PCR引物设计
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第7章 PCR引物设计
上机操作7
【实验名称】 PCR引物设计 【实验目的】 掌握引物设计的基本要求，掌握使用软件 Oligo6.0进行引物设计，掌握使用软件 Bioxm2.6 进行酶切位点分析。 【实验器材】 Oligo 6.0软件，Bioxm2.6软件，NCBI 数据库
• 实验原理
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸 片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物设计 总体上包含三个程序：序列下载，引物设计筛选， 特异性分析。
PCR引物的设计原则：
① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ② 产物不能形成二级结构。 ③ 引物长度一般在15~30碱基之间。 ④ G+C含量在40%~60%之间。 ⑤ 碱基要随机分布。 ⑥ 引物自身和互相之间不能有连续4个碱基的互补。 ⑦ 引物5′端可以修饰，引物3′端不可修饰。 ⑧ 引物 3’端的碱基要求严格配对
DraI (1260) DraI (1274) Nco I (1322)
EGFP
XhoI (2054) Sac I (2061) Not I (2331) H indIII (2063) Eco RI (2070)
MCS
Pst I (2079) Sal I (2080) K pnI (2090) Bam H I (2101) Xba I (2113)
实验步骤
1、从NCBI数据库中下载水稻CDPK1基因的序列（2238bp）， 2、向Oligo6.0程序导入模板序列:复制序列后在Oligo软件的序 列展示窗口粘贴，oligo会自动去除非碱基字符。当序列输入或 粘贴完成后，点击Accept/Discard菜单中的Accept浮动命令，即 可进入引物设计模式。 3、开始引物设计：在基因的之间设计一对扩增产物长度在 1500-1800bp左右的引物，两头加上合适的酶切位点便于连入表 达载体（见后一张PPT的图）。 具体步骤自己整理并在报告上写清楚。
Terminator 1
实验结果
1、写出该基因的酶切位点分析情况 2、写出设计引物的序列，用下划线表示出酶切位 点。 3、引物设计的最终结果图黏贴到实验报告：PCR 产物、上游引物和下游引物的长度，Tm值、 GC%，及上下游引物所在的位置。 4、上游引物间，下游引物间及上下游引物间形成 二聚体和发卡结构的图黏贴到实验报告.
•
•
•
Nde I (185) DraI (4188) Sca I (4091) Age I (430)
35S Promoter
Amp
35S Promoter
DraI (3496) DraI (3477)
pSAT6-EGFP-C1
4597 bp
Eco RV (1089) NhomakorabeaTranslational enhancer
上机操作7
【实验名称】 PCR引物设计 【实验目的】 掌握引物设计的基本要求，掌握使用软件 Oligo6.0进行引物设计，掌握使用软件 Bioxm2.6 进行酶切位点分析。 【实验器材】 Oligo 6.0软件，Bioxm2.6软件，NCBI 数据库
• 实验原理
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸 片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物设计 总体上包含三个程序：序列下载，引物设计筛选， 特异性分析。
PCR引物的设计原则：
① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ② 产物不能形成二级结构。 ③ 引物长度一般在15~30碱基之间。 ④ G+C含量在40%~60%之间。 ⑤ 碱基要随机分布。 ⑥ 引物自身和互相之间不能有连续4个碱基的互补。 ⑦ 引物5′端可以修饰，引物3′端不可修饰。 ⑧ 引物 3’端的碱基要求严格配对
DraI (1260) DraI (1274) Nco I (1322)
EGFP
XhoI (2054) Sac I (2061) Not I (2331) H indIII (2063) Eco RI (2070)
MCS
Pst I (2079) Sal I (2080) K pnI (2090) Bam H I (2101) Xba I (2113)
实验步骤
1、从NCBI数据库中下载水稻CDPK1基因的序列（2238bp）， 2、向Oligo6.0程序导入模板序列:复制序列后在Oligo软件的序 列展示窗口粘贴，oligo会自动去除非碱基字符。当序列输入或 粘贴完成后，点击Accept/Discard菜单中的Accept浮动命令，即 可进入引物设计模式。 3、开始引物设计：在基因的之间设计一对扩增产物长度在 1500-1800bp左右的引物，两头加上合适的酶切位点便于连入表 达载体（见后一张PPT的图）。 具体步骤自己整理并在报告上写清楚。
Terminator 1
实验结果
1、写出该基因的酶切位点分析情况 2、写出设计引物的序列，用下划线表示出酶切位 点。 3、引物设计的最终结果图黏贴到实验报告：PCR 产物、上游引物和下游引物的长度，Tm值、 GC%，及上下游引物所在的位置。 4、上游引物间，下游引物间及上下游引物间形成 二聚体和发卡结构的图黏贴到实验报告.
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Nde I (185) DraI (4188) Sca I (4091) Age I (430)
35S Promoter
Amp
35S Promoter
DraI (3496) DraI (3477)
pSAT6-EGFP-C1
4597 bp
Eco RV (1089) NhomakorabeaTranslational enhancer