不同类型细胞培养特点
细胞工程-7 细胞培养的基本概念及培养细胞的生物学特征
一、细胞培养发展简史
• 动物细胞（组织）培养技术起源于1885年，德国人 Roux 用温生理盐水在体外培养鸡胚髓板，并使之 存活了数月之久。 • 动物细胞（组织）培养的奠基人是美国生物学家 Harrison。在1907年采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴 培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，保持存 活了几周时间，并观察到细胞突起的生长过程。 Harrison - - isolated pieces of frog embryonic tissue known to give rise to nerve fibres - grew them in frog lymph - observed outgrowth of axons over period of weeks in 1907.
5，由于细胞培养有可能在同一时期、相同条 件、相似性状的条件下提供大量的实验样 本，所以相对耗资较少，因而也就成为生物 制品、单克隆抗体和基因工程制品生产的 重要手段。
6，细胞和组织生长在人工培养环境中，与体 内环境相比仍然存在一定的差异，培养的 细胞或组织，其形态或功能会发生不同程 度的改变。因此再利用培养细胞做实验对 象时，不能将其与体内细胞完全一样看 待，只能把它们视作一种既保持动物体内 原细胞一定的性状、结构和功能又发生某 些改变的特定的细胞群体。
四、体外培养细胞的分型
根据离体细胞在体外生长时是否贴壁的性 质，将其分为贴壁型与悬浮型两类
正常体内组织细胞类型
四、体外培养细胞的分型
贴壁型(anchorage-dependent cell)
按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型
1)成纤维细胞型 （fibroblast） 2)上皮细胞型 （epithelium） 3) 游走细胞型 （wandering） 4)多形型细胞 （polymorphic）
第二节细胞培养方法及应用实例
配比
分包
疫苗产品
①原始种子——基因重组病毒株 当两种有亲缘关系的不同病毒感染同一宿主细
胞时，它们的遗传物质发生交换，结果产生不同于
亲代的可遗传的子代，称为基因重组。
基因重组病毒有“活病毒基因重组”、“灭活
病毒基因重组”及“死活病毒基因重组”。重组病
毒株原始种子属于死活病毒间的重组。
世卫组织提供的6支甲 型H1N1流感原始毒株
⑷包埋法 包埋就是将细胞包裹在有限空间内，制成固定化细胞。包埋后的细胞
不会扩散到周围介质中去，而底物和产物却能自由扩散。 包埋法仅只是将细胞包埋起来，不与载体发生反应，故包埋法细胞的
活性损失较小。包埋法根据其包埋的形式不同，又可将其分为格子型和微 胶囊型两种。
二、植物细胞培养方法
常见的植物组织细胞培养有愈伤组织培养、原生质体培养、花粉培养
一、动物细胞培养方法
根据动物细胞的生长特点，常见的细胞培养方法有贴壁培养、悬浮培 养及固定化培养等三种方法。
1.贴壁培养
所谓贴壁培养是指细胞贴附在 一定的固相表面（如：培养皿、培 养瓶等）进行的培养。 ⑴生长特性
贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴 壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后 就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。
HGPRT 骨髓瘤细胞
使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞 二者合二为一，得到杂种的骨髓 瘤细胞。这种杂种细胞继承两种
融合
(HAT)培养基
亲代细胞的特性，既具有 B淋巴 细胞合成专一抗体的特性，又有
由于挡板的存在，可有效地减小反应器内液面上的 旋涡。
2.贴壁培养反应器——中空纤维反应器
常见的贴壁培养反应器如：中空纤维反 应器、玻璃珠床反应器、陶质矩形通道蜂窝 状反应器等类型。
细胞培养技术
细胞培养技术一、细胞培养基本概念细胞培养是指从体内组织取出细胞摹拟体内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使期生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。
细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。
在医学遗传学研究中应用最广泛的是外周血淋巴细胞、皮肤或纤维细胞和各种能在体外长期生长的细胞系。
外周血淋巴细胞培养具有时间短、技术简便、可反复取材等优点，它在临床染色体分析中使用最广泛。
体外培养细胞株可在培养过程中发生自发的或在外界作用下的转化，成为永久细胞系，也可直接建成永久细胞系，永久细胞系能在体外无取制的传代和生长。
永久细胞系通常具有非整倍体细胞和各个细胞的核型不完全相同特性。
但细胞克隆的细胞系其这一特性可以不明显。
二、细胞培养的环境细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。
1、无污染环境培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。
当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。
因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。
2、恒定的温度维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。
人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。
培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时，即能受到一定损伤，但仍有也许恢复；在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有也许恢复；41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复也许；当温度在43℃以上1小时，细胞所有死亡。
3、气体环境气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体重要有氧气和二氧化碳。
氧气参与三羧酸循环，产生供应细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。
开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。
第二章细胞培养及培养细胞的特点
生长特点
排列成放射状，漩 涡状，并不紧靠 连成片，细胞— 细胞接触易断开 而单独行动。
游离的单独的成 纤维样细胞，常 有几个伸长的细 胞突起。
体外培养细胞类型（2）——成纤维细胞型
❖ 游走细胞型
❖ 细胞质常伸出伪足或突起，呈活跃的游走 或变形运动， 贴附于支持物上散在生长，一 般不连接成片。该类细胞形状很不稳定，有 时与上皮样细胞 或成纤维细胞难以区别。单 核细胞、巨噬细胞及某些肿瘤细胞在体外培 养时常呈现此种形态。
❖ 多形型细胞
❖ 生长时像神经细胞那样呈多角形，并伸出 较长的神经纤维，很难确定它们的形状，因 而我们将此类细胞称为多形型细胞。体外培 养时常见的多形型细胞是神经元和神经胶质 细胞。
细胞培养：将组织块用机械方法或酶解法分离成单个 细胞，做成细胞悬液，再培养于固体基质上，成单层细胞 生长，或在培养液中呈悬浮状态培养的技术称为细胞培养。
器官培养：所谓器官培养，是指采取某些措施使器官 的原基、器官的一部分或整个器官在体外存活、生长，并 保持其原有结构和功能的培养技术称为器官培养。
体 外 培 养 的 种 类
如：皮肤及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡 上皮性肿瘤
形态：类似体内的上皮细胞 扁平，不规则多角形，中有圆形核
生长特点
易相连成片， 相靠紧密相连， 成薄层铺石状。
生长时呈膜状 移动，很少脱离 细胞群而单个活动
体外培养细胞类型（1）——上皮细胞型
成纤维细胞型
名称：凡在培养中形态与成纤维细内、外的粘附方式：存在差异
体内：粘附是全方位 外形具有复杂的立体特征
第五章 动植物细胞培养
◆ 动物克隆技术的建立
1962年，英国学者Grudon 把非洲爪蟾小肠上皮细胞的 核注入同种或异种非洲爪蟾 未受精卵中，约有1%的重组 卵发育成为成熟蛙。 1997年，哺乳动物克隆 羊多利的诞生。 动物器官克隆为生物医 药材料开辟新。
（三） 动物细胞培养的特性 ◆动物细胞无细胞壁，机械强度低，适应环境能差； ◆生长速度缓慢，易受微生物污染，培养时需要抗生
第二节 动植物细胞的培养
5.2.1 动物细胞的培养 （一） 培养方法
非贴壁依赖性细胞的培养：来源于血液、淋巴组 织的细胞，许多肿瘤细胞（包括杂交瘤细胞）和某些 转化细胞属于这一类型，其可采用类似微生物培养的 方法进行悬浮培养。 贴壁依赖性细胞的培养：大多数动物细胞，包括 非淋巴组织的细胞和许多异倍体体系的细胞属于这一 类型，它们需要附着于适量正电荷的固体或半固体的 表面上生长。
表51动植物微生物细胞的培养特征种类比较项目微生物动物细胞植物细胞大悬浮生长小营养要求生长速率代谢调节环境敏感细胞分化剪切应力敏感传统变异筛选技术细胞或产物浓度110m可以简单快倍增时055小时内部不敏感无低广泛使用较高10100m多数细胞需附着表面才能生长非常复杂慢倍增时间15100小时内部激素非常敏感有非常高不常使用低10100m可以但易结团无单个细胞较复杂慢倍增时间2474小时内部激素能忍受广泛范围有高有时使用低5
（二） ◇
培养方式
分批培养
分批式培养是指先将细胞和培养液一次性装入反应器内进行培养细胞不断 生长，同时产物也不断形成，经过一段时间的培养后，终止培养。分批 培养 过程特征如图5-1。
pH、温度、DO 废产物 条件
营养物 时间 图5-1 动物细胞分批式培养过程的特征
◇ 分批补料式培养
分批补料式培养是指先将一定量的培养液装入反应器，在适宜的条件 下接种细胞，进行培养，而在此过程中随着营养物质的不断消耗，不断地向 系统中补充新的营养成分，直到整个培养结束后取出产物。分批补料式培养 过程的特征如图5-2所示。
细胞工程原理-第一章 动物细胞的培养
（二）合成培养基
主要是指通过人工设计、配制而成的，使用时需 添加一定量血清的一类培养基，可在体外较好用 于动物细胞培养。目前已经设计出适合不同类型 细胞的培养基，如DMEM、TC199等。 优点：创制出与体内相似的生存环境，又便于控 制，实现标准化。
主要成分：氨基酸、糖、无机盐、维生素及其他 辅助物质。
定 1.鉴定指标 ① 纯度： 何种细胞为主 ② 细胞学特征： 细胞形态、结构、染色体组型、生长曲线、分 裂指数、倍增时间等
③ 稳定性：传代过程中，细胞学特征是否发生变化 ④ 污染情况： 是否有微生物和其他细胞系污染
2.鉴定方法
① 细胞形态学观察： 光镜和电镜观察形态特征 ② 绘制生长曲线，计算分裂指数 ③ 进行染色体组型和带型分析 ④ 检测同工酶酶谱
人心肌成纤维细胞 成纤维细胞
人乳腺
（3）游走细胞型
特点：细胞质常伸出伪足或突起，呈活跃的游 走或变形运动，一般不连接成片。 举例：人单核细胞、巨噬细胞以及某些肿 瘤细胞。
人单核细胞
（4）多行型细胞
特点：呈多角形，是一些形态上不规则的细胞 ，不规则形态是由宽扁的胞质突起所致，细胞 一举般 例分 ：胞 神体 经和 元胞细突胞两、部神分经。胶质细胞。
（一）细胞的冷冻保存
细胞超低温保存的基本原理：细胞在-70℃以下时 ，细胞内的酶活性降低，代谢处于完全停止状态 ，故可长期保存。
细胞低温保存的关键：通过-20-0℃阶段的处理过 程。因为在此温度范围内，易造成细胞的严重损 伤，因此，常常在培养液中加入保护剂来减少对 细胞的伤害。
细胞冷冻过程：将对数期细胞用冻存液（DMSO+血 清或者+培养基+血清）、甘油+血清等）重悬，分
（二）建立细胞系、株
培养细胞的细胞生物学(体内外细胞差异与体外培养细胞的分型、生
培养细胞的细胞生物学（体内外细胞差异与体外培养细胞的分型、生一、体内、外细胞的差异和分化1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。
因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。
实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。
虽然体外细胞与机体细胞存有差异，但并未失去研究的意义。
且不论其有许多性状仍与体内相同（如体外培养的心肌细胞仍可博动），只从细胞遗传学（Cyto－genetics）的角度看，离体细胞仍带有全套的二倍体基因。
细胞在培养中的表现，只不过是相应基因关闭／开启引起的现象，这并非是绝对缺陷。
恰恰相反，在培养的细胞中某些特定功能的丧失，可为该基因的表达与调控提供线索。
2、分化；体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的政变，细胞分化的表现和在体内不同。
细胞是否表现分化关键在于是否存在使细胞分化的条件，如 Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。
二、体外培养细胞的分型（一）贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能接体内组织学标推判定，仅大致分成以下四型：1、成纤维细胞型：胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。
除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。
另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。
2、上皮型细胞：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。
微生物、动物、植物细胞培养的异同点
微生物、动物、植物细胞培养的异同点如下：不同点：首先在培养基上，微生物是固体、半固体培养基都有，成分主要是水、无机盐、生长因子、碳源、氮源等。
如果是病毒的话要用细菌进行培养；动物的话用天然培养基加生长因子比较好，一般是液体培养基，成分主要是水、葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清；而植物培养基用合成培养基就可以了，一般是固体培养基，成分主要是矿质元素、蔗糖、纤维素、植物激素、有机添加剂。
其次是各自培养的原理上的不同，微生物细胞培养的原理是微生物细胞的增殖，动物细胞培养的原理是细胞的增殖，植物细胞培养原理是细胞的全能性。
最后，微生物细胞培养主要是获得其代谢产物或次级代谢产物或得到细胞本身；植物细胞培养主要是获得新个体或细胞产品，应用与快速繁殖试管苗、细胞产品、人工种子、转基因植物的培育等。
动物细胞培养是获得大量新生细胞或细胞产品，应用是获得细胞的产物或细胞等。
另外，动物细胞分散用到的是胰蛋白酶，植物是纤维素酶等。
相同点：两者都需要培养基、都需要无菌操作，防止染菌、培养时候都需要适当的温度等条件。
综上所述见下表：微生物动物细胞植物细胞大小(um) 1~10 10~100 10~100 悬浮生长可以，多数细胞需附着表面才能生长可以，但易结团无单个细胞营养要求简单非常复杂较复杂生长速率快，倍增时间为0.5~5小时慢，倍增时间为15~100小时慢，倍增时间为24~74小时代谢调节内部内部激素内部激素环境敏感不敏感非常敏感能忍受广泛范围细胞分化无有高剪切力敏感低非常高高传统变异，筛选技术广泛使用不常使用有时使用细胞或产物浓度较高低低由于他们所用的培养基不同，培养是所要求的条件不同所以在批量生产我们所需的目的产物时就要选择相应的生物反应器。
在选择生物反应器时要注意到生物反应器在生物反应过程的剪切力、传质问题如气-液质量传递和液-固质量传递。
生物反应器是利用生物催化剂为细胞培养（或发酵）或酶反应提供良好的反映环境的设备，通常称为发酵罐或酶反应器。
常用的五种动物细胞培养方式
•一、半连续式培养1.半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。
采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养形式。
在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。
这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基，让其生长至一定的密度，在细胞生长至最大密度之前，用新鲜的培养基稀释培养物，每次稀释反应器培养体积的1/2~3/4，以维持细胞的指数生长状态，随着稀释率的增加培养体积逐步增加。
或者在细胞增长和产物形成过程中，每隔一定时间，定期取出部分培养物，或是条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出，然后补加细胞或载体，或是新鲜的培养基继续进行培养的一种操作模式。
剩余的培养物可作为种子，继续培养，从而可维持反复培养，而无需反应器的清洗、消毒等一系列复杂的操作。
在半连续式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量，经过几次的稀释、换液培养过程，细胞密度常常会提高。
2.半连续式特点：·培养物的体积逐步增加；·可进行多次收获；·细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。
该操作方式的优点是操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。
在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。
二、连续式培养1.连续式培养是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。
该模式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。
理论上讲，该过程可无限延续下去。
2.连续培养的优点是反应器的培养状态可以达到恒定，细胞在稳定状态下生长。
稳定状态可有效的延长分批培养中的对数生长期。
在稳定状态下细胞所处的环境条件如营养物质浓度、产物浓度、pH值可保持恒定，细胞浓度以及细胞比生长速率可维持不变。
各种细胞培养基的区别及应用
各种细胞培养基的区别及应用细胞培养基是用于体外培养细胞的一种重要介质，它可以为细胞提供生长所需的营养物质、生长因子、激素等。
根据不同的需求和应用领域，细胞培养基有很多种类和特点。
本文将对细胞培养基的区别及应用进行详细介绍，以帮助大家更好地了解和选择合适的细胞培养基。
一、细胞培养基的概述细胞培养基的发展历程可以追溯到上世纪50年代，随着生物科学研究的不断深入，细胞培养技术得到了广泛应用。
细胞培养基的研究和应用不仅为生物学基础研究提供了有力支持，还为医学、农业、工业等领域创造了巨大价值。
二、细胞培养基的区别1.基础培养基与专用培养基基础培养基：含有细胞生长所需的基本营养物质，如糖、氨基酸、维生素等，适用于大多数细胞的培养。
常见的基础培养基有DMEM、RPMI-1640、MEM等。
专用培养基：针对特定类型的细胞设计，具有较高的特定成分和较窄的营养成分范围，可以满足某些细胞对特定营养物质的需求。
如HEK293细胞培养基、MCF-7细胞培养基等。
2.天然培养基与合成培养基天然培养基：来源于动物血清、血浆等天然物质，含有丰富多样的生长因子、激素等，具有较高的生物活性。
常见的天然培养基有FBS（胎牛血清）、ABC（人血清）等。
合成培养基：通过化学合成或重组技术制备，成分明确、可定制。
可以根据细胞需求添加不同的生长因子、激素等，具有较高的可控性。
如MED64培养基、Synthemax培养基等。
3.液体培养基与固体培养基液体培养基：含水量较高，细胞在其中可以自由悬浮和生长。
常见的液体培养基有DMEM/F12、RPMI-1640等。
固体培养基：在液体培养基中添加固体成分，如琼脂、纤维素等，使细胞可以在固体表面附着生长。
常见的固体培养基有agarose、matrigel等。
4.不同种类的细胞对培养基的需求不同种类的细胞对培养基的需求不同，例如：- 淋巴细胞培养：需要较高浓度的氨基酸、维生素和血清；- 神经细胞培养：需要添加神经营养因子、生长因子等；- 肿瘤细胞培养：需要较高浓度的糖和血清。
植物细胞培养
1、连续培养的特点 （1）由于不断加入新鲜培养基，保证了养分的充 分供应，不会出现悬浮培养物发生营养不足的现象。 （2）可在培养期间使细胞保持在对数生长期中。 细胞增殖速度快。 （3）适于大规模工业化生产。
2、连续培养的种类
封闭式连续培养：系统中的细胞数目不断增加。
开放式连续培养：系统中的细胞密度保持恒定。
二、培养类型和方法
（一）成批培养 指把细胞分装在一定容积的培养基中进行培养， 当培养物增殖到一定量时，转接继代，建立起单细 胞培养物。它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生 化研究常用的培养方法。
1、成批培养法
（1）细胞生长在固定体积的培养基上，直至培养基中的 养分为细胞耗尽为止。 （2）用适当搅拌的方法增加和维持游离细胞和细胞团在 培养基中的均匀分布。 （3）在整个培养过程中，细胞数目会不断发生变化，呈 现出明显的慢-快-慢，最后增长停止的细胞生长周期。 （4）成批培养结束后，若要进行下一批培养，必须另外 进行继代培养，其方法是用注射器吸取一定量的含单细胞 和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养 瓶里，继续进行培养。
细 胞 数 目 静止期 缓慢期
直线生长期
对数增长期
延滞期
时间
细胞生长周期
（二）半连续培养
指每隔一定时间后倒出一半的悬浮液， 并同时补充加入等量新鲜培养液。能重复 地取得大量、均一的培养细胞，供生物研 究之用。
（三）连续培养
是利用特制的培养容器进行大规模细胞培 养的一种方式。 在培养过程中，以不断抽取悬浮培养物并 注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分 补充，保持其恒定体积的培养。
封闭型连续培养：在培养过程中，排除的旧培养基 由加入的新鲜培养基进行补充，进出数量保持平衡， 从而使培养系统中营养物质的含量总是超过细胞生 长的需要。 悬浮在排除液中的细胞经机械方法收集后再放回培 养系统中，因此在这样培养方式中，随着培养时间 延长，细胞密度不断增加。
贴壁细胞和悬浮细胞的特点
贴壁细胞和悬浮细胞的特点一、引言在细胞培养领域，贴壁细胞和悬浮细胞是两种常见的细胞类型。
它们在生长方式和特点上存在显著的差异。
本报告将详细分析这两种细胞类型的特点，并通过实例说明它们在应用中的优劣。
二、贴壁细胞的特点1. 贴壁依赖性：贴壁细胞在培养过程中需要附着在培养瓶或培养皿的壁上才能生长。
2. 生长速度慢：相对于悬浮细胞，贴壁细胞的生长速度通常较慢。
3. 形态各异：贴壁细胞的形态因种类和生长条件的不同而异，可以呈现为扁平、立方体、柱状或不规则形状。
4. 附着依赖性：贴壁细胞的生长和存活依赖于与培养瓶或培养皿的接触，这可能导致细胞的遗传特性和表型表达发生变化。
实例分析：以肺癌细胞为例，贴壁肺癌细胞在培养过程中需要附着在培养瓶的壁上才能生长，且生长速度较慢。
通过对贴壁肺癌细胞进行基因表达分析，发现与悬浮肺癌细胞相比，贴壁肺癌细胞的基因表达谱存在明显的差异。
这表明贴壁状态可能会影响细胞的生物学特性。
三、悬浮细胞的特点1. 悬浮生长：悬浮细胞在培养过程中不需要附着在固定的表面上，而是在培养液中自由悬浮生长。
2. 生长速度快：相对于贴壁细胞，悬浮细胞的生长速度通常较快。
3. 形态相似：悬浮细胞的形态相对较为一致，一般呈圆形或球形。
4. 遗传稳定性：悬浮细胞在培养过程中不易发生遗传特性和表型表达的变化。
实例分析：以肝癌细胞为例，悬浮肝癌细胞在培养过程中不需要附着在培养瓶的壁上，而是在培养液中自由悬浮生长。
通过对悬浮肝癌细胞进行基因表达分析，发现与贴壁肝癌细胞相比，悬浮肝癌细胞的基因表达谱较为一致，且遗传稳定性较高。
这表明悬浮状态可能有利于维持细胞的生物学特性。
四、总结观点综上所述，贴壁细胞和悬浮细胞各有其特点。
贴壁细胞在形态和生物学特性上具有较高的多样性，但生长速度较慢且容易受到环境因素的影响。
悬浮细胞则具有较高的生长速度和遗传稳定性，但在形态和生物学特性上相对较为一致。
选择使用哪种类型的细胞主要取决于研究目的和研究领域的需求。
动物细胞组织培养及分类
生长特点
易相连成片 相靠—紧密相连—成
薄层—铺石状
生长时呈膜状移动 很少脱离细胞群而单
个活动
成纤维细 胞样细胞
名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似 的
来源：由中胚层间充质组织起源的组织 如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮 形态：似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出2—3个长短不等的突起 中有卵圆形核
正常细胞)
生长特点
排列成放射状，漩涡状 并不紧靠连成片， 细胞—细胞接触易断开而
单独行动 游离的单独的成纤维样细
胞， 常有几个伸长的细胞突起
贴附生长 型--类型
一．与体内同名的细胞不完全相同
○ 如：形态相似的成纤维细胞，可不同来源 ○ 自同一动物不同组织的成纤维样细胞相似但
发展趋向不同
二．培养细胞的形态不稳定
○ 粘附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有粘附 于固相表面才能生存的细胞
01
添加标题
类型
02
添加标题
细胞在体内、外的粘附方 式：存在差异
03
添加标题
体内：粘附是全方位
04
添加标题
外形具有复杂的立体特征
05
添加标题
体外：多数情况，细胞只 有一个附着平面
06
添加标题
外形一般与体内时明显不 同
07
添加标题
按照培养细胞的主要形态， 可分为几大类型
1 分类
3 上皮样
5
其它，不定型
根据形态大致的不同，
2
主要2类：
4
成纤维细胞样
上皮样细胞 型
名称：仅形态上似体内，实际上不完全等于- 来源：来源于外胚层，内胚层细胞 如：皮肤及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡 上皮性肿瘤 形态：类似体内的上皮细胞 扁平，不规则多角形，中有圆形核
第六章 植物细胞培养
平板培养为分离、筛选单细胞无 性系提供了一个有效方法
第五节 植物细胞大规模培养 生产次生代谢物质
Production of Secondary Metabolites by Large-scale Culture of Plant Cells
一、 植物次生代谢和次生代谢产物
（一）次生代谢和次生代谢产物 初生代谢：为维持植物正常的生长发育所 必须的代谢，如呼吸作用、光合作用、 蛋白质和氨基酸代谢、核酸和核苷酸代 谢、脂肪代谢、激素代谢等。初生代谢 过程中形成的各种产物称为初生代谢产 物。初生代谢产物不稳定，在体内容易 发生转化。
植物细胞全能性的证明
2. 筛选变异体：在生产中，人们总是希望 获得具有某些抗性的品种，如抗病、抗 虫、抗盐碱、抗铝、抗除草剂等。通常 的方法是在大量的植株中进行选择。这 种方法不仅工作量大，而且效率低。细 胞培养技术为突变体的筛选提供了快速 有效的方法。在一个培养皿中，一次可 以筛选20万个细胞。 将具有抗性的细胞 挑选出来以后，进行培养、再生，即可 获得抗性植株。
匀桨
过滤
培养
外植体
振荡
液体培养 愈伤组织
振荡
培养上清液
继代培养
液体培养
愈伤组织(callus)是一群无明显组织分化、 分裂能力强的细胞。它是植物受到创伤后或 在植物激素的诱导下形成的。
分化(differentiation)——形态、结构和功 能相同的细胞变成形态、结构和功能互 不同的细胞的过程，如分生组织细胞转 变成薄壁组织、维管组织、厚壁组织等。 脱分化(dedifferentiation)——已分化、成 熟的细胞（一般不再分裂）重新恢复分 裂能力的过程。外植体形成愈伤组织的 过程就是脱分化的过程。 再分化 (redifferentiation)——愈伤组织形 成其它组织或器官的过程
第二章动物细胞培养的基本知识
培养细胞分化状态的变化
体内细胞--三方面的影响与调节: 体外环境的影响 体内神经—体液因素 的调节 细胞与局部微环境的相互作用
控制-- 维持着细胞的分化特征。
体外培养时， 失去了-分化特征逐渐减弱
去分化(脱分化): 各种分化细胞，逐渐失去各自的形态与 功能“个性”，表现出某种趋同性 如:培养的成纤维细胞 在适当刺激下， 可分化为 其它结缔组织细胞和肌组织细 胞，表现出类似未分化的间充质细胞的 特性，‘返祖’ 。
3、游走细胞型
常具有胞质突起（伪足），呈散在生长， 一般不连成片，呈活跃游走或变形运动， 方向不规则。此型细胞不稳定，有时难 以和其他细胞相区别。
单核巨噬细胞系统的细胞
4、多形细胞型
细胞一般分胞体和胞突两部分，胞体为 细长型，似丝状伪足。
有一些细胞，如神经细胞难以确定其规 律和稳定的形态，可统归于此类。
接触抑制和密度依赖性生长仰制
运动的接触抑制
密度依赖性生长仰制
增殖的密度抑制 实验 方 法 ： 3T3 细 胞 ， 接 种 105 于 6cm 培 养 皿 ，
5d细胞计数
于 加 入 10 ％ 、 20 ％ 、 30 ％ 牛 血 清 的 培养液中，结果：
结果：
①10％血清： 20hr后铺满 以后至5d 细胞数不再增加(细
胞 数约106／6cm皿)
30%血清： 以后经常换液至5d，细胞密度继续增加 (可达6xl06／6cm皿)
说明: 密度抑制---铺满后不再增殖(分裂停 止)血清可降低密度抑制
只加入于3T3停止生 长的培养液中 细胞不生长
○ 当再加入血清 细胞又生长
说明 血清可消除密度抑制
(2)转化细胞的密度抑制降低
措施（因素）
不同细胞对培养基的组分的要求
不同细胞对培养基的组分的要求
不同细胞对培养基的组分有不同的要求，这取决于细胞类型和生长特性。
以下是一些常见细胞类型对培养基组分的要求的例子：
1. 细菌细胞：
-碳源：细菌通常需要碳源来进行能量和生物合成。
-氮源：氨基酸或无机氮化合物用于蛋白质合成和细胞增殖。
-矿物质和微量元素：提供必需的矿物质和微量元素，例如镁、铁、钙等。
2. 哺乳动物细胞：
-基本营养物质：哺乳动物细胞通常需要含有葡萄糖、氨基酸、维生素和矿物质的培养基。
-生长因子和激素：某些细胞类型需要额外添加生长因子（如表皮生长因子、胰岛素样生长因子等）和激素来促进细胞增殖和特定功能的表达。
-血清或替代物：大多数哺乳动物细胞需要血清中的成分或替代物来提供必要的生长因子、蛋白质
和激素等。
3. 昆虫细胞：
-蛋白酶抑制剂：昆虫细胞对蛋白酶敏感，因此培养基中常添加蛋白酶抑制剂以防止细胞损伤。
-脂质和类固醇：某些昆虫细胞类型需要额外的脂质和类固醇来满足其生长和代谢需求。
4. 植物细胞：
-碳源：植物细胞通常使用蔗糖、葡萄糖或其他碳源作为能源和碳供应。
-植物生长调节剂：培养植物细胞时，通常需要添加植物生长调节剂，如植物激素（如生长素、激动素）和维生素等。
这只是一些示例，不同细胞类型有不同的要求。
因此，在培养不同类型的细胞时，需要根据其特定需求和生理特性来优化培养基的配方。
细胞培养分类
细胞培养分类“嘿，同学们，今天咱们来聊聊细胞培养分类这个事儿啊。
”细胞培养呢，主要有下面这几种分类。
首先就是原代细胞培养，这就好比是直接从生物体中获取的细胞进行培养。
比如说，咱们从一只小鼠身上取下它的肝细胞，然后在合适的条件下进行培养，这就是原代细胞培养啦。
这种培养的好处呢，就是能最大程度地保持细胞的原始特性，就像刚从生物体中出来一样，很“新鲜”。
再来说说传代细胞培养。
打个比方吧，原代细胞培养一段时间后，细胞数量增多了，我们把它们分成小份，再继续培养，这就是传代啦。
像一些细胞株，就是经过多次传代培养出来的。
比如著名的海拉细胞系，它就是从一位叫海瑞塔·拉克斯的患者身上提取出来的癌细胞，经过长期的传代培养，被广泛应用于各种研究中。
还有干细胞培养。
干细胞可是很神奇的哦，它们具有自我更新和分化的能力。
就像孙悟空一样，能变出很多不同的“模样”。
比如胚胎干细胞，可以分化成各种不同类型的细胞。
这在再生医学领域可是有着重要的应用前景呢。
另外呢，还有悬浮细胞培养和贴壁细胞培养。
悬浮细胞呢，就像是在培养液中“自由自在”地漂浮着，不需要依附在什么东西上。
像淋巴细胞很多就是悬浮培养的。
而贴壁细胞呢，它们需要附着在培养器皿的表面才能生长，比如成纤维细胞。
实际应用中呢，我们会根据不同的研究目的和需求来选择不同类型的细胞培养。
比如说，如果我们想研究一种药物对肝脏细胞的影响，那可能就会选择原代肝细胞培养。
要是想研究细胞的分化过程，那可能就会用到干细胞培养啦。
总之，细胞培养分类有很多种，每一种都有它独特的特点和用途。
大家在学习和研究过程中，要根据具体情况来选择合适的细胞培养方法哦。
常用饲养细胞的种类
常用饲养细胞的种类细胞培养是生物学研究和生物技术应用中常用的一项技术。
在细胞培养中，选择合适的细胞种类是至关重要的。
不同类型的细胞具有不同的特征和应用领域。
本文将介绍几种常用的饲养细胞种类。
1. Hela细胞Hela细胞是最常用的细胞系之一。
它是从一个宫颈癌患者的肿瘤中分离出来的。
Hela细胞具有极高的增殖速度和稳定的染色体特征，适合进行大规模的细胞培养和药物筛选实验。
此外，Hela细胞在人类疾病研究和病毒培养中也有广泛的应用。
2. HEK293细胞HEK293细胞是人胚肾细胞的一种细胞系。
它是经过改造的细胞系，具有较高的转染效率和蛋白表达能力，适用于大规模生产重组蛋白和病毒载体。
HEK293细胞也常用于研究蛋白质互作、信号转导和细胞生物学等领域。
3. CHO细胞CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞的缩写，是一种常用的哺乳动物细胞系。
CHO细胞具有较高的生长速度和蛋白表达能力，被广泛应用于生物药物的生产和病毒载体的制备。
CHO细胞还可以进行基因工程改造，使其能够更好地适应大规模培养和蛋白质表达的需求。
4. Vero细胞Vero细胞是非洲绿猴肾细胞的一种细胞系。
Vero细胞具有较高的增殖速度和感染性，是许多病毒的理想宿主细胞。
Vero细胞广泛应用于病毒培养、疫苗生产和病毒学研究等领域。
此外，Vero细胞还可以用于细胞毒性和药物筛选实验。
5. 3T3细胞3T3细胞是小鼠成纤维细胞的一种细胞系。
3T3细胞具有较高的增殖速度和稳定的染色体特征，适用于细胞增殖、细胞周期和细胞迁移等研究。
此外，3T3细胞还可以用于肿瘤形成、细胞衰老和基因突变等实验。
6. PC12细胞PC12细胞是来自大鼠肾上腺髓质的一种细胞系。
PC12细胞具有神经样特征，可分化为类似神经细胞的表型。
PC12细胞广泛应用于神经生物学研究、神经细胞分化和神经递质合成等领域。
此外，PC12细胞还可用于毒性测试和药物筛选实验。
细胞培养是现代生物研究和生物工程领域中不可或缺的技术手段。
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【饲细胞】饲细胞(Feeder Cells)也称滋养
细胞，是一层经过射线照射或丝裂霉素伤害处理 的、用作克隆细胞附着底物的细胞层。
饲细胞作用：
有同化营养液的能力死亡，换液时清除。
饲细胞的制备：
(1)取原代培养的人或动物胚胎成纤维细胞，90% 汇合时制成细胞悬液，再按103 细胞/毫升重新接 种培养； (2)在细胞半汇合时，准备0.25μg/ml 的丝裂霉素， 按2ug/105 细胞的量加入到培养瓶中过夜；或用 射线单次照射，剂量30～50 戈瑞(Gy)； (3)细胞经上述处理后，Hanks 液漂洗两次、更换 培养液、再培养24 小时，胰蛋白酶消化细胞制成 悬液，按5×104/ml接种入新培养基中； (4)48 小时后，即可用于细胞克隆之用。
(1) 无菌解剖动物，取出肝脏，先用BSS 洗除血污； (2) 取5ml 注射器一支，吸取消化液后，把注射器头轻轻插入肝 管中，用线绳结扎牢固，以防消化液漏出，轻轻把消化液注 入胆管系统，并不时轻柔压肝脏，以便消化液进入肝小叶中； 消化液在肝内停留20~ 30 分后，在吸出消化液的同时并轻柔 压肝脏，以使肝细胞脱落和消化液吸出；
培养中只有源于外和内胚层的细胞能反映出上
皮细胞的特征，细胞呈膜状生长的特点。
上皮细胞培养有三个难点：
①需求特殊底物，如在底物上涂有胶原底层则 利于细胞生长； ②需求特殊培养基； ③与上皮细胞相邻的成纤维细胞常与上皮细胞 同时混杂生长，并常压过上皮细胞。
纯化和延长上皮细胞生存期是上皮细胞培养
(5) 接种：末次离心后加入含有1％ ~ 2％胎牛 血清的完全培养基，接种入不同孔数的培养 板中；接种量依不同实验目的而定。
细胞接种后一般在16
小时内贴壁，细胞呈 多角形，成岛状或片状生长，以后逐渐联接 成片。初代培养可维持2 ~ 3 周，第一周末 达高峰，最后逐渐衰退剥落。
(三) 肝细胞培养
(2) 移入1:1 的0.1％胰蛋白酶和0.1％胶原酶(都用无钙 镁BSS 配制) 中，4℃冷消化10 ~ 12 小时后，通过 250 微米和64 微米尼龙网或不锈钢纱网滤过(用纱布 滤过亦可)； (3) 收集细胞、BSS 液洗1 ~ 2 次、计数、接种培养；
3．肝脏灌流法：
需用全肝，以较小动物如小鼠和大鼠为好。
(3) 待吸净消化液后，注入离心管中，低
速离心分离，用RPMI 1640 培养基培
养(较其它培养基为好)，能获得较纯的
肝上皮细胞和获较好的效果。
(四) 内皮细胞培养
应用材料：
人脐带脐静脉、动物大动脉等， 用灌流消化法获取细胞最为简便。
(1)取产后的新鲜脐带；如不立即培养可保存 于4℃中，但不宜超过12 小时；无菌剪取 长10 ~ 15 厘米一段。 其它如胚胎和幼体动物的大血管，亦可用 于培养； (2) 先用三通注射器吸温PBS 液注入脐带的脐 静脉中，洗除残血；注入口处宜用线绳结 扎，以防液体返流；
(3) 用血管钳夹紧脐带一端，从另端向脐静脉中 徐徐注入最终浓度为0.1％的胶原酶，待末端 出现液体后结扎之，令充满血管，注入口亦 应结扎，以防液体返流，消化3 ~10 分钟；
的关键之一。
(一)表皮细胞培养 1．特点：
在有胶原的底物上易生长； 把人或小鼠表皮细胞培养在以3T3 细胞为饲养层(用射线照射
后)上时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。
降低pH、Ca2+的含量和温度等，均利于表皮细胞生长。 向培养基中加氢化可的松(10 μg/m1)、10-6M的异丙基肾上 腺素(Isoproterenol) 和10 ng/m1 促表皮生长因子(EGF) 能 促表皮细胞生长。
培养程序：
(1) 取材：取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端非病 变区粘膜少许； (2) 清洗：用含庆大霉素(400μg/m1)和两性霉素 (2μg/m1 的Hanks)液漂洗后，用钝器剥离下粘膜， 剪成1mm大小； (3) 消化：在I 型胶原酶和透明质酸酶中，于37℃中消 化80 分钟； (4) 离心：收集细胞悬液，800 转/分离心后，Hanks 液漂洗两次；
第六章 个别细胞和组织的培养
类型： 正常细胞培养
肿瘤细胞培养
第一节 正常细胞培养
正常细胞，在体外培养时都不易生长，建
立细胞系更难。
正常细胞难培养的原因是它们是分化的细
胞，对体外生存条件要求严格.
但只要一切条件适当仍有培养成功可能。
一、上皮细胞类培养
上皮细胞可来源于外、内、中三个胚层；
(5) 温消化：取出表皮单独处理；用剪刀剪成更小的块后， 置入新的0.25％胰蛋白酶中，37℃再消化30 ~ 60 分钟； (6)制细胞悬液：用吸管轻轻反复吹打，使成细胞悬液； (7) 加培养液：通过80 目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸 上清，直接加入Eagle 液和20％小牛血清. (8)培养：接种入碟皿中，CO2 温箱培养。
注意事项：冷消化目的在于使表皮和真皮结合
松散；如冷消化后分离下来的表皮膜自身也已 松散，此时亦可直接置入PBS 中用吸管吹打
制备细胞悬液；不再经过第二次消化。
(二) 胃上皮细胞培养
适于胃上皮细胞生长的条件是：
①胶原酶和透明质酸酶消化法并用消化细胞；
②应用胶原底物培养；
③制备含有特定成分的培养基；
肝脏具有取材方便和易于生长的优点，能获
得典型上皮细胞培养。 1．初代组织块培养：
肝组织做组织块培养效果很好。取新鲜肝脏，
先剥除被膜和血管等纤维成分，用刀或剪刀 把肝剪成1mm3 左右的小块，采用贴壁培养 法。肝组织易于贴壁，生长力好，一般次日 即可出现生长晕。
2．初代消化法培养：
(1) 把肝组织切成2 ~ 4 立方毫米的小块，用不合钙镁 的BSS 液洗两次；
2．表皮细胞培养程序：
(1) 取材：取外科植皮或手术残余皮肤小块，以角化层薄者为佳， 早产流产儿皮肤更好，切成0.5 ~ 1cm2小块； (2) EDTA 处理：先置入0.02％ EDTA 中室温置5 分钟。 (3) 冷消化：换入0.25% 胰蛋白酶中，置4℃过夜；
(4) 分离：取出皮块，用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开；