(整理)产纤维素酶菌种的筛选与优化.
目录
实验一产纤维素酶菌种的分离与初筛
实验二产纤维素酶菌种的复筛与保藏
实验三酶活测定与传代保藏
实验四产纤维素酶菌种的紫外诱变育种
实验五产纤维素酶菌种的产酶条件优化
实验六产纤维素酶菌种的产酶条件优化的结果分析
实验一产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定
一、实验目的
1．了解产纤维素酶微生物分离的基本原理；
2．掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法。
二、实验原理
自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。这些生物与绿色植物一起构成了这个世界的碳循环。在发酵堆肥中，存在着大量的，耐高温的纤维素分解菌株，但多半都为混合分解，菌种需要：
1.内切型葡萄糖苷酶（endo-1,4-β-D-glucanase,EC3.3.1.4,简称EBG），也称Cx酶、CMC
酶、EG。这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素；
2.外切型葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase,EC
3.2.1.91），也称C1酶、微晶纤维素酶、
纤维二糖水解酶（Cellobiohydrolase,简称CBH）,这类酶从纤维素长链的非还原性末端水解β-1,4-糖苷键，每次切下纤维二糖分子；
3.Β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.21，简称BG）又称纤维二糖酶，它能水解纤维二
糖以及短链的纤维寡糖生产葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快。随着葡萄糖聚合酶的增加水解速度下降，这种酶的专一性比较差。
只有三种酶的协同作用，才能较好的分解纤维素。就单菌落而言，霉菌如木霉、曲霉和青霉的总体酶活性较高，产量大，故在畜牧业和饲料工业中的应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。
本实验以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基，只有能够水解纤维素成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长，利用筛选培养基分离产纤维素酶的微生物。
以羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为唯一碳源，通过微生物分解利用CMC-Na，分离出能产纤维素酶的菌种；
刚果红是一种酸性染料，可与纤维素反应形成红色复合物。
三、实验仪器及试剂
1．材料土样取自学校校门口小树林5—20cm深处；
2．仪器试管、烧杯、移液管、平板、锥形瓶、玻璃珠、电磁炉、电子称、量筒、培养皿、酒精灯、移液枪、接种环、高压灭菌锅等；
3．培养基（1）筛选培养基（500ml）
CMC-Na 10g、(NH4)2SO4 1.4 g、MgSO4 0.3g
KH2PO4 2g、MnSO4 1.6mg、FeSO4 5mg
ZnSO4 2.5mg、CoCl2 2.0mg
琼脂20g PH7.0
（2）保藏培养基（500ml）
CMC-Na 15g、MgSO4 0.5g、K2HPO4 1.5g、酵母粉10g NaCl 5g、蛋白胨15g、琼脂20g、刚果红 PH7.0
四、实验步骤
1.土样采集取自学校校门口小树林5—20cm深处；
2.实验器材灭菌：平板、移液管的包扎及灭菌；
3.无菌水的制备：
量取99ml自来水于250ml锥形瓶中，并放入适量颗玻璃窗珠，塞上棉塞，用牛皮纸包扎，于121?C条件下灭菌20min备用。
量取9ml自来水于试管中，用试管塞塞好，用牛皮纸包扎，于121?C条件下灭菌20min 备用。
4．筛选培养基配制及倒平板：
准确按筛选培养基配方称取各物质溶于1000ml蒸馏水中，调节pH7.0。在高压来菌锅中于121?C高温灭菌20min，取出于无菌环境旧倒平板备用。
5．保藏培养基配制及摆斜面：
准确按筛选培养基配方称取各物质溶于1000ml蒸馏水中，调节pH7.0。分装试管中，在高压来菌锅中于121?C高温灭菌20min，取出摆斜面备用。
6.土样预处理及梯度稀释
（1）样品菌悬液的制备
先取1g样品，加入到99ml含有玻璃珠的无菌水中，震荡几分钟形成悬液。
（2）梯度稀释：
在无菌条件下，用灭好菌的移液管取1ml到装有9ml无菌水的试管中，依次稀释
10 -3、10-4、 10-5、 10-6的梯度备用
7.倒平板涂布
分别取10-4、 10-5、 10-6三个浓度的菌悬液接种到倒好了的平板中，并涂布均匀8.培养、观察、记录
实验二产纤维素酶菌种的筛选与保藏
一、实验目的
1．掌握平板接斜面的操作；
2．掌握筛选原则与选择方法。
二、实验原理
刚果红能和纤维素结合，纤维素酶能水解纤维素，从而使刚果红在产纤维素酶菌株周围结合到纤维素而形成透明圈，从而选择目标菌落。
微生物繁衍具有容易变异的特性，同时微生物的生长一般离不开生长所需的营养、水分、氧气及环境温度等，在营养缺乏、干燥、隔绝空气、温度低等条件下均可使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态而便于保存微生物的特性。
利用微生物的纯培养以确定分离所得的最佳产酶微生物，并进行保存与进一步研究。
通过酶活测定确定初筛菌株的产酶性能；通过培养条件的控制而菌种休眠实现保藏。
三、实验仪器及试剂
1．菌种借用实验室的菌种；
2．仪器试管、烧杯、电磁炉、电子称、量筒、培养皿、酒精灯、移液枪、接种环、旋转式摇床等；
3．培养基摇瓶培养基
CMC-Na10g、(NH4)2SO44.0g、MgSO47H2O 0.5g、K2HPO4 1.5g、牛肉膏2g、蛋白胨4g（PH自然定容到1L）
四、实验步骤
1.在分离产植酸酶黑曲霉的平板上，选择透明圈明显、透明圈直径与菌落直径比值较大的，分离效果最好的单菌落，并做好标记；
2.左手拿平板，右手拿接种环，先将金属环烧灼灭菌，再将接种环在空白培养基处冷却，挑取菌落，在火焰旁稍等片刻。
3.左手将平板放下，拿起斜面培养基。在火焰旁用右手小指和手掌边缘拔下棉塞并夹紧，迅速将接种环伸入空白斜面，在斜面培养基上轻轻划线，将菌体接于其上。划线时由底部向上划一直线，一直划到斜面的顶部。
4.灼烧试管口，在火焰旁将棉塞塞上，接种完毕，接种环上的余菌必须灼烧灭菌后才能放下。
5.培养：倒置于28至30oC恒温箱中，培养3-7d观察结果。
实验三酶活测定与传代保藏
一、实验目的
1．了解纤维素酶总酶活测定原理；
2.掌握纤维素酶活力检测方法；
3．学习传代保藏的操作方法。
二、实验原理
纤维素酶在合适的条件下可以分解纤维素，产生葡萄糖等还原糖，与3,5-二硝基水杨酸显色剂（DNS）作用，可生成橙黄色络物。使用终止反应法，是在恒温反应体系中，每隔一定时间，取出一定体积的反应液，用强酸或强碱或SDS以及加热等使反应立即停止，然后用化学方法放射性化学法或酶偶联法分析产物的形成或底物的消耗量。这是最经典的的酶活力测定方法，几乎所有的酶都可以根据这一原理设计出具体的测定方法。
本实验使用强碱终止分解反应，通过DNS法进行吸光度的测定。根据相应的标准曲线，运用比色法可以推算出反应液中葡萄糖的生成量，进而推算出酶的活力。
酶活的定义：在37o C PH5.5的条件下60min水浴，每分钟释放出1umol的单糖为一个酶活单位。
三、实验仪器及试剂
1.筛选到的菌种
2．仪器：试管、烧杯、电磁炉、电子称、量筒、培养皿、酒精灯、移液枪、接种环、旋转式摇床、分光光度计、恒温水槽、滤纸等；
3．试剂：柠檬酸、柠檬酸钠、柠檬酸缓冲液、葡萄糖、DNS等
四、实验步骤
将筛选到的菌种接入摇瓶，37℃、200转/分下培养3d，制成种子液，取1ml的接种量接入第二次摇瓶培养基中7℃、200转/分下培养。
纤维素酶原酶液的制备方法：取培养液3ml8000r/min离心10min，上清液即为粗酶液。取1ml粗酶液，加9LPH5.0柠檬酸缓冲液，即为稀释10倍原酶液。
1.纤维素酶的测定
还原糖的测定为DNS试剂法，540nm处有紫外光大光吸收峰，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度比例关系，利用比色法测定其还原糖生成量就可测定纤维素酶的活力。（1）纤维素酶活德尔测定
A．按下表比例稀释成不同葡萄糖浓度溶液。
标准序号葡萄糖
蒸馏水/ml DNS/ml OD540nm
标准溶液/ml
0 0 1 2.0
1 0.1 0.9 2.0
2 0.2 0.8 2.0
3 0.3 0.7 2.0
4 0.4 0.6 2.0
5 0.5 0.5 2.0
6 0.6 0.4 2.0
7 0.7 0.3 2.0
8 0.8 0.2 2.0
B．显色反应：在上述试管中分别加入DNS试剂2.0ml，于沸水浴中加热5min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0ml，摇匀，在540nm波长处测定吸光值。以葡萄糖含量（mg/ml）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
（2）滤纸酶活性（FPA）测定
取干净的10ml刻度试管若干，各加入0.5ml稀释10倍的粗酶液和0.5ml0.05mol/L，PH5.0的柠檬酸缓冲液，向对照管中加入0.5mlDNS溶液终止反应。将试管先在50℃水浴中预热10min，在各加入滤纸条50mg，50℃水浴中保温60min后取出，立即向上述试管中分别加入DNS试剂2.0ml，于沸水浴中加热5min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0ml，摇匀，在540nm波长处测定吸光值。
以上酶活测定时间均扣除发酵液中的还原糖后计算，采用国际单位即在上述条件下1min产生1umol葡萄糖为一个活力单位（IU/ml）。
2.菌种传代保藏
将菌种接种到在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2-8℃的冰箱保藏。保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2-4个月，移种一次。
此法为实验室和工厂军追踪室常用的保藏方法，优点是操作简便，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理。化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状，污染杂菌的机会也会较多。
实验四产纤维素酶菌种的紫外诱变育种
一、实验目的
1．了解紫外诱变育种的原理；
2．掌握紫外诱变育种的操作方法。
二、实验原理
诱变育种是指用物理。化学因素诱导动植物的遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符合人们某种要求的单株/个体，进而培育成新的品种或种质的育种方法。它是继选择育种和杂交育种之后发展起来的一项现代育种技术。常规杂交育种基本上是染色体的重新组合，这种技术一般并不引起染色体发生变异，更难以触及到基因。当通过辐射将能量传递到生物体内时，生物体内各种分子便产生电离和激发，接着产生许多化学性质十分活跃的自由原子或自由基团。它们继续相互反应，并与其周围物质特别是大分子核酸和蛋白质反应，引起分子结构的改变。由此又影响到细胞内的一些生化过程，如DNA合成的终止、各种酶活性的改变等，使个部分结构进一步深刻变化，其中尤其重要的是染色体损伤。由于染色体断裂和重接而产生的染色体结构和数目变异即染色体突变，而DNA分子结构中碱基的变化则造成基因突变。那些带有染色体突变或基因突变的细胞，经过细胞世代将变异了的遗传物质传至性细胞或无性繁殖器官，即可产生生物体的遗传变异。获得不可控的突变性状，进而筛选出目的单个/个体。
本实验以紫外线作为诱变剂，通过紫外线照射，使菌种基因发生突变，然后从变异的菌种中选取功能符合要求的菌种，进行培养，得到我们所需的菌种。
三、实验仪器及试剂
1.筛选得到的产纤维素酶菌种
2．电子称、量筒、培养皿、酒精灯、移液枪、接种环、玻璃棒、磁钢、高压灭菌锅、超净工作台、恒温箱等；
3试剂
CMC-Na 20g 、(NH4)2SO4 2.0g 、MgSO47H2O0.5g 、K2HPO4 1.0g
刚果红0.4 g 、琼脂20g （ PH自然定容到1L）
生理盐水
四、实验步骤
10ml无菌蒸馏水，用无菌刮铲轻轻刮下成熟孢子，取1ml孢子悬液进行梯度稀释至10-4，各取0.05ml涂布于筛选培养基平板表面，除对照组外垂直置于20W紫外灯下，20cm 距离，照射时间分别为30s、60s、90s、120s、150s、180s、210s、240s，照射后，置于上述步骤所得的最佳条件下避光3-4d。
1.致死率的研究
选取酶活最高的菌株A1，对其进行紫外诱变，并与对照组参比计算致死率。并测定CMC 光圈与最佳条件酶活验证突变效果，产酶量高于出发菌株10%为正突变，低于出发菌株10%为负突变。
2.菌株稳定性的研究
照射时间s 致死率% 正突变率% 照射时间s 致死率% 正突变率% 0