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质粒构建实验步骤1

质粒构建实验步骤1

质粒构建实验步骤实验一1.将合成的引物溶解(10uM),分别扩增P1P2,P3P4,2.PCR扩增条件如下:95 ℃ 10 min95 ℃ 30 s50℃ 30 s 10cycle72℃ 30 s72℃ 5min3.反应体系为:20 ul (p1p2和p3p4各两管)dNTP 2 ul10xBuffer 2ulTaq 0.4 ulPrimer P1 (P3) 1.0 ulPrimer P2 (P4) 1.0 ulH2O 13.6 ul4.将产物电泳,检测是否为目标片断(分别为A1B、A2B),证实为目的片断以后,进行后续扩增5.将扩增出的AB和CD片断等摩尔加入作为模板进行第二次PCR,并且在第二次PCR 时加入引物扩增25个循环,PCR扩增条件如下:95 ℃ 15 min95 ℃ 30 s60 ℃ 30 s 25cycle72℃ 40 s72℃ 5min6.反应体系为:100uldNTP 10 ul10xBuffer 10 ulTaq 1ulProduct P1P2 2 ulProduct P3P4 2 ulPrimer F 1 ulPrimer R 1 ulH2O 73ul实验二连接载体DNA外源DNA片段10×T4 DNA ligase bufferT4 DNA ligase 0.5μl16℃保温8-24小时。

做二组对照反应,其中对照组一只有质粒载体无外源DNA;对照组二只有外源DNA片段没有质粒载体。

实验三10.转化①取100ul感受态细胞置于冰上融化,将50ul感受态细胞加入至10ul连接产物中,冰上30min。

②42℃放置45~60s,冰上放置2~3min。

③加入37℃预温好的200ul LB液体培养基(不含Amp)④37℃振荡培养1h(160~220 rpm)11.铺板铺板之前要先将AMP抗性的LB固体培养基先预温到常温,然后取100 ul菌液涂板,37℃培养过夜(16~24h)12.不带有质粒DNA的细胞,由于无Amp抗性,不能在含有Amp的筛选培养基上成活。

酵母菌表面展示操作步骤之质粒构建和转化

酵母菌表面展示操作步骤之质粒构建和转化

酵母菌表面展示操作步骤之质粒构建和转化质粒构建和转化是进行酵母菌表面展示的重要步骤之一。

在这一过程中,我们需要合成包含目标基因序列的质粒,并将其转化到酵母菌细胞中。

下面是酵母菌表面展示操作步骤之质粒构建和转化的详细描述。

1. 质粒构建质粒是一种带有自主复制序列的DNA分子。

在酵母菌表面展示中,我们需要构建一种质粒,其中包含用于表达和展示目标蛋白的基因序列。

a. 选择适合的质粒载体:选择合适的质粒载体,例如pYD1或pPICZα,这些载体在酵母菌表面展示中被广泛使用。

b. 插入目标基因:根据目标基因的序列设计引物,通过PCR扩增目标基因,并在引物的末端添加限制酶切序列,以便后续的质粒构建。

c. 酶切和连接:将PCR扩增产物与质粒载体进行酶切,并使用连接酶将两者连接起来。

此步骤需要选择合适的限制酶,并优化酶切和连接的条件。

d. 转化大肠杆菌:将连接好的质粒转化到大肠杆菌中,并通过培养和筛选获得含有目标质粒的克隆。

2. 酵母菌质粒转化在完成质粒构建之后,我们需要将质粒转化到酵母菌细胞中。

转化是指将质粒导入到细胞内,并使其在细胞内复制和表达。

a. 制备质粒:从大肠杆菌培养物中提取包含目标质粒的质粒DNA。

使用质粒提取试剂盒按照厂家说明书进行质粒提取。

b. 酵母菌预处理:用含有酵母菌培养基预处理酵母菌细胞。

这一步骤可以增加酵母菌细胞对质粒的转化效率。

c. 质粒转化:将预处理后的酵母菌细胞与质粒DNA一起孵育。

孵育温度和时间依据具体的实验要求进行设置。

质粒转化的方法包括热激冷冻法、锂乙酸法等,选择合适的方法进行转化。

d. 筛选阳性克隆:将经过转化的酵母菌细胞转移到含有适当选择压力的培养基中,并在培养基上筛选出带有目标质粒的阳性克隆。

这些步骤是进行酵母菌表面展示的质粒构建和转化的基本操作流程。

在每个步骤中,实验者需要采取严谨的操作、选择合适的试剂和工具,并根据实验要求进行优化。

通过这一步骤,可以成功构建和导入目标质粒,为后续的酵母菌表面展示实验奠定基础。

质粒构建

质粒构建

PCR(多聚酶链式反应)一、实验原理PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段,即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。

基本原理及过程如下:PCR循环过程中有三种不同的事件发生:(1)模板变性;(2)引物退火;(3)热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。

1、变性:加热使模板DNA在高温下(94-95℃)变性,双链间的氢键断裂而形成两条单链,即变性阶段。

2、退火:在体系温度降至37-65℃,模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合,使引物与模板链3’端结合,形成部分双链DNA,即退火阶段。

3、延伸:体系反应温度升至中温72℃,耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板,在引物的引导下,利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP),按5’到3’方向复制出互补DNA,即引物的延伸阶段。

上述3步为一个循环,即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。

从理论上讲,每经过一个循环,样本中的DNA量应该增加一倍,新形成的链又可成为新一轮循环的模板,经过25~30个循环后DNA可扩增106~109倍。

典型的PCR反应体系由如下组分组成:DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。

二、按下列组份配制PCR 反应液TaKaRa LA Taq(5 U/μl)0.5 μl10×LA PCR Buffer II(Mg2+ Plus) 5 μldNTP Mixture(各2.5 mM)8 μl模板DNA(λDNA)* 2.5 ng引物1(10 μM) 2 μl引物2(10 μM) 2 μl灭菌蒸馏水up to 50 μl*【50 μl PCR反应体系中模板DNA 推荐使用量】人基因组DNA 0.1 μg~1 μg大肠杆菌基因组DNA 10 ng~100 ngλDNA 0.5 ng~5 ng质粒DNA 0.1 ng~10 ng三、PCR 反应条件。

以λDNA 为模板,扩增 1 kbp、35 kbp 的DNA片段的PCR 反应条件如下:【1 kbp】95℃ 5 min.95℃30 sec.55℃30 sec. 35 Cycles72℃ 1 min.72℃10 min.【35 kbp】94℃ 5 min.98℃10 sec.68℃15 min. 35 Cycles72℃10 min.常用循环:95℃ 5 min.95℃45 sec.55℃45 sec. 35 Cycles72℃ 2 min.72℃10 min.四、可能出现的问题与解决方案:1、假阴性,不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量,④PCR循环条件。

质粒构建流程范文

质粒构建流程范文

质粒构建流程范文质粒是在分子生物学研究中常用的载体,用于将外源基因导入到真核或原核细胞中。

质粒构建是将所需基因插入质粒中的过程,通常包括以下几个步骤:选择适当的质粒骨架、获得目标基因、PCR扩增目标基因、消除酶切位点、连接、转化宿主细胞和筛选等。

下面将详细介绍质粒构建的流程。

第一步:选择适当的质粒骨架质粒骨架是质粒的基本结构,包括起始子、终止子、选择性标志物和多个酶切位点,用于插入目标基因。

在选择质粒骨架时,需要考虑质粒复制起源、复制调节元件和基因表达调节元件等因素。

第二步:获得目标基因目标基因是要插入到质粒中的外源基因,可以是从生物体中提取的DNA或通过合成DNA获得的。

在获得目标基因时,需要考虑基因的大小、序列特征和功能等因素。

第三步:PCR扩增目标基因PCR(聚合酶链反应)是一种常用的DNA扩增技术,可以通过引物在DNA模板上进行反复扩增,得到大量的目标基因的DNA片段。

在PCR扩增目标基因时,需要选择适当的引物和反应条件,并进行反应优化和扩增验证。

第四步:消除酶切位点在插入目标基因之前,需要消除质粒骨架内的酶切位点,避免再次被酶切产生的片段。

可以通过点突变、限制性内切酶切除和引物设计等方法消除酶切位点。

第五步:连接将PCR扩增的目标基因与质粒骨架连接,通常可以通过限制性内切酶切除和连接、引物设计和T4DNA连接酶等方法实现。

在连接时,需要考虑连接位点的互补性和酶切位点的匹配等因素。

第六步:转化宿主细胞质粒构建完成后,需要将其转化到适当的宿主细胞中,使其在细胞内复制和表达。

常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母菌和哺乳动物细胞等。

第七步:筛选转化后的宿主细胞需要进行筛选,以获得携带目标基因的阳性克隆。

常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选和PCR鉴定等。

质粒构建是一项复杂而精细的实验技术,需要熟练的实验操作和严密的实验设计。

在实验过程中,需要注意反应体系的优化、质粒构建产物的验证和质粒的稳定性等因素。

质粒构建

质粒构建

PCR(多聚酶链式反应)一、实验原理PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段,即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。

基本原理及过程如下:PCR循环过程中有三种不同的事件发生:(1)模板变性;(2)引物退火;(3)热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。

1、变性:加热使模板DNA在高温下(94-95℃)变性,双链间的氢键断裂而形成两条单链,即变性阶段。

2、退火:在体系温度降至37-65℃,模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合,使引物与模板链3’端结合,形成部分双链DNA,即退火阶段。

3、延伸:体系反应温度升至中温72℃,耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板,在引物的引导下,利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP),按5’到3’方向复制出互补DNA,即引物的延伸阶段。

上述3步为一个循环,即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。

从理论上讲,每经过一个循环,样本中的DNA量应该增加一倍,新形成的链又可成为新一轮循环的模板,经过25~30个循环后DNA可扩增106~109倍。

典型的PCR反应体系由如下组分组成:DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。

二、按下列组份配制PCR 反应液TaKaRa LA Taq(5 U/μl)0.5 μl10×LA PCR Buffer II(Mg2+ Plus) 5 μldNTP Mixture(各2.5 mM)8 μl模板DNA(λDNA)* 2.5 ng引物1(10 μM) 2 μl引物2(10 μM) 2 μl灭菌蒸馏水up to 50 μl*【50 μl PCR反应体系中模板DNA 推荐使用量】人基因组DNA 0.1 μg~1 μg大肠杆菌基因组DNA 10 ng~100 ngλDNA 0.5 ng~5 ng质粒DNA 0.1 ng~10 ng三、PCR 反应条件。

以λDNA 为模板,扩增 1 kbp、35 kbp 的DNA片段的PCR 反应条件如下:【1 kbp】95℃ 5 min.95℃30 sec.55℃30 sec. 35 Cycles72℃ 1 min.72℃10 min.【35 kbp】94℃ 5 min.98℃10 sec.68℃15 min. 35 Cycles72℃10 min.常用循环:95℃ 5 min.95℃45 sec.55℃45 sec. 35 Cycles72℃ 2 min.72℃10 min.四、可能出现的问题与解决方案:1、假阴性,不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量,④PCR循环条件。

质粒构建全过程范文

质粒构建全过程范文

质粒构建全过程范文质粒构建是分子生物学实验中的一项重要技术,用于将目标基因插入到质粒中,进而导入到宿主细胞中。

下面将详细介绍质粒构建的全过程。

第一步:设计引物在质粒构建之前,需要设计引物,包括引物序列的选择和设计。

引物是用于在PCR反应中扩增目标基因的特定序列。

引物的选择应考虑到目标基因的特点,如长度、GC含量、互补性及其它特异性需求。

第二步:PCR扩增目标基因通过PCR反应扩增目标基因,此过程中,使用上一步设计的引物。

PCR反应的条件和周期取决于目标基因的特点,如长度和GC含量。

扩增后的DNA片段可以通过琼脂糖凝胶电泳检测。

第三步:准备载体质粒选择一个合适的载体质粒,根据实验需求选择质粒的构型、大小及适用宿主细胞。

将质粒提取并进行消毒处理,以去除可能的污染物。

第四步:限制性内切酶切质粒与目标基因通过在特定位点使用限制性内切酶切割载体质粒和PCR扩增得到的目标基因,以生成互补的黏性末端。

第五步:连接目标基因与载体质粒将切割后的载体质粒与目标基因进行连接。

此时,两者的黏性末端会互相连接,形成短暂的连接体。

可以使用连接酶、盐溶液等辅助物质来增强连接效果。

连接后的质粒可以通过琼脂糖凝胶电泳检测。

第六步:转化宿主细胞将连接后的质粒转化到宿主细胞中,以使宿主细胞具有新质粒。

转化的方法有多种,包括化学法、电渗透法、热冲击法等。

选择合适的转化方法要考虑到宿主细胞的特点。

第七步:宿主细胞筛选与鉴定转化完成后,宿主细胞需要进行筛选与鉴定。

一般来说,可以利用抗生素抗性基因选择含有质粒的细胞。

通过培养在含有抗生素的培养基上,只有含有质粒的细胞能够生长。

第八步:验证目标基因的插入通过PCR扩增或测序等方法验证目标基因是否成功插入到质粒中,并且在宿主细胞中表达。

可以使用特异性引物扩增目标基因,然后进行琼脂糖凝胶电泳检测。

测序可以进一步验证目标基因的正确性。

第九步:扩增检测阳性菌落通过原核培养使阳性菌落扩增,以获得足够大量的质粒实验使用。

质粒构建步骤

质粒构建步骤

质粒构建步骤
嘿,你问质粒构建步骤啊?这事儿还挺复杂,不过咱慢慢说。

第一步呢,得先确定你要构建啥样的质粒。

就像你要盖房子,得先有个设计图吧。

想好你要把哪些基因放进去,要让质粒有啥功能。

这可不能瞎整,得有个明确的目标。

第二步,准备材料。

你得有合适的载体质粒,就像盖房子得有块地一样。

还有你要插进去的基因片段,这就好比盖房子的砖头瓦块啥的。

还得有各种酶啊,像剪刀一样把东西剪开再拼起来。

第三步,把基因片段剪下来。

用特定的酶在合适的位置把基因片段从原来的地方切下来。

这就像用剪刀把一块布剪成你想要的形状。

得小心点,可别剪坏了。

第四步,把基因片段插进载体质粒里。

这就像把一块拼图放进一个大拼图里一样。

用另一种酶把载体质粒打开一个口子,然后把基因片段塞进去。

再把口子封上,让它们连在一起。

第五步,验证一下你构建的质粒对不对。

可以用一些方法,比如测序啊,看看基因片段是不是插对地方了,有没有弄错啥的。

要是不对,就得重新来过。

比如说有个科学家想构建一个能让细菌发光的质粒。

他先想好要把哪个发光基因插进去,找好了载体质粒和各种酶。

然后小心翼翼地把发光基因剪下来,插进载体质粒里。

最后验证的时候发现插对了,可高兴了。

把这个质粒放到细菌里,细菌就真的发光了。

所以说啊,质粒构建可不是件容易的事,得一步一步来,细心又耐心。

咋样,现在知道质粒构建的步骤了吧?。

质粒的构建

质粒的构建

质粒的构建一、质粒构建的基本原理1.1 质粒结构质粒是一种环状DNA分子,通常大小在1-200 kb之间,其中包含了一个或多个基因编码序列,以及与复制、表达等相关的功能序列。

质粒通常由多个功能区域组成,包括基因插入位点、选择标记、复制起点、多克隆位点等。

1.2 质粒构建方法质粒构建一般分为以下几个步骤:基因克隆、质粒挑选、连接反应、转化、筛选,这些步骤通常需要借助于PCR、限制性内切酶、DNA连接酶、转化试剂等。

1.3 质粒的应用质粒构建技术广泛应用于基因工程、蛋白质表达、基因敲除、基因组编辑等领域。

通过构建特定功能的质粒,可以实现对基因的操控和调控,对生物学功能进行研究。

二、质粒构建的方法与步骤2.1 基因克隆质粒构建的第一步通常是通过PCR扩增目的基因,得到目的基因片段。

基因片段的选择根据实验需要,可以是全长基因、部分序列、突变体等。

2.2 质粒挑选选择合适的质粒载体是质粒构建的关键一步。

通常质粒载体的选择考虑到基因插入位点、复制起点、选择标记等功能。

常用的质粒载体有pUC19、pBR322、pET等。

2.3 连接反应将基因片段与质粒载体进行连接反应,通常需要利用DNA连接酶将两者连接起来。

连接反应后,通过热激酶等方法将连接产物转化到大肠杆菌等宿主细胞中。

2.4 转化转化是将连接后的质粒DNA导入到宿主细胞中的过程,通常采用化学转化、电穿孔转化、热激等方法进行。

2.5 筛选通过选择标记或多克隆位点等方法对转化后的细胞进行筛选,筛选出含有目的质粒的阳性克隆。

通常可以利用抗生素抗性筛选、荧光报告基因筛选等方法。

三、质粒构建的应用3.1 基因工程质粒构建技术可以用于将外源基因导入到宿主细胞中,实现基因的操控和表达。

通过构建携带感兴趣基因的质粒,可以实现对基因编码蛋白质的表达和研究。

3.2 蛋白质表达利用质粒携带外源基因序列,在宿主细胞中进行蛋白质表达。

通过构建携带目的基因的质粒,可以实现对特定蛋白质的大量表达和纯化。

载体构建质粒构建步骤有哪些?

载体构建质粒构建步骤有哪些?

载体构建质粒构建步骤有哪些?载体构建过程:1、引物设计2、⽬的⽚段选取:RNA提取、RNA反转录、PCR扩增、PCR产物纯化3、双酶切4、连接:T4 DNA ligase连接或者同源重组连接(新贝⽣物:#B101、#B102)5、转化6、菌落PCR7、测序:1)摇菌;2)送样; 3)⽐对;8、菌种保存:菌种⽐对成功,则可保存菌种备⽤。

9、质粒提取:菌种⽐对成功,冻存菌种后,菌液⽤于提取质粒。

⼀、载体构建基本原理分、切、连、转、筛1、分:分离出要克隆的⽬的基因及载体。

2、切:⽤限制性内切酶切割⽬的基因和载体,使其产⽣便于连接的末端。

限制性内切酶:是⼀类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸⽔解酶。

限制性核酸内切酶根据识别切割特性,催化条件及是否具有修饰酶活性分为三⼤类。

其中Ⅱ型酶能识别双链DNA的特异顺序,并在这个顺序内切割,产⽣特异性DNA⽚段,是DNA 重组技术中常⽤的酶。

Ⅰ型酶:具有修饰和切割功能,⽆固定切割位点Ⅲ型酶与Ⅰ型类似,能识别特异位点,但切割位点在识别位点以外Ⅱ型酶特点:①识别顺序⼀般为4-6个碱基对②识别顺序具有180度的旋转对称性,呈完全的回⽂结构③Ⅱ型酶对双链DNA两条链同时切割,可产⽣两种不同末端:平末端,粘末端平末端:在识别顺序的对称轴上,对DNA同时切割形成平末端,如:SmaI5’-CCC GGG-3’ 5’-CCC GGG-3’3’-GGG CCC-5’ 3’-GGG CCC-5’5′突出粘末端:在识别序列的两侧末端切割DNA双链,于对称轴的5 ′末端切割产⽣5 ′端突出的粘性末端,如:Hind Ⅲ5’―AAGCTT―3’ 5’― A 5’-AGCTT―3’3’―TTCGAA―5’ 3’― TTCGA-5’ A―5’3′突出粘末端:与5′突出粘末端作⽤相反,产⽣3 ′端突出粘末端,如:PstI5’―CTGCAG―3’ 5’―CTGCA-3’ G―3’3’―GACGTC―5’ 3’―G 3’-ACGTC―5’3、连:将切割后的⽬的基因和载体⽤T4 DNA连接酶连接或者同源重组⽅法连接。

质粒构建流程

质粒构建流程

质粒构建流程一、引物设计1)取得目的基因序列,可选用数据库NCBI2)软件分析目的基因可用酶切位点。

使用primer5分析出序列不包含的酶切位点,即为可用没切位点。

3)选择载体。

根据转染细胞和实验室资源,选择合适载体。

如pcDNA3.1(+),4)选择酶切位点。

对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点,选择二者共有的作为备选。

载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上,选实验室常用酶切位点。

5)使用primer5设计目的基因引物,目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。

6)根据选择的酶切位点,查找对应的酶切位点保护碱基,将对应片段添加到设计的引物两端,注意酶切位点的前后顺序。

一般选择三个保护碱基。

7)引物设计完成,送公司合成。

二、目的片段获取1. RNA提取试剂盒:Bioteke 高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型(裂解液RL 4℃、漂洗液RW -20℃保存)准备:冰盒、4℃预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套操作步骤:1)将1000μl裂解液RL加入细胞中,混合5min。

2)加200μl氯仿混合,震荡15s,室温孵育3min。

3)4℃,12000rpm离心10min。

4)最上层水相转移至新EP管中(体积约550μl)5)加入1倍体积(550μl)70%乙醇,混匀6)全部转移到套收集管的吸附柱RA中,4℃,10000rpm离心45s7)弃废液,重套收集管,加500μl去蛋白液RE,12000rpm离心45s8)弃废液,重套收集管,加700μl去漂洗液RW,12000rpm离心60s9)弃废液,重套收集管,加500μl去漂洗液RW,12000rpm离心60s10)弃废液,重套收集管,12000rpm空离2min11)吸附柱放入新EP管,加50μl RNase free water于膜上,室温放置2min12)4℃,12000rpm离心60s13)点样:5μl RNA+ 1μl 10×buffer,1.5%琼脂糖凝胶电泳,100V,3min,可见3条亮带。

构建质粒的步骤

构建质粒的步骤

构建质粒的步骤构建质粒是一种重要的实验技术,用于在细菌或其他生物体中携带和复制外源DNA。

下面将介绍构建质粒的步骤。

1. 选择质粒载体:首先需要选择适合的质粒载体。

质粒载体是一种环状DNA分子,可以自主复制并在宿主细胞中表达外源基因。

常用的质粒载体有pUC18、pBR322等。

选择适合的质粒载体需要考虑载体大小、复制起点、抗生素抗性基因等因素。

2. 获得外源DNA片段:外源DNA片段可以是来自其他生物体的DNA序列,也可以是人工合成的。

获得外源DNA片段的方法有PCR扩增、限制性内切酶切割等。

3. 切割质粒和外源DNA:使用限制性内切酶将质粒和外源DNA切割成互补的黏性末端。

确保切割后的DNA末端与质粒载体互补,以便进行连接。

4. 连接质粒和外源DNA:通过DNA连接酶将切割后的质粒和外源DNA连接起来,形成重组质粒。

连接时需要考虑连接缓冲液的条件和酶的适宜温度。

5. 转化宿主细胞:将重组质粒导入宿主细胞中,使其能够复制和表达外源基因。

常用的转化方法有热激转化、电击转化等。

转化后,需要在含有抗生素的培养基上筛选出含有质粒的转化子。

6. 确认质粒的构建:通过PCR扩增、限制性内切酶切割或测序等方法,确认质粒是否成功构建,并验证外源基因是否正确插入。

7. 大规模培养质粒:如果质粒构建成功,可以进行大规模培养,以获得足够的质粒量。

培养条件需要根据质粒载体的特性进行调整。

8. 提取质粒:使用质粒提取试剂盒等方法,从大规模培养的细菌中提取质粒。

提取的质粒可以用于进一步的实验研究或应用。

通过以上步骤,就可以成功构建质粒。

构建质粒是分子生物学研究中常用的技术手段,可以用于基因克隆、基因表达、基因敲除等研究中。

同时,构建质粒也是基因工程和生物工程的重要基础。

20170814 质粒构建流程

20170814 质粒构建流程

20170814质粒构建流程武汉大学Angelo一、引物设计1)取得目的基因序列,可选用数据库NCBI2)软件分析目的基因可用酶切位点。

使用primer5分析出序列不包含的酶切位点,即为可用酶切位点。

3)选择载体。

根据转染细胞和实验室资源,选择合适载体。

如pMSCV,4)选择酶切位点。

对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点,选择二者共有的作为备选。

载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上,选实验室常用酶切位点。

5)使用primer5设计目的基因引物,目的产物应包含从启动子到终止子前的全部碱基。

6)根据选择的酶切位点,查找对应的酶切位点保护碱基,将对应片段添加到设计的引物两端,注意酶切位点的前后顺序。

一般选择三个保护碱基。

7)引物设计完成,送公司合成。

二、目的片段获取方法一:1. RNA提取2. RNA反转录获得目的片段方法二:从韩家淮实验室索取(通常采用)具体流程:1、PCR扩增PCR程序:95℃5min 95℃30s 58℃30s 72℃延伸(根据基因片段大小设定时间)35cycle 72℃5min 22℃保存注:可根据不同基因调节退火温度,延伸时间,循环数。

2、PCR产物纯化1)根据PCR基因的大小配制1%-2%琼脂糖凝胶,放电泳槽里,点样并电泳10-20min2)割胶回收(产物电泳结果含杂带)① 将含目的条带的琼脂糖凝胶切下(切得尽量小),放入1.5ml EP管。

② 加等体积(1g=1ml)GC buffer ,65℃水浴10min左右至胶溶解(溶液为淡黄色),混匀2min,进行试剂盒回收③ 溶液加入回收柱中,12000rpm离心,1min,废液倒回再离一次④ 弃废液,加500μl washing buffer,离心12000rpm,1min ⑤ 弃废液,加500μl PW washing buffer,离心12000rpm,1min ⑥ 空管离心12000g,2min,弃废液,柱子转移到新1.5ml EP 管⑦加入30-50μl elution buffer于硅胶膜上,室温孵育2min,离心13000g,1min标上基因名称,日期⑧电泳检测三、载体和片段双酶切(分开酶切)20μl 反应体系如下片段:PCR纯化产物16μl FD buffer(10×) 2μl 酶A 1μl 酶B 1μl 反应条件:37℃水浴2h 加loading buffer(10×)终止反应注:buffer类别依使用的酶具体选择载体:载体质粒大于1.5ug并补ddH2O至16ul FD buffer(10×) 2μl 酶A 1μl 酶B 1μl 反应条件:37℃水浴2h或以上加loading buffer(10×)终止反应注:buffer类别依使用的酶具体选择四、载体酶切产物回收和纯化片段一般不进行胶回收,只进行回收柱纯化1)一般配制1%琼脂糖凝胶,放电泳槽里,点样并电泳20-30min(琼脂糖凝胶配制:琼脂糖凝胶(1%)30ml 琼脂糖粉0.3g 1×TAE 30ml 微波炉加热溶解,冷却一会儿后加入1μl gold view核酸染料或溴化乙锭(有毒),混匀,倒板,插梭子。

构建质粒详细步骤

构建质粒详细步骤

构建质粒详细步骤在基因工程中,构建质粒是一项基础且关键的任务,以下是构建质粒的详细步骤。

1.目的基因获取首先,需要获取目的基因。

目的基因可以通过引物设计和克隆载体构建的方法获得。

引物设计是根据目标基因的序列,通过软件辅助设计出一对特异性引物。

克隆载体构建则是根据目标基因的特点,选择或构建一个适合的克隆载体,以便于目的基因的获取和后续操作。

2.载体质粒选择在获取目的基因之后,需要选择一个合适的载体质粒。

载体质粒的选择应考虑以下几个因素:质粒来源(如细菌、酵母等)、质粒大小(合适的大小能够确保插入的目的基因稳定存在并且可复制)、质粒序列(序列应清晰、稳定,以确保质粒的准确性)。

3.酶切质粒和目的基因获取到的质粒和目的基因需要进行酶切处理。

这一步骤主要是为了将目的基因插入到质粒中。

通常使用限制性内切酶对质粒和目的基因进行酶切,并且需要控制酶切时间和温度,以确保酶切效果良好且不会对DNA造成损伤。

4.T4DNA连接酶连接酶切后的质粒和目的基因需要通过T4DNA连接酶进行连接。

T4DNA连接酶能够将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来。

在这个过程中,需要控制DNA的浓度、缓冲液的选择、反应温度以及是否过夜连接等条件,以确保连接的有效性和正确性。

5.转化受体细胞连接完成的质粒需要转化入受体细胞中。

常见的受体细胞包括细菌、酵母、昆虫等。

转化过程需要考虑受体细胞的类型、数量、转化效率和筛选策略等因素。

例如,对于细菌转化,需要选择感受态细胞作为受体细胞,并控制转化温度和时间以确保转化效率。

6.克隆筛选及鉴定转化后的受体细胞需要进行克隆筛选和鉴定,以找出含有正确插入目的基因的克隆。

筛选和鉴定可以通过菌液制备、抗体制备、筛选策略和鉴定方法等步骤实现。

例如,可以通过菌落PCR或抗药性筛选策略筛选出阳性克隆,并采用DNA测序等技术对阳性克隆进行鉴定。

7.质粒大量制备最后,需要对筛选出的阳性克隆进行大量制备质粒的操作。

这一步骤通常采用碱裂解法或热法等常规方法制备质粒。

重组质粒的构建

重组质粒的构建

重组质粒的构建实验流程—质粒构建实验操作一、LB培养基配置LB培养基用于一般细菌培养,特别用于分子生物学试验中大肠杆菌的保存和培养。

其中蛋白胨、酵母膏粉提供氮源、维生素和生长因子,NaCl维持均衡的渗透压,葡萄糖提供碳源,琼脂是培养基的凝固剂。

【试剂】胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast Extract)、NaCl、琼脂(Agar)【实验步骤】1、LB固体培养基配方(配置100ml培养基)胰蛋白胨(Tryptone) 1g酵母提取物(Yeast Extract)0.5gNaCl 1g琼脂(Agar)1.5g单蒸水100ml蛋白胨很易吸潮,在称取时动作要迅速,另外,称药品时严防药品混杂,一把药匙用于一种药品、或在称取一种药品后,洗净、擦干,再称取另一种药品,瓶盖也不要盖错。

2、液体培养基除不加琼脂外,其余同固体培养基一样。

3、包扎用报纸封住瓶口,再用皮筋捆扎好,用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

4、灭菌将上述培养基以1.05kg/cm2、121.3℃、20min高压蒸汽灭菌。

如因特殊情况不能及时灭菌,则应放入4℃冰箱内暂存。

灭菌后,将锥形瓶放入烘箱烘干,烘干后,4℃保存。

5、LB固体培养基倒板○1配置:如上述配方配置100ml的LB固体培养基。

○2抗生素的加入:将凝固的培养基放入微波炉内加热至完全融化,然后置于55℃的水浴中,待培养基温度降至55℃时(手可触摸)加入抗生素,以免温度过高导致抗生素失效,并充分摇匀。

○3倒板:一般10ml倒1个板子,培养基倒入培养皿后,打开盖子,在紫外下照10—15min。

○4保存:将培养皿倒置放于4℃保存,一个月内使用。

二、质粒的提取(protocol)1、大肠杆菌的培养:从平板培养基上挑选单菌落接种至5ml的含有抗生素的LB液体培养基中,37℃过夜培养。

【注:培养液不宜过量,过量时会因菌量太大而溶菌不充分,纯化时会影响质粒的纯度。

】2、5ml菌液倒入5ml离心管中,10,000xg,1min离心,弃上清。

构建质粒的基本步骤

构建质粒的基本步骤

(lnc2为例,lnc2分三段连接,GTP1、GTP2、GTP3(具体见文档“lncRNA4构建质粒的基本步骤:和lncRNA2的实验说明”中lnc2的部分))基本流程:设计三个片段的引物(设计时注意载体pcDNA3.1的酶切位点)普通PCR 琼脂糖凝胶电泳后胶回收酶切电泳后胶回收酶连转化涂板挑单菌落(10管)摇菌提质粒酶切初步鉴定测序具体步骤:1、设计引物2、先将GTP1进行普通PCR(三个片段的模板分别为单独连接有该片段的质粒),扩增条件聚合酶的说明书上有,50μl体系。

3、制胶(琼脂糖凝胶),将PCR产物全部上样,电泳(电泳液要新配置)45min左右后放紫外灯下,用干净刀片切出目的片段放置干净EP管,紫外灯每次照射时间不能太长。

4、用胶回收试剂盒回收,具体步骤见说明书。

5、胶回收后,用Nhe I,Kpn I两种酶将胶回收产物和载体pcDNA3.1进行双酶切5小时。

6、制胶,将酶切产物全部上样,跑电泳,胶回收(同步骤3、4)7、配酶连体系(见文档“分子生物学反应体系”),反应条件见连接酶说明书。

一般4℃过夜8、转化,(具体步骤见文档“分子生物学反应体系”)9、挑单菌落,10管,在加有氨苄的LB的试管中培养12~16h,37℃,140rpm.10、小提质粒(具体步骤见质粒提取试剂盒说明书)11、根据片段设计相关酶进行酶切鉴定,刷选出目的质粒,送去测序12、GTP1连上去后,GTP2、GTP3也与上述方法一样进行操作,只是GTP2的载体变为pcDNA3.1-- GTP1,GTP3的载体变为pcDNA3.1-- GTP1-- GTP2,同时相关的双酶切的酶也不同,GTP2片段时用Kpn I,BamHI。

GTP3片段时用BamHI,Xho I。

phage1质粒构建流程

phage1质粒构建流程

phage1质粒构建流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成,希望大家下载以后,能够帮助大家解决实际的问题。

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质粒构建流程

质粒构建流程

质粒构建流程质粒构建是分子生物学实验中常见的一项重要技术,它可以用于基因克隆、蛋白表达、基因编辑等多个领域。

在本文中,我们将介绍质粒构建的基本流程,希望能够帮助大家更好地理解和掌握这一技术。

第一步,设计引物。

质粒构建的第一步是设计引物。

引物是一小段单链DNA,它们的序列与目标DNA的两端相互补。

在构建质粒时,我们需要设计两对引物,分别用于扩增目标DNA的两端。

引物设计的好坏将直接影响到后续的实验效果,因此需要仔细选择引物的序列,确保其具有高度的特异性和稳定性。

第二步,PCR扩增。

设计好引物后,接下来就是进行PCR扩增。

PCR是一种体外合成DNA的方法,通过PCR扩增可以在短时间内获得大量目标DNA。

在PCR反应中,我们需要将待扩增的DNA模板、引物、DNA聚合酶和反应缓冲液混合,然后进行一系列的温度循环,最终得到目标DNA的扩增产物。

第三步,酶切和连接。

获得PCR产物后,接下来需要进行酶切和连接。

酶切是利用限制性内切酶在特定的酶切位点上切割DNA分子,从而得到特定的DNA片段。

在质粒构建中,我们通常会选择两种不同的限制性内切酶,分别用于酶切目标DNA和质粒载体。

然后将酶切后的目标DNA 片段与质粒载体连接,形成重组质粒。

第四步,转化和筛选。

最后一步是将重组质粒转化至宿主细胞中,然后进行筛选。

转化是利用化学方法或电穿孔法将质粒导入宿主细胞内,使其在细胞内进行复制和表达。

然后通过对转化后的细胞进行抗生素筛选或荧光筛选,筛选出含有目标重组质粒的细胞克隆。

总结。

质粒构建是一项复杂而又重要的实验技术,它涉及到许多分子生物学的基本原理和实验操作。

通过本文的介绍,相信大家对质粒构建的流程有了更清晰的认识。

当然,质粒构建的具体操作还需要根据实验的具体要求和目的进行调整和优化。

希望本文能够为大家在质粒构建实验中提供一些帮助和指导。

质粒构建流程1(总7页)

质粒构建流程1(总7页)

质粒构建流程1(总7页)质粒构建是现代分子生物学研究中非常关键的一步。

在细菌中将需要表达的外源基因通过质粒表达,已经被广泛应用于蛋白表达、基因功能分析和疫苗研究等方面。

下面我们将详细介绍质粒构建的流程。

一、质粒选择在进行质粒构建之前,首先要根据实验需求选择适合的质粒。

目前常用的质粒有pUC19、pET系列、pcDNA3.1等。

选择质粒时需要考虑以下因素:1. 质粒大小:不同质粒大小不同,承载的基因段数也不同,需要根据实验需要选择适合的大小。

2. 引物、酶切位点:质粒上的引物和酶切位点需要考虑是否符合实验设计,方便后面的操作。

3. 表达宿主:质粒表达需要宿主细胞,不同宿主细胞适合表达的质粒不同,需要根据实验需要选择适合的宿主细胞。

4. 表达标签:如果需要通过表达检测蛋白质,可以选择带有表达标签的质粒,如His 标签、Flag标签等。

5. 细菌抗性标记:质粒需要选择带有适当的细菌抗性标记,方便后续筛选。

二、PCR扩增目的基因在选择了适合的质粒之后,需要将需要表达的目的基因进行PCR扩增,以得到DNA模板,方便后续质粒构建过程。

PCR扩增需要根据实验目的设计合适的引物,引物需要选择在基因片段两端的序列上。

一般情况下,引物序列长度为18-30bp,并且需要避免序列间存在重复。

此外,引物需要考虑跨越的酶切位点,方便后续克隆操作。

PCR反应体系一般包括模板DNA、引物、Taq DNA聚合酶、缓冲液和dNTPs等。

反应条件为94℃预变性2-5min,94℃变性30s,温度根据引物长度而定,一般为55-65℃,延伸时间1-3min,72℃合成外显子,最后72℃固定3-5min。

扩增反应可以根据需求选择合适的引物、反应体系和行程。

三、酶切质粒酶切质粒是将已有质粒经过酶切后得到的线性化质粒。

酶切需要选择适合的内切酶切割质粒,切割后的末端需要具有互补的序列,以方便后续的连接操作。

酶切反应需要同时加入酶和反应缓冲液,反应条件需要根据不同酶而定。

质粒构建流程

质粒构建流程

质粒构建流程一、引物设计1)取得目的基因序列,可选用数据库NCBI2)软件分析目的基因可用酶切位点。

使用primer5分析出序列不包含的酶切位点,即为可用没切位点。

3)选择载体。

根据转染细胞和实验室资源,选择合适载体。

如pcDNA3.1(+),4)选择酶切位点。

对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点,选择二者共有的作为备选。

载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上,选实验室常用酶切位点。

5)使用primer5设计目的基因引物,目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。

6)根据选择的酶切位点,查找对应的酶切位点保护碱基,将对应片段添加到设计的引物两端,注意酶切位点的前后顺序。

一般选择三个保护碱基。

7)引物设计完成,送公司合成。

二、目的片段获取1. RNA提取试剂盒:Bioteke 高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型(裂解液RL 4℃、漂洗液RW -20℃保存)准备:冰盒、4℃预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套操作步骤:1)将1000μl裂解液RL加入细胞中,混合5min。

2)加200μl氯仿混合,震荡15s,室温孵育3min。

3)4℃,12000rpm离心10min。

4)最上层水相转移至新EP管中(体积约550μl)5)加入1倍体积(550μl)70%乙醇,混匀6)全部转移到套收集管的吸附柱RA中,4℃,10000rpm离心45s7)弃废液,重套收集管,加500μl去蛋白液RE,12000rpm离心45s8)弃废液,重套收集管,加700μl去漂洗液RW,12000rpm离心60s9)弃废液,重套收集管,加500μl去漂洗液RW,12000rpm离心60s10)弃废液,重套收集管,12000rpm空离2min11)吸附柱放入新EP管,加50μl RNase free water于膜上,室温放置2min12)4℃,12000rpm离心60s13)点样:5μl RNA+ 1μl 10×buffer,1.5%琼脂糖凝胶电泳,100V,3min,可见3条亮带。

质粒构建

质粒构建

前期准备工作1、抗生素配制:将抗生素配制成50mg/ml,过滤除菌,分装成500ul/管,-20℃保存。

2、LB固体培养基:胰蛋白胨lOg、酵母提取物5g、NaCll0g加入800ml灭菌水,充分溶解,加NaOH调节pH值至7.0,加灭菌水定容至1L,加入15g琼脂,高压灭菌,按照30~35ml培养基/90mm培养皿铺制平板,40C保存。

3、LB培养基:胰蛋白胨lOg、酵母提取物5g、NaCl10g加入800ml灭菌水,充分溶解,加NaOH调节pH值至7.0,加灭菌水定容至lL,高压灭菌后,40C保存。

4、LB/Amp培养基:胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCll0g,加入800ml灭菌水,充分溶解,加NaOH调节pH值至7.0,加灭菌水定容至1L,高压灭菌后,冷却至室温,加入1mlAmpicillin(100mg/m1)匀,40C保存。

5、LB/Kan固体培养基:胰蛋白胨lOg、酵母提取物5g、NaCl l0g加入800ml灭菌水,充分溶解,加NaOH调节pH值至7.0,加灭菌水定容至1L,加入159琼脂,高压灭菌,冷却至60度,加入lml 卡那霉素(100mg/m1)混匀,按照30~35ml培养基/90mm培养皿铺制平板,40C保存。

6、l%琼脂糖凝胶:琼脂糖O.6g,1×TBE 60ml,煮沸,冷却至60℃后灌胶。

7、无菌水:去离子水高温高压灭菌,分装成1ml/管,-20℃保存。

8、感受态细菌:取大肠杆菌DH5α单菌落到5ml的LB中培养过夜,37℃以1:100转接,250rpm培养至OD0.3~0.4,取1ml预冷菌液到灭菌EP管中,4℃1500rpm 离心5分钟,吸干上清再加入50ul预冷新鲜LB轻轻悬浮菌体,加入50ul 2xTSS 快速轻轻混匀,至冰上30分钟,或者直接冻存于-80℃9、50 x TAE 电泳缓冲液制备:称量Tris 242g,Na2EDTA.2H2O 37.2g于1L烧杯中;向烧杯中加入约800ml去离子水,充分搅拌均匀;加入57.1ml的冰乙酸,充分溶解;用NaOH调pH至8.3,加去离子水定容至1L后,室温保存。

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质粒构建流程一、引物设计1)取得目的基因序列,可选用数据库NCBI2)软件分析目的基因可用酶切位点。

使用primer5分析出序列不包含的酶切位点,即为可用没切位点。

3)选择载体。

根据转染细胞和实验室资源,选择合适载体。

如pcDNA3.1(+),4)选择酶切位点。

对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点,选择二者共有的作为备选。

载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上,选实验室常用酶切位点。

5)使用primer5设计目的基因引物,目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。

6)根据选择的酶切位点,查找对应的酶切位点保护碱基,将对应片段添加到设计的引物两端,注意酶切位点的前后顺序。

一般选择三个保护碱基。

7)引物设计完成,送公司合成。

二、目的片段获取1. RNA提取试剂盒:Bioteke 高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型(裂解液RL 4℃、漂洗液RW -20℃保存)准备:冰盒、4℃预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套操作步骤:1)将1000μl裂解液RL加入细胞中,混合5min。

2)加200μl氯仿混合,震荡15s,室温孵育3min。

3)4℃,12000rpm离心10min。

4)最上层水相转移至新EP管中(体积约550μl)5)加入1倍体积(550μl)70%乙醇,混匀6)全部转移到套收集管的吸附柱RA中,4℃,10000rpm离心45s7)弃废液,重套收集管,加500μl去蛋白液RE,12000rpm离心45s8)弃废液,重套收集管,加700μl去漂洗液RW,12000rpm离心60s9)弃废液,重套收集管,加500μl去漂洗液RW,12000rpm离心60s10)弃废液,重套收集管,12000rpm空离2min11)吸附柱放入新EP管,加50μl RNase free water于膜上,室温放置2min12)4℃,12000rpm离心60s13)点样:5μl RNA+ 1μl 10×buffer,1.5%琼脂糖凝胶电泳,100V,3min,可见3条亮带。

14)-20℃保存2.RNA反转录试剂盒:TaKaRa primescript RT reagent kit with gDNA eraser(-20℃保存)准备:冰盒,②④⑤⑥取出解冻,①③为酶不可取出,预冷离心管操作步骤:1)基因组DNA去除(10μl体系)② 5×gDNA eraser buffer 2μl① gDNA eraser 1μlTotal RNA 4μl(可根据RNA浓度调整)⑥ RNase free water 3μlPCR仪中进行,程序:42℃,2min→4℃注:RNA的量可根据浓度调整,混合液冰上配制,酶最后加入2)反转录反应(20μl体系)④ 5×primerScript buffer 2 4μl③ primerScript RT enzyme mix I 1μl⑤ RT primer mix 1μl⑥ RNase free water 4μl1)反应液10μlPCR仪:37℃,15min→85℃,5s→4℃注:可直接将第2步反混合液好后加入到第1步反应液中3)1.5mlEP管收集,-20℃长期保存3. PCR扩增高保真酶primerstar扩增,50μl5×PS buffer 10μldNTP 4μldH2O 32.5μlPrimerstar 0.5μlcDNA 1μl(可变)R-primer 1μlF-primer 1μl点样:5μl PCR产物+ 1μl 6×buffer,1.5%琼脂糖凝胶电泳,100V,15min4.PCR产物纯化1)液相纯化(产物电泳结果只含目的条带)试剂盒:Microelute cycle-pure spin protocol(OMEGA bio-tek) D6293-01①将PCR产物加入1.5mlEP管,加入5倍体积buffer CP,混匀。

②转移至HiBind MicroElution DNA 柱(套收集管),室温离心10000g,1min。

③弃废液,加700μl DNA wash buffer(含乙醇)到柱子,室温离心10000g,1min。

④弃废液,重复③⑤弃废液,空管离心13000g,1min⑥柱子放入新EP管,加10-20μl Elution buffer到膜上,室温孵育3-5min,离心10000g,1min⑦电泳检测2)割胶回收(产物电泳结果含杂带)①将含目的条带的琼脂糖凝胶切下(切得尽量小),放入1.5ml EP管。

②加等体积(1g=1ml)binding buffer(XP2),60℃金属浴7min左右至胶溶解(溶液为淡黄色),混匀2min③溶液加入离心柱,离心10000g,1min,废液倒回再离一次④弃废液,加300μl binding buffer(XP2),离心10000g,1min⑤弃废液,加700μl SPW washing buffer,离心10000g,1min⑥重复⑤⑦空管离心13000g,2min,弃废液,柱子转移到新EP管⑧加入30-50μl elution buffer于膜上,室温孵育1min,离心13000g,1min⑨ 电泳检测三、双酶切30μl 反应体系如下:PCR 纯化产物 15μl10×M/L/K buffer 3μl3dH2O 10μl酶A 1μl酶B 1μl反应条件:takara 酶30℃水浴1h →65℃金属浴10min 终止反应注:buffer 类别依使用的酶具体选择,见附表四、连接1)双酶切后,可将质粒酶切产物琼脂糖电泳1-2μl2)酶切产物液相纯化3)20μl 连接体系(皆可)PCR 产物 5μlpcDNA3.1 2μl10×T4buffer 2μlT4 ligase 1μl3dH2O 10μlPCR 仪中进行:22℃,30min →4℃冰箱过夜注:连接产物-20℃可长期保存五、转化准备:碎冰,灭菌EP 管、LB 空液体培养基,带抗性培养板,超净工作台,移液枪,水浴锅加热42℃1)将感受态细胞置于冰上,待其融化2)超净工作台中,将连接产物10μl 加入100μl 感受态细胞,或质粒1-3μl 加入100μl 感受态细胞3)轻混匀,冰浴30min4)热击水浴42℃,45s ,冰浴1min5)加900μl LB 空培养基,摇菌150rpm ,37℃,1h6)浓缩离心13000rpm ,1min ,上清液留约200μl 重悬菌体,部分涂板(50-100μl )7)完全吸收后,37℃倒置培养12-16h六、菌落PCR1)以rTaq 酶50μl 体系配制PCR3dH2O 35.7μl 10×buffer 5μl MgCl2 3μl dNTP 4μl rTaq 0.3μl R-primer 1μlF-primer 1μl2)灭菌牙签挑单菌落放入PCR体系中搅一下,再在新板划板(注意编号),每板挑10个菌。

新划的板37℃倒置培养12-16h。

3)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,记录含目的条带的菌落号备用。

七、测序1.摇菌1)PCR检测有目的条带的菌落,挑选2-3个较好的以供摇菌2)三角瓶中分装10ml LB抗性液体培养基3)用10μl 枪头挑起选择的菌落打到培养基中4)37℃。

250rpm摇菌12-16h2.送样每瓶取1ml箘液,送华大基因测序3.比对将测序结果与基因序列进行比对,比对正确则构建成功,比对错误则重新构建。

(注:数据库中基因序列可能有误,若出现少数突变,可换其他数据库比对试试)八、菌种保存菌种比对成功,则可保存菌种备用。

1)超净工作台中取1.5mlEP管,加200μl 80%灭菌甘油。

2)再加入800μl 箘液,轻混匀。

3)液氮冻存。

(一个基因冻2管即可)九、质粒提取菌种比对成功,冻存菌种后,箘液用于提取质粒。

试剂盒:AXYGEN axyprep plasmid miniprep kit 250-prep操作步骤:1)取3-5ml箘液,室温下离心10000g,1min2)弃上清,加250μl solution I/ RNase A 重悬菌落,混匀3)加250μl solution II,倒置轻混匀,孵育2min。

(整个裂解反应不超过5min)4)加入250μl solution III,立即倒置混匀,直到生成白色絮状沉淀。

5)室温离心13000g,10min6)上清液小心转入HiBind miniprep column(有套管),室温离心10000g,1min7)弃废液,加500μl buffer HB,室温离心10000g,1min8)选择性步骤:重复第7步9)弃废液,空管室温离心13000g,2min10)柱子转入新EP管,加30-50μl elution buffer或3dH2O到膜上,室温孵育1-2min11)室温离心13000g,1min12)提取的质粒-20℃保存备用附:感受态制备方法(皆采用LB空白培养基):1. 菌种活化1)用接种环直接取冻存的E.coli/ DH5α菌种,在LB平板上划线,37℃倒置培养16h2)挑单菌落转到2-10ml LB液体培养基中,摇菌37℃,250rpm,12-16h3)取1ml箘液加入到100ml LB液体培养基,摇菌37℃,250rpm,3h4)检测箘液OD600≤ 0.5(0.3-0.4)2.感受态制备准备:0.1M CaCl2灭菌,50ml离心管灭菌,冰水,1.5ml离心管冰上预冷,离心机4℃预冷。

步骤:1)将箘液用50ml离心管分装,调平,4℃离心3000rpm,8min2)弃上清,0.1M CaCl2 10ml重悬(冰水中进行,动作轻),两管合成一管3)冰上放置一段时间,4℃离心2500rpm,8min4)弃上清,0.1M CaCl2 10ml重悬,4℃冰箱过夜沉淀5)上清液取出8ml,剩2ml,加670μl 80%甘油(箘液:80%甘油=3:1),轻混匀6)1.5mlEP管分装,每管分装100μl ,液氮冻存。

试剂配制:1.琼脂糖凝胶(1.2%)琼脂糖粉0.6g1×TAE 50ml微波炉加热溶解,冷却一会儿后加入1μl gold view核酸染料,混匀,倒板2.电泳缓冲液TAE(50×)2mol/L tris-碱242g1mol/L 冰醋酸57.1mlEDTA(pH8.0) 18.622g二蒸水至1L用NaOH调节pH至8.6,常温储存。

用时稀释成1×溶液使用。

3.LB培养基Yeast extract(酵母提取物)1gTryptone 2gNaCl 2gAgar powder(琼脂粉)3g(配1.5%固体培养基时加入)二蒸水200ml灭菌20min,冷却后加入抗生素。

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