凋亡与自噬

凋亡与自噬研究进展
讲座内容•凋亡与自噬的基本概念•凋亡与自噬相关信号通路•凋亡与自噬的相互转化•凋亡与自噬的检测
凋亡与自噬的基本概念•程序性细胞死亡(Programmed Cell Death, PCD)，是指细胞接受某种信号或受到某些因素刺激后，为了维持内环境稳定而发生的一种主动性消亡过程。

它既出现在个体正常的发育过程中，也出现在非正常生理状态或疾病中；既在体内发生，也发生在体外培养物中。

•凋亡和自噬性死亡是程序性死亡的表现形式
凋亡与自噬的基本概念•细胞凋亡的概念最初是由Kerr 等于1972 年在“凋亡：一个在组织动力学方面广泛存在的基本生命现象”一文中提出的。

1980 年Wyllie 等人对细胞凋亡进行了形态学上的描述。

所以，细胞凋亡是一种形态学上的概念，描述细胞在一定生理条件下，像秋天的树叶或花瓣一样悄悄死亡的悲惨情景，借助希腊的“apoptosis”一词来表示
凋亡的多重机制•Caspace依赖型细胞凋亡
①死亡受体途径；②内质网压力途径；③线粒体途径•Caspase 非依赖型细胞凋亡
包括Bcl 家族蛋白质Bax 诱导的细胞死亡，也涉及到其他蛋白酶，如钙蛋白酶、蛋白酶体及丝氨酸蛋白酶的细胞死亡。

Nature Review in Cell Biology, 8:741-752
改变，释放细胞色素C到胞浆，核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA降解成为约180bp-200bp片段；胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞膜结构仍然完整，最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个凋亡小体，无内容物外溢，因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。

产生的不同长度的DNA片段约为180-200bp的整倍数，而这正好是缠绕组蛋白寡聚体的长度，提示染色体DNA恰好是在核小体与核小体的连接部位被切断，产生不同长度的寡聚核小体片段，实验证明，这种DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果，该酶在核小体连接部位切断染色体DNA，这种降解表现在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱，而坏死呈弥漫的连续图谱。

是在细胞凋亡时高表达一种分子，再如在糖皮质激素诱导鼠胸腺细胞凋亡过程中，加入RNA合成抑制剂或蛋白质合成抑制剂即能抑制细胞凋亡的发生。

凋亡的观察和检测
•1）△ψm dissipation（线粒体跨膜电位的消失）：TMRM发红色荧光，DiOC6（3）发绿色荧光。

•2）Phosphatidylserine Externalization（磷脂酰丝氨酸外翻）：Annexin V-FITC（绿色）染细胞膜
•3）检测线粒体产生的ROS：无荧光的HE（hydroethidine，氢化乙啶）可被ROS氧化为EthBr（ethidium bromide，溴乙啡啶），发红色荧光。

NAO（nonyl acridine orange，烷化吖啶橙，可发荧光）能与非氧化的cardiolipin（心磷脂，可被ROS氧化）反应而失去荧光。

•4）线粒体IMS蛋白的释放：AIF，细胞色素c，分别用荧光二抗染色。

•5）Capase 3a 染色：用荧光二抗染色，胞浆弥散分布。

•6）细胞膜完整性检测：DAPI（蓝色）、Hoechst 33342或PI（红色）染核。

胞膜完整的细胞（活细胞和早中期凋亡细胞）排斥，可联用
annexin V。

自噬的主要过程
Nature Review in Cell Biology, 8:741-752
自噬的主要特征
•近年来在大量的生物体中发现存在一种称为自噬性死亡的死亡方式。

自(体吞)噬是胞质溶胶和细胞器被隔离到双层膜的小泡中，由此运送到溶酶体/空泡中降解，并使因此
形成的大分子进行再循环的一个过程。

自噬出现在许多真核细胞，但自噬性细胞死亡不是多细胞生物体唯一的特征。

•通过超微结构特征而鉴定的自噬的形态学特征表现在如下几个方面：
①高尔基体和内质网等细胞器膨胀；
②胞质无定形，核碎断、固缩；
③形成大量吞噬泡(由粗面内质网包围将要被吞噬的底物，随后与初级溶酶体结合形成)；
④细胞质膜失去特化，可能发生细胞膜出泡现象。

自噬的主要特征
•1）自噬是细胞消化掉自身的一部分，即self-eating，初一看似乎对细胞不利。

事实上，细胞正常情况下很少发生自噬，除非有诱发因素的存在。

这些诱发因素很多，也是研究的热门。

既有来自于细胞外的（如外界中的营养成分、缺血缺氧、生长因子的浓度等），也有细胞内的（代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等）。

由于这些因素的经常性存在，因此，细胞保持了一种很低的、基础的自噬活性以维持自稳。

•2）自噬过程很快，被诱导后8min即可观察到自噬体（autophagosome）形成，2h后自噬溶酶体（autolysosome）基本降解消失。

这有利于细胞快速适应恶劣环境。

•3）自噬的可诱导特性：表现在2个方面，第一是自噬相关蛋白的快速合成，这是准备阶段。

第二是自噬体的快速大量形成，这是执行阶段。

自噬的主要特征
•4）批量降解：这是与蛋白酶体降解途径的显著区别
•5）“捕获”胞浆成分的非特异性：由于自噬的速度要快、量要大，因此特异性不是首先考虑的，这与自噬的应急特性是相适应的。

•6) 自噬的保守性：由于自噬有利于细胞的存活，因此无论是物种间、还是各细胞类型之间（包括肿瘤细胞），自噬都普遍被保留下来
自噬的功能•自噬有以下功能：
①细胞营养缺乏时营养的动员；
②细胞间分化；
③细胞死亡及老化；
④阻止癌症的发生。

自噬与凋亡的区别与鉴定•很多试剂在肿瘤细胞系中能引起细胞死亡，通过使用caspase 抑制剂和自噬抑制剂能鉴定其为何种死亡方式，如内抑制素诱导的细胞死亡方式没有被caspase 抑制剂阻止，但是却被自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤所抑制。

As2O3 诱导的细胞死亡也只被自噬抑制剂巴弗洛霉素A1 抑制而不被普通的caspase 抑制剂阻断。

自噬与凋亡的区别与鉴定
(a)Normal,
(b)Autophagy
(c)Apoptosis
(d)Necrosis
自噬与凋亡的区别与鉴定
自噬与凋亡的区别与鉴定
Trends in Molecular Medicine Vol.15 No.3
自噬的研究方法
正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的工具药有：（一）自噬诱导剂
1）Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激
2）Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）
3）Earle's平衡盐溶液：制造饥饿
4）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂
5）Rapamycin：mTOR抑制剂
6）Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂
自噬的研究方法
（二）自噬抑制剂
•1）3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K）hVps34 抑制剂
•2）Bafilomycin A1：质子泵抑制剂
•3）Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶体腔碱化剂）
•除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。

自噬诱导药物
Nature Reviews Drug Discovery 2007，6, 304-312
自噬的观察和检测
•常用的策略和技术有：
•1）观察自噬体的形成
•由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。

Phagophore的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。

自噬体（AV1）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。

自噬溶酶体（AV2）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。

（autophagic vacuole，AV）
•2）在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成：
•由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。

无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。

自噬的观察和检测
•3）利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成：
•自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。

•（Note：LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。

方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。

）
•在研究自噬相关蛋白时，需对其进行定位。

由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切，为了区别，常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位：
•Lamp-2：溶酶体膜蛋白，可用于监测自噬体与溶酶体融合。

•LysoTrackerTM 探针：有红或蓝色可选，显示所有酸性液泡。

•pDsRed2-mito：载体，转染后表达一个融合蛋白（红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号），可用来检测线粒体被自噬掉的程度
（Mitophagy）。

MitoTraker探针：特异性显示活的线粒体，荧光在经过固定后还能保留。

•Hsp60：定位与线粒体基质，细胞死亡时不会被释放。

•Calreticulin（钙网织蛋白）：内质网腔
凋亡与自噬相关信号通路
凋亡相关信号通路
DNA损伤与凋亡Oxidative metabolism
DNA replication
Environmental
–UV and γ-radiation
–carcinogens
–anti-neoplastic Rx
M.Ljungman / Mutation Research 577 (2005) 203–216
DNA 损伤与凋亡
/nrc/journal/v9/n12/images/nrc2745-f1.jpg
/nri/journal/v5/n3/images/nri1568-f5.jpg
FOXO与凋亡
/cgi/content-nw/full/120/15/2479/FIG3
FOXO与凋亡
Oncogene27, 2276-2288 (7 April 2008)
凋亡与蛋白乙酰化
自噬相关信号通路
诱导自噬的各种信号通路
Molecular Cell, Volume 40, Issue 2, 22 October 2010
Beclin-1的调节网络
Cell Death Differ. 2011 Apr;18(4):571-80.
自噬与肿瘤的关系
•与凋亡（在肿瘤细胞中一般都存在缺限）不同，自噬是被优先保留的。

无论是肿瘤细胞还是正常细胞，保持一种基础、低水平的自噬活性是至关重要的。

因为细胞中随时产生的“垃圾”（破损或衰老的细胞器、长寿命蛋白质、错误合成或折叠错误的蛋白质等等）都需要及时清除，而这主要靠自噬来完成，因此，自噬具有维持细胞自稳的功能；如果将自噬相关基因突变失活，如神经元会发生大量聚集蛋白，并出现神经元退化。

同时，自噬的产物，如氨基酸、脂肪酸等小分子物质又可为细胞提供一定的能量和合成底物，可以说，自噬就是一个“备用仓库”。

自噬与肿瘤的关系
•鉴于自噬的上述作用，自噬可为肿瘤细胞带来几大好处：•肿瘤细胞本身就具有高代谢的特点，对营养和能量的需求比正常细胞更高，但肿瘤微环境往往不能如意，会出现营
养不足或供应中断，而此时提高自噬活性可以有助于度过这一危机。

•当化疗、放疗后，肿瘤细胞会产生大量的破损细胞器、损坏的蛋白质等有害成分，而此时提高自噬活性可及时清除这些有害物质，并提供应急的底物和能量为修复受损DNA 赢得时间和条件。

•由于自噬减少了肿瘤细胞在代谢应激时发生坏死的机会，而对于肿瘤细胞群体而言，需要一部分细胞发生坏死，以引发适度的炎症（有利于血管的长入、吸引免疫细胞分泌生长因子等）。

研究发现，很多类型的肿瘤在代谢应激时会“组成性”活化PI3K信号以抑制自噬（由于凋亡通路已受阻，抑制自噬会促进坏死），但具体机制尚不清楚。

自噬与肿瘤
Nature 446, 745-747(12 April 2007)
自噬与上游信号通路
/news/report/2009/p53.html
自噬与上游信号通路
自噬与肿瘤治疗
Nature Reviews Cancer ,2005, 5, 726-734
选择性自噬
Cancer Research,2010, 9, 3431-3434
自噬在代谢中的作用
自噬在代谢中的作用
AGING, Vol 1, No 12, pp 961-970
自噬在代谢中的作用
Nature Cell Biology(2010) 12, 842-846
自噬在心脏中的作用
Cell Death and
Differentiation (2009) 16,
31–38
自噬与免疫
Nature Reviews Immunology
2007，7, 767-777
自噬与免疫
Trends in Molecular Medicine Vol.15 No.3
自噬与免疫
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自噬与免疫
Nature Medicine,16:28–30(2010)
自噬与神经退行性疾病。