot、免疫荧光等技术对AcMNPV p48蛋白进行检测，并探究其在宿主细胞中的分布。

4.结构和功能研究利用生物物理化学技术及计算方法分析AcMNPV p48蛋白的结构，进一步确定其生物学功能及作用机制。

5.病毒复制和宿主感染机制采用细胞培养和分子生物学等技术研究AcMNPV p48基因在病毒复制和宿主感染过程中的表达模式和调控机制。

杆状病毒及其应用

中由杆状病毒多角体基因启动子驱动的蛋白表达。杆状病毒一２ｓ表达系
统蛋白表达水平与鳞翅目昆虫细胞相当，并且ｓ系统细胞不会出现裂２
解，以允许重复感染。因此，系统是一个有效的昆虫细胞表达系统。可此
３杆状病毒生物杀虫剂的研究
３１杆状病毒生物杀虫剂的研究概况．
蛋白基因位点，这种经过修饰的ＡＭＰｃＮＶ称之为Ｂｃｉ。Ｂｃｉ作为穿ａｍｄａｍｄ
梭载体，既可感染鳞翅目昆虫，又可以在Ｅｃｌ中复制。供体质粒为．ｉｏ
ｐａｔａ。携带有外源目的基因，Ｆｓａｒ７右序列之间是多角体ＦｓｃＢｐａｔｃ的ｒ左Ｂｎ
蛋白动子。辅助质粒编码转座酶，启供体质粒中的外源基因在转座酶作用
下。插入到Ｂｃｉａｍｄ中，干扰了ＬｃａＺ的表达，这样可以通过细菌菌落蓝自筛
选重组Ｂｃｄ质粒ＤＮ。再将重组Ｂｅｄ质粒ＤＡ转染昆虫细胞即可ａｍｉＡａｍｉＮ
获得重组病毒。系统的重组率高，该并且重组时间迅速。
助质粒。ａ—ｏＢｔＢｃｔａ表达系统是由转座子介导的杆状病毒重组系统。－在该系统中，卡那霉素抗性基因、ｎ细菌转座子靶位点ａｒ７Ｔ７ｔｎ、来源于ｐＣｔｒＵ质粒的Ｌｃ肽段编码基因以及ｍｎＦａＺｉ — 复制子被克隆进ＡＭＮＶ多角体ｉｃＰ
收稿日期：０７０ — ２２０ — ４０
杆状病毒及其应用
曹建斌一范晓军梁爱华，，，

基因缺失杆状病毒载体的构建及应用

·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘要：为解决杆状病毒表达系统存在的表达量低和毒种种子批代次窄问题，加快杆状病毒表达系统产业化进程。

本研究首次通过Red 和Cas9两种重组技术，先后对影响蛋白表达的V-cath 、ChiA 、P10和重组杆状病毒基因组稳定性的FP25K 和DA26基因进行缺失。

同时基于对CSFV-E2蛋白的结构和糖基化预测分析，突变影响同源二聚体二硫键形成的糖基化位点。

最后通过悬浮转染的方式提高拯救病毒的滴度。

结果表明对E2基因突变后，表达的E2蛋白95%以同源二聚体形式存在。

通过供体质粒优化和病毒载体基因缺失，E2蛋白的表达水平提高约4倍，可稳定表达蛋白的重组杆状病毒毒株代次从P7代延长至P20代。

悬浮转染获得的重组杆状病毒滴度提高约70倍，同时获得足量低代次的毒种，有效缩短从毒种构建到蛋白表达时间，有效解决杆状病毒表达系统表达量低和毒种种子批代次窄的问题，为猪瘟亚单位疫苗研发奠定基础。

关键词：杆状病毒；猪瘟病毒；基因缺失；E2蛋白中图分类号： S852.65文献标志码：A文章编号：1674-6422（2024）01-0048-08Construction and Application of Gene Deletion Baculovirus Vector收稿日期：2021-11-03基金项目：郑洛新自创区创新引领型产业集群专项（201200211200）作者简介：王同燕，女，硕士，兽医师，主要从事兽用基因工程疫苗研究与开发；仝晓丹，女，硕士，主要从事兽用基因工程疫苗研究与开发通信作者：谭菲菲，E-mail：**************；田克恭，E-mail:**************基因缺失杆状病毒载体的构建及应用王同燕1,2，仝晓丹1,2，苏晓蕊1,2，宋欢欢1,2，李伟国1,2，刘武杰1,2，谭菲菲1,2，田克恭1,2,3（1.国家兽用药品工程技术研究中心，洛阳471003；2.普莱柯生物工程股份有限公司，洛阳471000；3.洛阳普泰生物技术有限公司，洛阳471003）2024,32(1):48-55Abstract: In order to solve the low protein production and virus passages in baculovirus expression system to accelerate the industrialization process, the v-cath , ChiA , P10 that aﬀ ected protein production and FP25K , DA26 genes that related to stability of the genome were deleted by Red and Cas9 recombinant techniques in this study. At the same time, the glycosylation site that aﬀ ected the formation of disulﬁ de bonds were changed based on the structure and glycosylation prediction analysis of CSFV-E2. Finally, suspension transfection was performed to increase the titer of rescued viruses. The results showed that 95% of the mutant E2 protein was in the form of homodimer. The expression level of E2 protein was increased about 4 times by optimizing donor plasmid and deletion of viral vector gene and the passages of the recombinant baculovirus strain with stable expression of protein was extended from P7 to P20. The titer of recombinant baculovirus obtained by suspension transfection increased by about 70 times, and suﬃ cient low viral passages were obtained, which eﬀ ectively shortened the time from strain construction to protein expression and solved the problems of low protein production of baculovirus expression system and virus passages of strain seeds. Therefore, the successful construction of the gene deletion baculoviruses laid a foundation for the research and production of a subunit swine fever vaccine.Key words: Baculovirus; Classical swine fever virus; gene deletion; E2 proteinWANG Tongyan 1,2, TONG Xiaodan 1,2, SU Xiaorui 1,2, SONG Huanhuan 1,2, LI Weiguo 1,2, LIU Wujie 1,2,TAN Feifei 1,2, TIAN Kegong 1,2,3(1. National Research Center of Veterinary Medicine, Luoyang 471003, China; 2. PULIKE Biological Engineering, INC., Luoyang 471000,China; 3. Luoyang Putai Biotechnology Co., Ltd, Luoyang 471000, China)· 49 ·王同燕等：基因缺失杆状病毒载体的构建及应用第32卷第1期猪瘟（Classical swine fever, CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever Virus, CSFV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，给中国和其他国家养猪业造成了严重危害，被世界动物卫生组织列为必须报告的动物疫病之一[1]。

杆状病毒表达系统

同源重组：先将外源基因克隆到转移载体上，然后与线性化Bacmid上共转染转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒：
“转座”和“同源重组”目前都在使用中。 “转座”方式的代表是ThermoFisher的Bac-to-Bac系统。采用“同源重组”方式的有Clontech的BacPAK系统、OET 的FlashBac系统，以及Bacmid Ltd.的qBac系统。这两种方式与外源基因的表达量无关。
J Virol. 1993 Aug;67(8):4566-79. Luckow VA, Lee SC, Barry GF, Olins PO.
Bacmid polyhedrin位点附近序列细节：目前使用的Bacmid大都源于这个Bacmid。
获得重组病毒的方式
转座：先将外源基因克隆到转移载体上，然后在大肠杆菌中通过转座，将外源基因转移到Bacmid上。提取重组 Bacmid，转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒：
无论如何，相对于其他表达系统，杆状病毒表达载体系统（BEVS）是个比较均衡的表达系统：
经过长期优化，杆状病毒表达载体系统的产量已经有了极大的提高：
目前外源蛋白的生产成本大幅度下降，使杆状病毒表达载体系统能进. Kaba et al. / Journal of Virological Methods 122 (2004) 113–118
敲除p26,p10,p74极大地提高了外源基因的产量：
Cell Biol Toxicol (2010) 26:57–68
糖基化改造把昆虫细胞中缺少的糖基化酶克隆到Bacmid上，使蛋白的糖基化更像哺乳动物细胞：
用重组的质粒和野生型的AcMNPV共同感染Sf细胞。
得到的病毒通过空斑筛选(0.5%)，得到重组病毒。

杆状病毒转移载体是什么？

杆状病毒转移载体是什么？杆状病毒载体系统广泛应用于昆虫细胞中表达重组蛋白，它是真核表达重组蛋白最通用和最强大的系统之一。

该系统特别有利于在真核宿主细胞中大规模制备重组蛋白。

许多真核生物蛋白的翻译后修饰只能在真核细胞中发生（例如糖基化），或者需要真核细胞环境来进行正确折叠（例如膜蛋白质），而原核蛋白表达系统却没有这些功能。

杆状病毒是一种双链DNA病毒，通常会感染昆虫，特别是鳞翅目昆虫（moths, butterflies and skippers）。

克隆载体pBV是经优化的，可与来自AcMNPV（Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus）的穿梭载体（称为Bacmid）一起使用，该穿梭载体的野生型基因组大小为134 kb。

首先将目的基因克隆到含有强启动子的pBV载体上，目的基因表达盒与庆大霉素抗性基因的侧翼序列为Tn7转座子末端元件Tn7L和Tn7R。

然后，将该载体转化到携带Bacmid穿梭载体和辅助质粒的大肠杆菌中。

Bacmid穿梭载体是一个非常大的质粒，含有经修饰后携带lacZ基因的杆状病毒基因组和插入lacZ基因编码区的mini-attTn7位点。

辅助质粒可以表达Tn7转座酶，由转座酶介导pBV载体上Tn7R 和Tn7L的之间的区域转座到mini-attTn7位点，Tn7R和Tn7L的之间的区域是目的基因和庆大霉素抗性基因的表达盒。

通过庆大霉素筛选和蓝/白筛选鉴定出重组的阳性克隆（由于lacZ表达，非重组菌落为蓝色，而由于转座子插入破坏lacZ，重组菌落为白色），纯化的重组Bacmid DNA可用于转染昆虫细胞以产生活的杆状病毒，进而产生目的重组蛋白。

最常用的杆状病毒重组蛋白表达细胞系是Sf9，来源于草地贪夜蛾（fall armyworm）的卵巢组织。

该细胞系适用于各种培养条件，包括悬浮或单细胞培养以及无血清培养基。

幼虫和其他鳞翅目细胞系也被广泛使用，也有一些关于杆状病毒可应用于哺乳动物细胞的报道。

杆状病毒

杆状病毒关键词：昆虫病毒，杆状病毒，核型多角体病毒，颗粒体病毒，质型多角体病毒杆状病毒就是一类在自然界中专一性感染节肢动物得DNA病毒，病毒粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180 Kb之间。

目前杆状病毒作为高效、安全得无公害生物虫剂广泛应用于害虫防治。

杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究得不到20种。

杆状病毒得基因组为单一闭合环状双链DNA 分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制与转录。

DNA复制后组装在杆状病毒得核衣内，后者具有较大得柔韧性，可容纳较大片段得外源DNA 插入，因此就是表达大片段DNA得理想载体。

其中，用作外源基因表达载体得杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。

该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m得包含体病毒，呈多角体形状。

核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。

它们在病毒感染中扮演得角色不同，包含体病毒就是昆虫间水平感染得病毒形式，昆虫往往就是食入污染OV得食物后引起感染。

包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000得多角体蛋白，它对病毒得水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素得破坏而失活。

②保证病毒颗粒在适当得位置释放，引起感染。

昆虫中肠上皮局部得强碱性环境(pH=10、5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。

BV病毒就是个体内细胞间得感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位得细胞或直接在临近细胞内感染。

近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能与表达调节得研究进展迅速，其中研究最深入得就是mùxu苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。

杆状病毒PPT

20世纪50年代至80年代，杆状病毒研究取得重要进展
• 基因工程技术的应用
• 杆状病毒表达系统的建立
• 杆状病毒疫苗的研究与开发
21世纪以来，杆状病毒研究逐渐成为热点
• 基因编辑技术在杆状病毒研究中的应用
• 杆状病毒作为基因载体的研究
• 杆状病毒与宿主互作机制的研究
杆状病毒在生态系统中的地位
杆状病毒在自然界广泛分布
成分是蛋白质
杆状病毒核衣
壳的蛋白质可
以分为结构蛋
白和非结构蛋
白
杆状病毒基因
组由单股正链
RNA组成
01
02
03
• 蛋白质分子具有二级结构和
• 结构蛋白参与病毒颗粒的组
• RNA分子具有磷酸二酯键
三级结构
装和稳定性
连接
• 蛋白质分子之间通过氢键和
• 非结构蛋白参与病毒的复制
• RNA分子具有鸟嘌呤和胞
范德华力相互作用
和疫苗开发提供新思路
• 通过蛋白质组学技术分析病毒感染的
• 通过蛋白质组学技术筛选病毒感染的
宿主细胞蛋白质表达变化
特异性标志物
• 研究病毒蛋白与宿主蛋白的相互作用
• 利用病毒蛋白开发新型疫苗和抗病毒
和功能
药物
04
杆状病毒的宿主与致病机制
杆状病毒的宿主范围与感染途径
杆状病毒具有较宽的宿主范围
• 主要侵染细菌、真菌和原生动物等微生物
• 免疫治疗：通过免疫调节和免疫干预手段，提高宿主免疫力，抵抗病毒感染
• 杆状病毒防治面临的挑战包括病毒变异、免疫逃避和疫苗研发等方面
• 病毒变异：杆状病毒易发生变异，影响疫苗的免疫效果和防治效果
• 免疫逃避：杆状病毒具有多种免疫逃避策略，降低宿主免疫系统的抵抗力

杆状病毒介绍

目前杆状病毒作为高效、安全的无公害生物虫剂广泛应用于害虫防治。

杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。

杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。

DNA 复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。

其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。

该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。

核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。

它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。

②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。

昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。

BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。

昆虫杆状病毒egt基因研究进展

昆虫杆状病毒egt基因研究进展王海萍;吴小锋【摘要】杆状病毒是一类大分子的双链环状DNA病毒,其编码的蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因(egt)在感染昆虫后表达产生EGT酶.EGT酶的催化使宿主体内的蜕皮激素失活,阻止幼虫蜕皮,从而利于病毒自身的繁殖.已有研究发现,敲除egt基因的杆状病毒感染的昆虫,死亡时间缩短,向上攀爬行为减弱.最近的研究还表明转egt基因的家蚕蚕蛹发育迟缓.从分子水平对EGT酶作用机制及其与宿主蛋白互作关系进行探索,将加深我们对杆状病毒调控宿主生长发育和行为变化策略的认识,有利于农业生产应用(特别是蚕丝业,如鲜茧缫丝),且为新型高效生物杀虫剂的研发提供新思路.【期刊名称】《蚕桑通报》【年(卷),期】2017(048)001【总页数】4页(P10-13)【关键词】杆状病毒;egt基因;宿主昆虫;生长发育;行为【作者】王海萍;吴小锋【作者单位】浙江大学动物科学学院,浙江杭州 310058;浙江大学动物科学学院,浙江杭州 310058【正文语种】中文【中图分类】Q786杆状病毒是一类具有双链、环状、超螺旋基因组的病毒，被包裹在杆状核衣壳中，也是已知昆虫病毒中的最大类群，宿主域仅限于无脊椎动物，特别是鳞翅目昆虫。

杆状病毒分为α、β、γ和δ四个属，其中根据病毒表面囊膜蛋白GP64或F蛋白的差异，进一步将α属分为GroupⅠ和GroupⅡ两个不同的类别。

杆状病毒的复制周期十分复杂，产生两种类型的病毒粒子：一种是包涵体衍生型病毒粒子（oc⁃clusion-derived virus，ODV），保证病毒在昆虫宿主体外的稳定及对中肠细胞的感染，引起病毒原发性感染周期；另一种是出芽型病毒粒子（budded virus，BV），在昆虫体内细胞与细胞之间传播，引起全身性感染［1］。

杆状病毒egt基因是非必需的早期基因，同时也是最早被发现的在个体水平调控感染宿主的基因。

egt基因编码的蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶（ecdysteroid UDP-glucosyltransferase，EGT），能够催化葡萄糖基从UDP-葡萄糖转移到蜕皮激素上，使蜕皮激素失活，阻止幼虫的蜕皮，从而使幼虫继续摄食，导致昆虫体重增加，最终使病毒产量提高［2］。

杆状病毒

杆状病毒多角体病多角体病毒，颗粒体病毒，质型关键词：昆虫病毒，杆状病毒，核型毒病毒粒子呈杆DNA病毒，感染节肢动物得杆状病毒就是一类在自然界中专一性以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大DNA DNA分子，状，基因组为双链环状之间。

目前杆状病毒作为高效、安全得无公害生物虫剂广泛应180 Kb小在90～多种杆状病毒，600 杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现用于害虫防治。

DNA杆状病毒得基因组为单一闭合环状双链但进行分子生物学研究得不到20种。

复制后组DNA，其基因组可在昆虫细胞核复制与转录。

分子，大小为80～160 kbDNA装在杆状病毒得核衣内，后者具有较大得柔韧性，可容纳较大片段得外源用作外源基因表达载体得杆其中，DNA得理想载体。

插入，因此就是表达大片段。

该NPV)(nuclear polyhedrosis virus，状病毒，目前仅限于核型多角体病毒呈多角得包含体病毒，1~5 m病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约体形状。

核型多角体病毒有两种形式：，，OV)一种为包含体病毒(occluded virus BV)。

，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus它们在病毒感染中扮演得角色不同，包含体病毒就是昆虫间水平感染得病毒形得食物后引起感染。

包含体病毒外层裹了一层蛋式，昆虫往往就是食入污染OV得多角体蛋白，它对病毒得水平感染起以下作用：①保护白晶体，即为29 000②保证病毒颗粒在适当病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素得破坏而失活。

，可使病毒、5)得位置释放，引起感染。

昆虫中肠上皮局部得强碱性环境(pH=10病毒就是个体内细胞间得感染形式，由细胞芽颗粒释放蛋白酶溶解多角体。

BV BV，进入血淋巴系统中感染其它部位得细胞或直接在临近细胞内感染。

生出有关杆状病毒基因结构、功能与表达调节得研究进展迅速，其中研究近几十年，最深入得就是苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病xumù毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。