酶工程第1章酶活性单位及其测定方法

1 分光光度法
（spectrophotometry）
硝酸还原酶将NO3－ 还原成NO2－，NO2－ 与加
入的显色剂对－氨基苯磺酸和α －萘胺反应生成玫 瑰红色的偶氮化合物，在520nm处比色可测定产物 的生成量。一些脱氢酶以NAD+或NADP+为辅酶， NAD+ 或NADP + 在340nm处光吸收很少，而其还原
物，测产物的放射性强度。此法灵敏度高，但分
离产物较麻烦。若底物或产物中有一种是气体或
沉淀，就易于分离。
5 电化学方法
（electrochemistry）
① pH测定：对于某些酶促反应过程中会产生H＋ 或减少H＋的反应来说，用1/1000 pH单位精度的pH 计测定反应液的pH变化，或为保持pH不变而加入 酸或碱，记录一段时间内加入的酸碱量。 ② 电位测定：在一些酶促氧化还原反应中，底物 和产物具有不同的氧化还原电位，可用由一恒定微 电流极化的两个铂电极之间的电位差来测定电位变 化。 ③ 电流测定：以恒定电压的两个铂电极测电流 变化。
国际酶活性单位
1961年，国际酶学会议为酶活性单位规 定了一个统一的标准，即在特定的条件下 （一般为酶催化反应的最适条件），1分钟转 化1μ mol底物，或转化1μ N底物有关基团所
需的酶量为1个国际单位（IU）。
Katal
1972年，国际酶学委员会提出了一个新 的酶活单位，叫katal（kat），katal是一个很 大的酶活单位，1 katal是指1秒钟转化1mol底 物，或转化1N底物有关基团所需的酶量。
一、酶活性单位
酶活性指的是酶制剂催化能力的大小，它既与 酶分子的浓度（量）有关，又与酶分子催化能力的 大小（质）有关。人们规定一定的催化能力为一个 酶活性单位。液体酶制剂的酶浓度用单位体积酶制 剂所含的酶活性单位来表示，即u/ml。对于固体状
态的酶制剂，其酶含量可用单位质量酶制剂所含的
酶活性单位来表示，即u/mg。
酶的纯度往往用比活性来表示，比活性是
用同一酶制剂的酶活性除以蛋白质的质量，即 单位质量蛋白质所具有的酶活性，常用的单位 为u/mg protein。酶制剂的比活性越高说明酶 的纯度越高。
例题
分子量为20,000的20μ g纯酶在最适条件下催 化反应的速度为0.3μ mol/min，计算此酶制剂的比 活力。
第一章 酶活性单位 及其测定方法
一、酶活性单位 二、酶活性测定的主要方法
酶的活性
在酶的分离纯化、性质研究以及酶制剂的生产
和应用时，都要遇到对酶的活性、纯度及含量进行
经常的、大量的测定工作，这是必不可少的指标。 要研究某种酶，首先必须建立起该酶活性的测 定方法。 酶活性是指酶催化一定化学反应的能力，检查 酶的含量及存在，通常是用该酶在一定条件下催化 某一特定反应的速度，即酶的活性来表示。
6 化学分析法
（chemical analysis）
酶促反应一段时间后，取出一部分反应液，
用化学方法分析底物或产物的量。如ACC合成酶
的产物ACC的测定：加HgCl2终止反应，加
NaOCl-NaOH混合液使ACC转化成乙烯，再用气 相色谱测乙烯。
1-氨基环丙烷-1-羧酸 （ACC）
1 katal＝6×107 IU
实用单位
对不同的酶采用不同的定义。
DNA聚合酶Ⅰ的单位：在特定反应条件下，30
分钟内催化10nmol dNTP合成为TCA（三氯乙酸） 不溶物所需的酶量。 T4 DNA连接酶的单位：在20μ l反应体积中， 16℃，30分钟内，将50%的Hind Ⅲ酶切的λ DNA
形式NADH和NADPH在340nm处光吸收较大，因
此可以测定340nm处的光吸收变化来检测NADH和 NADPH的生成或减少，从而得知脱氢酶的活性。
乳酸脱氢酶催化的反应
乳酸脱氢酶来自百度文库
2 旋光测定法
（polarimetry）
若底物和产物的旋光性不同，可通过测定
反应混合物的旋光性（方向和大小）变化来测
1000 0.3 15 μmol/min/mg protein 20
U/mg protein
二、酶活性测定的主要方法
温度、pH、离子强度（I=(1/2)Σ CZ 2 ）等因 素对酶活性有很大的影响，测定酶活性时一般采 用最适环境条件。若酶催化反应时需要辅助因子， 应加入最适量的辅助因子。底物浓度应采用零级 反应时的底物浓度，这时反应速度只与酶浓度有 关，而与底物浓度无关。随着反应的进行，产物 浓度越来越高，而底物浓度越来越低，导致反应 速度下降，所以测酶活性时应测反应的初速度， 即反应开始后较短一段时间内的反应速度（反应 了的底物不超过5%）。
片段重新连接起来所需的酶量。
ACC合成酶的单位：30℃，1小时转化SAM（硫 腺苷甲硫氨酸）生成1nmol ACC（1-氨基-1-羧基环丙烷）所需的酶量。
转换数
在标准条件下，每摩尔单体酶或每摩尔催化 中心在1分钟内转换底物成产物的mol数，可表示 为：
1/Kp为一个催化循环，单位为分钟。
比活性
定酶活性。
3 荧光法
（fluorescence）
氧化态的黄素（flavin）化合物发出强烈的荧
光，还原态失去荧光。NAD + 和NADP+ 无荧光，
而NADH和NADPH有460nm蓝色荧光。荧光法灵
敏度高。
4 同位素测定法
（isotope determination）
用放射性同位素标记底物，酶反应后分离产