CTAB法提取植物DNA
CTAB法提取植物总DNA
关于CTAB法提取基因组DNA，原理CTAB法原理CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。
在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。
通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
CTAB提取缓冲液的经典配方Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，在于液相中；CTAB 溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。
用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。
蛋白分子溶于酚相，而DNA 溶于水相。
使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解作用。
缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA。
2.不能完全抑制RNase的活性。
氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。
最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。
（酚易溶于氯仿中）用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。
异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。
另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
ctab法提取dna实验报告
ctab法提取dna实验报告CTAB 法提取 DNA 实验报告一、实验目的掌握 CTAB 法提取 DNA 的原理和操作方法，提取高质量的植物或微生物 DNA，为后续的分子生物学实验（如 PCR、基因测序等）提供纯净的 DNA 样本。
二、实验原理CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子去污剂，在高离子强度的溶液中能与核酸形成复合物，并通过离心将其与蛋白质、多糖等杂质分离。
随后，用乙醇或异丙醇沉淀 DNA，使其从溶液中析出。
三、实验材料与试剂1、实验材料选取新鲜的植物叶片（或微生物培养物）。
2、实验试剂CTAB 提取缓冲液：2% CTAB，14 M NaCl，20 mM EDTA，100 mM TrisHCl（pH 80），02% β巯基乙醇（使用前加入）。
氯仿异戊醇（24 ： 1）异丙醇70% 乙醇TE 缓冲液（10 mM TrisHCl，1 mM EDTA，pH 80）四、实验仪器与设备1、高速冷冻离心机2、恒温水浴锅3、移液器4、涡旋振荡器5、微量紫外分光光度计五、实验步骤1、材料处理植物材料：取新鲜植物叶片约 2 g，用液氮速冻后研磨成粉末。
微生物材料：收集一定量的微生物培养物，离心收集菌体，用无菌水洗涤后重悬。
2、加入提取缓冲液将研磨好的植物粉末（或重悬的微生物）迅速转移至离心管中，加入预热至 65℃的 CTAB 提取缓冲液，充分混匀，65℃水浴保温 30 60 分钟，期间不时轻轻颠倒混匀。
3、抽提加入等体积的氯仿异戊醇（24 ： 1），涡旋振荡 10 15 分钟，使其充分混匀，然后 12000 rpm 离心 10 15 分钟。
4、转移上清用移液器小心吸取上清液至新的离心管中，避免吸取中间的蛋白质层。
5、 DNA 沉淀向上清液中加入 06 07 倍体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温放置10 20 分钟，使 DNA 沉淀。
6、离心收集12000 rpm 离心 10 15 分钟，弃上清。
7、洗涤用 70% 乙醇洗涤沉淀 2 3 次，每次离心 5 10 分钟，弃上清。
CTAB法提取植物基因组DNA
CTAB法提取植物基因组DNACTAB法原理CTAB（Cetyl trimethyl ammonium bromide），十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸的特性。
当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，CTAB-核酸的复合物从溶液中沉淀，通过离心就可将其与蛋白，多糖类物质分开，在经过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质。
最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，不能沉淀核酸。
CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
另外，它还能保护DNA不受内源核酸酶的降解。
主要试剂与溶液的配制：PVP（聚乙烯吡咯烷酮K30）巯基乙醇氯仿︰异戊醇（24︰1）异丙醇70%乙醇Tris-苯酚RNaseA无水乙醇CTAB 溶液：CTAB——20g/LNaCl（58.44）——1.4 mol/L（81.816g）EDTA（292.25）——10 mmol/L（2.9225g）Tris（121.14）——100 mmol/L（12.114g）pH 8.01×TE 缓冲液：EDTA（292.25）——1 mmol/L（0.29225g）Tris（121.14）——10 mmol/L（1.2114g）pH 8.0NaAC溶液：NaAC（82.03）——3mol/L（246.09g）pH 4.0植物总DNA的提取1、取适量甘薯新鲜叶片，用液氮迅速研磨，中间加PVP（聚乙烯吡咯烷酮K30）少许，成粉末后转入10mL的离心管中，放入液氮或-80℃冰箱储存（在研磨样品时，研的细和研的粗，提出的DNA量可以相差几倍，所以，在液氮保护的很好的情况下尽量多研磨几次）。
提取植物DNA方法
提取植物DNA方法提取植物DNA的方法有许多种，下面将介绍其中几种常用的方法。
1. CTAB法CTAB法（Cetyltrimethylammonium Bromide法）是一种经典的植物DNA 提取方法，适用于多种植物样本。
其基本步骤如下：（1）取植物样本，如叶片、茎等，将其研磨成细碎的粉末。
（2）将粉末加入含有CTAB（一种能溶解细胞膜的表面活性剂）的提取缓冲液中，加入蛋白酶K（能降解蛋白质）和β-巯基乙醇（能还原核酸）。
（3）在65下进行细胞破裂和DNA溶解。
（4）通过氯仿/异戊醇提取和乙醇沉淀的方法，将DNA从混合物中分离出来。
（5）最后用纯净水洗涤DNA，使其得以纯化。
2. 高盐法高盐法属于常规的DNA提取方法，适用于大部分的植物样本。
基本步骤如下：（1）取捣碎的植物材料加入含有高盐浓度的提取缓冲液中，并加入蛋白酶K和β-巯基乙醇。
（2）在室温下进行混合，并在高温下（如65）进行DNA的溶解。
（3）通过氯仿/异戊醇提取和乙醇沉淀的方法，将DNA分离和纯化出来。
（4）最后用纯净水洗涤DNA，使其得以纯化。
3. 磁珠法磁珠法是一种相对快速、高效的DNA提取方法，基于磁珠与DNA之间的亲和力。
该方法需要使用一些商业化的提取试剂盒，操作过程相对简单，适用于大规模样本的提取。
基本步骤如下：（1）将植物样本加入含有提取缓冲液和蛋白酶K的试管中，同时加入磁珠试剂。
（2）在高温下进行DNA的溶解和蛋白质的降解。
（3）将混合物与磁珠结合，并使用磁力架将DNA磁珠复合物分离出来。
（4）对磁珠复合物进行洗涤和溶解，获得纯化的DNA。
4. 二硫苏糖盐法二硫苏糖盐法是一种用于植物材料中DNA提取的改良方法，适用于纤维素含量较高的植物样本。
基本步骤如下：（1）将植物材料加入二硫苏糖盐提取缓冲液中，加入蛋白酶和β-巯基乙醇。
（2）对细胞质进行破裂和溶解，使DNA释放到溶液中。
（3）通过异丙醇的加入，将DNA从混合物中分离和沉淀。
CTAB法原理
CTAB法原理(植物DNA提取经典方法)原理：CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。
在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
一、CTAB提取缓冲液的经典配方：Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。
二、CTAB提取缓冲液的改进配方：(1) PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA 中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖；(2) 蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性(SDS、异硫氰酸胍等)高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离，纯化；(3)多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。
用多糖水解酶将多糖降解。
在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。
用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500 μL DNA液中加入200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl)，冰浴20min.核酸分离，纯化；(4) 多酚的去除:在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合；(5) 盐离子的去除：70%的乙醇洗涤核酸吸附,沉淀和溶解使用合适的吸附材料吸附核酸，其它的杂质均被洗掉，达到纯化DNA的目的另一种方式加入1/10体积的NaAc(pH5.2,3M)，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后应用70%的乙醇洗涤，以除去盐离子等若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE 中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解。
CTAB法提取植物总DNA
CTAB法提取植物总DNA
实验原理
CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。
在高离子强度的溶液中(>0.7mol/LNaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
采用机械破碎植物细胞，然后加入CTAB分离缓冲液将DNA溶解出来，再经氯仿－异戊醇抽提除去蛋白质，最后得到DNA。
实验步骤
1. 取1-50g新鲜植物材料，于液氮中研成粉。
2. 将冻粉转入预冷的离心管中，立即加入等体积(w/v) 2×CTAB提取缓冲液，65℃保温10-20分钟，其间不时摇动。
3. 加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒离心管混匀，室温下，12000r/min 离心10-20分钟。
4. 将上清液转入另一离心管中,加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒离心管混匀，室温、12000r/min 离心10分钟。
5. 将上层水相转入新的经硅烷化处理的离心管中，加入0.6-1倍体积的异丙醇,混匀，室温下放置30分钟。
6. 3500-4000r/min 离心5-10分钟，去上清液, 70%乙醇漂洗，沉淀吹干。
7. 风干后加入40ul的TE缓冲液溶解DNA，-20℃保存备用。
8. 取2ul溶液电泳检测。
注意事项
所有操作均须温和，避免剧烈震荡。
CTAB法提取植物DNA
清洗
• 将上清液再次离心，去除其中的杂质和蛋白质。 将得到的上清液转移到新的离心管中。
DNA的纯化与溶解
在上清液中加入等体积的异丙醇，混 匀后放置一段时间，使DNA沉淀下来。
将清洗后的DNA晾干，然后加入适量 的TE缓冲液溶解DNA。此时可以得到 高质量的植物DNA样品，可用于后续 的实验或保存备用。
利用ctab法提取的DNA进行遗传多样性 分析，有助于了解植物种群的遗传结构和 演化历程。
在植物育种中的应用
分子标记辅助育种
利用ctab法提取的DNA进行分子标 记辅助育种，能够快速准确地鉴定优 良基因型，提高育种效率。
转基因育种
通过ctab法提取的DNA可以用于构建 基因，为转基因育种提供重要的 基因资源。
DNA浓度测定
根据DNA溶液的吸光度值，计算DNA的浓度。
DNA完整性评估
通过电泳检测DNA片段的大小和完整性，评估DNA的质量。
04 ctab法提取植物DNA的 应用与展望
在植物遗传研究中的应用
基因定位
通过ctab法提取的DNA可用于基因定位 ，确定基因在染色体上的位置和功能。
VS
遗传多样性分析
实验过程中的安全注意事项
实验操作安全
在实验过程中，应遵循实验室安全规定，避免交 叉污染和意外事故的发生。
防护措施
佩戴实验服、手套、口罩等防护用品，确保实验 操作人员的安全。
化学品使用
正确使用和处理实验过程中涉及的化学试剂，避 免对实验操作人员造成伤害。
实验结果的判定与评估
DNA纯度检测
通过紫外分光光度计检测DNA溶液的A260/A280值，判断DNA 的纯度。
参考文献3
CTAB法提取植物DNA的步骤包括将植 物组织研磨成粉末，加入预热的缓冲 液和CTAB，混合均匀后进行离心，取 上清液加入乙醇沉淀，离心后取出 DNA进行洗涤和干燥。在提取过程中 需要注意避免交叉污染和样品间的混 淆。
CTAB法提取植物DNA和RNA
1)取0.1~0.2 g幼叶片放入液氮预冷的研钵液氮种研磨成粉。
加入含有65℃预热的1 000 μl CTAB裂解液和20 μlβ-巯基乙醇的2 ml离心管中，65℃水浴裂解40~60 min，每隔10min颠倒混匀一次。
然后常温12 000 r/min离心10 min。
2)取上清，加入2 ml离心管中，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1), 旋涡混匀，4℃, 12 000 r/min, 离心10 min。
重复这一步骤至界面清晰。
3)取上清，加入到1. 5 ml离心管, 加入两倍体积-20℃预冷的无水乙醇和1/10体积3M的NaAc(pH=5.2), 小心颠倒均匀，-20℃沉淀10~30 min。
4)4℃, 12 000 r/min, 离心10 min。
弃上清，用70%的乙醇洗2~3次。
室温干燥30 min。
5)加入1μl 10 mg/ml RNase，37℃温浴30-60 min去除RNA。
6)溶于40μl灭菌的ddH2O，琼脂糖凝胶检测。
注：无水乙醇、NaAc、70%的乙醇预冷7)取0.1~0.2 g植物材料放入液氮预冷的研钵液氮种研磨成粉。
加入含有65℃预热的1 000 μl CTAB裂解液和20 μlβ-巯基乙醇的2 ml 离心管中，65℃水浴裂解40~60 min，每隔10min颠倒混匀一次。
8)加入等体积氯仿：异戊醇(24：1), 旋涡混匀静置3 min，4℃, 12 000r/min, 离心10 min。
9)取上清800 μl于2 ml离心管中，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1), 旋涡混匀冰上静置3 min，4℃, 12 000 r/min, 离心10 min。
10)取上清600μl，加入1/30体积的NaAc（3M，pH=5.2）和1/10体积的无水乙醇（均预冷），混匀，在冰上静置10 min，再加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，4℃，12 000 r/min, 离心10 min。
CTAB提取植物DNA步骤
CTAB提取植物DNA步骤一、将冷冻干燥的样品用液氮研磨成粉末，转移到离心管，加入65℃预热的2ml CTAB抽提液，65℃保温30 min 以上，间或轻摇混匀；12 000 r／min室温离心10 min，取上清液；二、加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，轻轻混匀15 min 以上，12 000 r／min室温离心10 min，用剪去端部约0．8 cm的1 mL 吸头小心将上层液相转移至一干净的Eppendorf管中；加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），颠倒混匀，12000 r/min 离心5 min 。
三、加入2/3体积( )的-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5 min，颠倒混匀至有白色絮状沉淀出现，在4℃下12000 r／min离心l0 min，沉淀出DNA，去上清；四、沉淀用75％乙醇／和0.2mol／L KAC洗涤2次，每次12000 r ／min室温离心10 min；五、加入预冷的无水乙醇，轻轻上下颠倒，l2 000 r／min室温离心20 min，弃乙醇，自然晾干；加入200μL 去离子水，轻轻敲打使沉淀溶解；六、加入l μL 10 mg／mL Rnase37℃水浴，保温l h，去除RNA；DNA 提取物于-20℃冰箱贮藏备用．一、母液配制方法1、1M Tris-HCl 1L配制量配制方法称量121.1g Tris 置于1L烧杯中。
加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。
按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值。
pH值浓盐酸7.4 70ml7.6 60ml8.0 42ml将溶液定容到1L。
高温高压灭菌后，室温保存。
注意：应使溶液冷却后加调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。
2、5M NaCl 配制量 1L配制方法称取292.2gNaCl置于1L 烧杯中，加入约800 ml的去离子水后搅拌溶解加去离子水将溶液定容到1L 后，适量分成小份,高温高压灭菌后，4℃保存。
CTAB配方及植物DNA提取方法
CTAB配方及植物DNA提取方法主要试剂的配制参考（美）萨姆布鲁克（sambrook，j.）等.分子克隆实验指南（下册）配置如下[94]：（1）0.5mo1/ledta(ph8.0)：称取edta-na218.61g，提80ml双蒸水，磁力搅拌器上频繁烘烤。
重新加入7ml10mo1/lnaoh调到ph8.0再用双蒸水定容至100ml，在1.03×105pa之下高压杀菌20min。
（2）5mol/lnacl溶液：称取nacl29.22g，溶解于90ml的双蒸水，加热到80℃溶解，冷却，再用双蒸水定容100ml，在高压灭菌20min。
（3）10mol/lnaoh溶液：称取40.00gnaoh溶80ml的双蒸水，烘烤，定容至100ml。
（4）1mol/ltris-hc1溶液(ph8.0)：称取12.114gtris碱，溶80ml的双蒸水，重新加入浓hc14.2ml，调整phsuperficial8.0，搅拌定容至100ml，高压杀菌20min。
（5）10%ctab（m/v）：称取ctab10.00g，熔化于80ml的双蒸水，冷却推动熔化，提双蒸水定容至100ml，室温留存。
（6）5mo1/lkac溶液(ph4.8和6.5)：分别称取kac晶体49.07g，溶于80ml的双蒸水，再用冰乙酸调至ph4.8和6.5，加双蒸水定容到100ml，在1.03×105pa之下杀菌20min。
4℃留存。
（7）3mo1/lnaac3h2o溶液(ph5.2)：称取naac晶体20.412g熔化于约30ml的双蒸水，用冰乙酸调到ph5.2，提双蒸水定容至50ml，高压杀菌20min。
4℃留存。
（8）提取缓冲液（0.4mol/l葡萄糖，3%pvp，2％β-巯基乙醇）250ml：称取葡萄糖19.817g、pvp7.50g，加水溶解并定容到250ml，在1.03×105pa下灭菌20min，β-巯基乙醇现用现加。
CTAB法提取植物总DNA
CTAB法提取植物总DNACTAB法（Cetyltrimethylammonium bromide法）是一种常用的植物总DNA提取方法，其优点是简单、高效、成本低、适用性广，能够快速提取高质量的DNA。
CTAB法利用季铵盐CTAB（Cetyltrimethylammonium bromide）和NaCl共同提取植物样品中的DNA。
下面就CTAB法的步骤进行详细介绍。
材料：- 植物样品- CTAB提取缓冲液（含0.6 M CTAB和NaCl）- 65℃和37℃的水浴- 70%、95%和100%的乙醇- TE 缓冲液（含10 mM Tris-HCl和1 mM EDTA，pH 8.0）步骤：1. 准备植物样品将新鲜植物样品（约0.1g）用液氮粉碎成粉末，加入2 mL CTAB提取缓冲液中，研磨均匀。
可以使用带球磨器或者手持器具进行研磨。
2. 加入蛋白酶K加入加入50μL蛋白酶K (20mg/L) 溶液后，65℃恒温振荡2~3 h。
蛋白酶K的作用是降解蛋白质，提高DNA的纯度。
3. 加入腰芽菜素和EB加入5μL腰芽菜素（10mg/mL）和5μL EB（1mg/mL）后，65℃水浴12~15min，使溶液呈现棕黄色，使样品中的腰芽菜素结合到DNA上。
4. 加入氯仿和异丙醇加入等体积氯仿和异丙醇后，轻轻摇匀，离心10min。
离心之后，样品分为四层：上层是异丙醇、第二层是氯仿，中间是粘稠的蛋白质、细胞碎片和杂质，最下面是DNA层。
5. 取出DNA层用200μL的容器沿着DNA层边缘吸取DNA，转移到新管中，并加入300μL75%乙醇洗涤，旋转离心5min，弃上清液，重复一次，最后用吹风机将残留的乙醇风干。
6. 测定DNA浓度用TE缓冲液稀释后测定DNA的浓度和纯度，可以用紫外线光度计进行测定。
测定的结果应该控制在1.8-2.0左右。
总之，CTAB法是一种有效、简单的DNA提取方法，与其他方法相比具有简便易行、节省时间和成本的优势。
实验1植物基因组DNA的提取
实验1 转基因植物PCR 检测一、植物DNA 的提取技术(CTAB 法)一、实验目的1.掌握用CTAB 法提取植物总DNA 的方法和基本原理。
2.学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA 抽提方法。
二、原理CTAB 法[十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide ，简称为CTAB)]是一种快速简便的提取植物总DNA 的方法。
通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，然后加入CTAB ，CTAB 是离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使核酸(DNA 、RNA)得以游离出来。
再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA 、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。
上清液中加入无水乙醇使DNA 沉淀，沉淀DNA 溶于TE 溶液中，即得植物总DNA 溶液。
三、实验材料大豆幼苗[材料的采集与保存对提取DNA 的产量和质量有很大影响。
通常应尽可能采集新鲜、幼嫩的组织材料，采集过程中应尽可能保持组织材料所含的水分。
通常的做法是取样时立即用浸湿的纱布包裹采集到的组织材料，放置在带有冷藏功能的采集箱中，这样通常使组织材料在3-5d 内仍然保持新鲜。
野外远距离采集样本时，在可能的条件下应冷冻保存（如放置于液氮中）；当不具备冷冻条件时，最好用盛有无水CaSO4的瓶子分别保存，使其迅速干燥，这种方法可将材料保存数月，返回后应尽快进行DNA 的提取工作。
那些具有大量次生代谢产物（如单宁、酚类、醌类等）的植物材料，应尽可能采集幼嫩组织。
]四、试剂4.1 CTAB 提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl （pH8.0），20 mmol/L EDTA-Na 2，1.4mol/L NaCl （如表1），2% CTAB ，使用前加入0.1%（V/V ）的β-巯基乙醇。
表1 CTAB 提取缓冲液配制4.2 TE 缓冲液：10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA （ pH8.0）。
CTAB法提取植物基因组DNA
CTAB法抽提植物组织DNA
1、准备工作：
（1）将玻璃瓶，药匙，镊子，研钵，滤纸，枪头，水浴锅准备好；
（2）准备CTAB溶液：
2×CTAB buffer（50mL）
CTAB Powder（2%） 1.0g
1M Tris-HCl（pH8.0，100mM） 5.0mL
0.5M EDTA（20mM） 2.0mL
5M NaCl（1.4M）14.0mL
（3）将水浴锅调到65℃；
（4）事先准备好要用的氯仿，Tris饱和酚（1:1），异丙醇。
无水乙醇放在-20℃冰箱。
2、提取方法
（1）称取0.5 g 新鲜植物叶片，置于研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末，用小药匙迅速转移至1.5 mL Eppendorf 管中；
（2）加入700 μL 2×CTAB/巯基乙醇缓冲液，颠倒混匀；
（3）将离心管置于65℃水浴中保温1h，中间不时颠倒混匀；
（4）加入700 μL氯仿：Tris饱和酚（1:1），温和颠倒5min；
（5）室温，12000×g，离心10min；
（6）取上清（约700μL）于一新的Eppendorf管中（切勿扰动界面），加入氯仿：异戊醇（24:1）700μL，轻轻颠倒混匀；
（7）室温，12000×g，离心10min；
（8）取上清500 μL，加入500 μL-20℃预冷的无水乙醇，混匀。
-20℃放置30min；
（9）室温，12000×g，离心10min；
（10）弃上清，用70%乙醇将沉淀小心清洗两遍；
（11）铺一块吸水纸于超净台中，将离心管开口向下置于滤纸上，室温下吹干10min左右；
（12）溶于适量水或TE溶液中（约50 μL）。
7植物基因组DNA提取-CTAB法
1. 2% CTAB抽提缓冲液
CTAB 2g， NaCl 8.18g ， EDTA-Na2-2H2O 0.74g， 10ml 1mol/L Tris-HCl(pH8.0)， 先用 70ml ddH2O溶解, 再定容至100ml，灭菌, 冷却后 加入0.2% β-巯基乙醇0.2ml。
终浓度： CTAB 2%, NaCl 1.4mol/L（生理平衡 作用）, EDTA20mmol/L(螯合离子作用)，β-巯基 乙醇 100 mmol/L或PVP（聚乙烯吡咯烷酮 ）（降 低氧化酶类的活性，防止酚氧化成醌，有效去除 多酚。）
复习题（判断）
将DNA提取液65度温育20分钟，可以灭活DNase。 （）
在抽提过程中如果水相和有机层的界面不太清楚， 说明其中蛋白质含量较高，可增加氯仿/异戊醇 抽提的次数或适当延长离心的时间。（ ）
（二）获取程序及原理
1. 破壁破膜，释放染色体
利用液氮对植物组织进行研磨，破碎细胞；然后 加入CTAB缓冲液。
有效制备DNA时要考虑两个原则： 防止和抑制内源 DNase 对 DNA的降解； 尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。
在液氮冷冻条件下研磨破碎，保证材料在此过程 中DNase无法活动。
高等植物总DNA提取
—— CTAB法AB法
实验类型：验证型
一、实验目的与要求
掌握CTAB法抽提植物DNA的基本原理。 学习并掌握CTAB法抽提植物DNA的技术和方法。
二、实验原理
（一）植物细胞中DNA在哪里？怎样获得？
➢ 植物细胞中的DNA主要存在于细胞核内，称为 核DNA、染色体DNA、核基因组DNA，细胞质中 也有少量DNA，主要分布在线粒体、叶绿体内，称 为核外DNA。 ➢ 细胞内的各种DNA称为总DNA。 ➢ 程序：破壁破膜→去蛋白质→沉淀DNA
ctab法提取dna流程
ctab法提取dna流程CTAB法是一种常用的DNA提取方法，它能够从植物、真菌、昆虫等样品中高效地提取DNA。
本文将介绍CTAB法提取DNA的主要步骤及注意事项。
1. 样品制备首先，需要准备好待提取的样品。
对于植物样品，应在新鲜或经过冷冻保存的样品中选取新生叶片或芽。
对于昆虫样品，应选取腹部组织或头部组织，并将其切碎。
2. 组织破碎将样品放入研钵中，并加入适量的液氮使其快速冷冻。
然后使用研钵和研杵将样品彻底破碎，直到完全成为粉末状。
3. 细胞裂解将粉末转移到离心管中，并加入适量的CTAB缓冲液和蛋白酶K，混合均匀后放入65℃水浴中静置30分钟左右。
此过程中CTAB缓冲液能够裂解细胞壁并溶解蛋白质，而蛋白酶K则能够降解核酸外侧的核蛋白质。
4. 分离DNA将上述混合液加入等体积的氯仿中，轻轻摇晃后放置静置。
此时，DNA会在上层形成白色的沉淀，而RNA和蛋白质则会在下层。
使用移液管将上层沉淀转移到新的离心管中，并加入70%的乙醇进行洗涤。
最后将DNA沉淀干燥即可。
5. 检测DNA使用紫外分光光度计或琼脂糖凝胶电泳检测提取得到的DNA。
如果需要保存DNA，则应将其溶于TE缓冲液中，并放置于-20℃冰箱中保存。
注意事项：1. 样品制备时应避免污染，使用无菌操作器材。
2. 细胞裂解时应注意温度和时间的控制，避免过度裂解或过短时间裂解。
3. 在分离DNA时应注意不要将底部物质搅拌到上层沉淀中。
4. 检测DNA时应注意样品的稀释和纯化程度，避免误判结果。
总之，CTAB法是一种简单、高效、适用范围广的DNA提取方法。
在实际操作中，应严格控制每个步骤的条件和操作方法，以确保提取得到高质量的DNA。
利用CTAB法提取植物基因组DNA
利用CTAB法提取植物基因组DNA植物基因组DNA提取是分子生物学领域中常用的技术之一。
目的是为了获取高质量的DNA样品，以便进行PCR、测序、基因克隆以及染色体制备等实验。
目前，CTAB法是植物基因组DNA提取中广泛采用的方法之一。
本文将介绍利用CTAB法提取植物基因组DNA的步骤及注意事项。
1. 准备植物组织样品首先需要准备好待提取的植物组织样品，这些样品可以是叶子、花、芽、根等。
样品应该分别收集、标记，冷藏保存并尽快进行提取。
2. 样品研磨取一小段样品，用液氮将其冷冻，然后用研钵和研杵将其研磨成细碎的粉末状。
如果样品过多，则可以用离心管研磨器等仪器进行批量高效研磨。
3. 细胞壁裂解将磨细的植物组织加入CTAB裂解缓冲液中，加热至65℃，开启混合器磁子，同时混合2-3分钟左右，以破坏细胞壁，释放出DNA。
4. 除去蛋白质加入一定量的氯仿，并短暂的混合均匀，待混合物静置后，可以观察到混合液结成两层。
上层为水相，在此基础上加入同体积的异丙醇，沉淀出DNA进行洗涤和离心。
离心后，上清液含有蛋白质，可以废弃，而下沉淀可以进行枸橼酸溶解。
5. 获取DNA加入枸橼酸缓冲液后，可以分别进行洗涤和沉淀。
最后，通过乙醇提取，可以得到纯度较高的基因组DNA样品。
注意事项：1. 必须严格控制植物组织样品的数量，避免混入过多的杂质干扰提取效果。
2. 在DNA分离过程中，所有试剂、试管和磨具等物品都必须干燥无水，以免水分对提取质量产生干扰。
3. CTAB裂解缓冲液中的NaCl浓度和pH值的调节必须准确，其浓度和pH值直接关系到DNA的结晶和浓度。
4. 在进行DNA纯化过程中，必须注意所有材料的稳定性和纯度，同时要充分保护目标DNA，避免DNA被降解。
总之，CTAB法提取植物基因组DNA是一种安全、高效、可靠的方法。
在实际操作中，应充分掌握其原理、步骤和注意事项，以获取高质量的DNA样品，为后续的实验打下良好的基础。
2×CTAB法植物总DNA提取
2×CTAB法植物总DNA提取1. 液氮研磨1g左右的植物组织，转移到离心管中。
改用研磨枪在冰上研磨，不加β-巯基乙醇研磨时可加入适量的PVP、β-巯基乙醇。
若CTAB准备2-3天内用完，则可将PVP、β-巯基乙醇直接加入其中。
2. 加入500µl的2*CTAB (60℃或65℃预热) ,颠倒混合均匀后在60℃或65℃水浴30m-1h 小时,其间要上下颠倒混匀数次。
3.取出离心管，加入等体积的24：1（三氯甲烷：异戊醇），上下颠倒充分混合。
若量多，则可以直接侧立于摇床上晃动10分钟。
4.12000转速离心5-10min。
将离心管动作轻缓的取出转子，放置于离心管架上。
a.离心后溶液分三层：上层为水相；中层为碎片和蛋白相；底层为氯仿b.迅速进入下一步，以免各相混合5.用移液枪吸取管中上层水相，动作一定要轻缓，不可搅动其它两层。
a.此步骤要宁舍不贪多，尽量避免吸取到下层液体。
b.若上步骤中中间层较厚，则继续加入等体积24：1，再次抽提一次，直至中间层较薄。
6.在抽提出的水相中加入1/3体积的5M的KAc及等体积的异丙醇（4℃预冷），轻轻晃动混合均匀后在-20℃沉淀。
沉淀至少15分钟至过夜。
6-1 在抽提出的水相中加入1/10体积醋酸钠（pH5.2, 3M），混匀后，加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃沉淀15min至过夜。
6-3. 在抽提出的水相中加入加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃沉淀15分钟至过夜。
a.时间越长，DNA的产量越多，污染也越多7. 12000转速离心5-10min，去上清，倒置于吸水纸上数分钟，加入700µl 70%的酒精，上下颠倒数次，洗涤沉淀。
12000转离心5-10m，去上清，倒置于吸水纸上数分钟。
重复一遍。
8. 12000转速离心5-10min，去上清，倒置于吸水纸上数分钟，最后置于超净工作台中吹干。
9. 在离心管中加入30-50µl的灭菌去离子水或者TE溶液，4℃放置数小时，使其充分溶解。
植物基因组DNA的提取
浴锅中保温60min；
④ 加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1），轻轻地颠 倒混匀，室温下12000rpm离心10min，移至上 清至新1.5mL EP管；（可重复④ ，抽提两次）
4、参考文献
[1] 钟卫鸿.基因工程技术实验指导[M].北京： 化学工业出版社，2007，7. [2] 王镜岩，朱圣庚，徐长法.生物化学教程[M]. 北京：高等教育出版社，2008，6. [3] 孙明.基因工程[M].北京:高等教育出版社， 2006，5. [4] 彭学贤.植物分子生物技术应用手册[M].北京 ：化学工业出版社，2006，2.
3、方法与步骤
①
②
在CTAB提取液中加入2% β-巯基乙醇，在65 ℃水浴锅中预热（CTAB需在65 ℃保温溶解 ，充分混匀后使用）； 取幼嫩的水稻叶子0.5g，洗净、吸干、剪碎 （冻存材料必须直接研磨，绝对不能化冻； 研磨后的粉末应在化冻前转移，否则内源性 DNase有可能降解）
3、方法与步骤
4、注意事项
CTAB在低于15 ℃时溶于沉淀，所以
使用之前要65 ℃时预热，用前再加 巯基乙醇或者加入亚精胺（100μL DNA加5μL 0.1M的亚精胺）； 在研磨前，研钵里不得有任何水分 ，否则加液氮时容易结冰； 在用不锈钢灭菌后的药匙移取粉末 时，可用枪头的大头移取；
4、注意事出离 心管时动作要轻缓，吸取上层溶液时所 用的枪头要减去下面尖端部分，吸取时 不要吸取中间的蛋白质层； 用70%的乙醇洗DNA后，要使乙醇完全 挥发，否则会对后续的PCR产生影响， 甚至对限制性酶作用产生非特异性；
CTAB法提取植物DNA
CTAB法原理 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基 三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强 度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。 在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白 质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。 通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加 入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
• 1、在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的 形式存在；在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜， 使核蛋白被释放出来。 • 2、在浓氯化钠溶液(1～2mol／L)中，DNA核蛋白的溶解 度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液 (0.14mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白 的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将 DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。
2、氯仿的作用？ 氯仿：加速有机相与液相分层；去除核酸溶液中的迹量 酚。（酚易溶于氯仿中） 3、用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加 少许异戊醇，为什么？
异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡 (异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异 戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的 变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定) 4、乙醇/异丙醇的作用 能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出 来。 5、用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？ 用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子， 如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少 DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。
植物DNA的CTAB提取法1称取新鲜叶片3g剪碎放入研钵中在液
植物ＤＮＡ的ＣＴＡＢ提取法：1 称取新鲜叶片2-3ｇ,剪碎放入研钵中,在液氮中研磨成粉末。
2 将粉末转移到的加有7ｍｌ经预热的1 5×ＣＴＡＢ提取缓冲液15ｍｌ离心管中,迅速混匀后置于65℃水浴中,温育30ｍｉｎ。
3 取出离心管,冷却至室温,加入氯仿/异戊醇(24:1),充分混匀,室温下2300×ｇ离心20ｍｉｎ。
4 将上清转移至另一新的15ｍｌ离心管中,加入1/10体积10%的ＣＴＡＢ和等体积的氯仿/异戊醇。
充分混匀,2300×ｇ离心20ｍｉｎ。
5 转移上清至另一新的15ｍｌ离心管中,加入等体积1%的ＣＴＡＢ沉淀缓冲液,轻轻摇晃至形成ＤＮＡ絮状沉淀。
1000×ｇ离心10ｍｉｎ,使ＤＮＡ沉淀于管底。
6 加入1 5-2ｍｌ的1ｍｏｌ/ＬＮａＣｌ及5μｌＲＮａｓｅ置于56℃水浴中过夜。
待ＤＮＡ完全溶解后,加2-3ｍｌ4℃预冷的95%的冰乙醇使ＤＮＡ沉淀,挑出ＤＮＡ,置于1 5ｍｌ离心管中,用70%乙醇清洗30ｍｉｎ,用离心机甩5ｓ,倒出70%乙醇,再用95%乙醇浸泡5ｍｉｎ,倒出95%乙醇,在超净工作台上吹干。
7 将风干的ＤＮＡ直接在4℃保存备用或溶于100μｌＴＥ溶液中于-20℃保存。
植物ＤＮＡ的ＳＤＳ提取法：1 取2-3ｇ新鲜叶片,在液氮中研磨成粉状(防止溶化)后转入15ｍｌ离心管中。
2 加入5ｍｌ于65℃预热的提取缓冲液,65℃水浴保温30ｍｉｎ(摇动数次),使提取液与样品充分混合。
3 加入2ｍｌ5ｍｏｌ/ＬＫＡｃ,剧烈振荡,冰浴保温20ｍｉｎ以上。
4 2700×ｇ离心20ｍｉｎ,将上清液倒入新的15ｍｌ离心管中,(若提取ＤＮＡ用于Ｓｏｕｔｈｅｒｎ等实验,一般在转移上清时加滤膜,防止样品残渣混入,可保证ＤＮＡ纯度)。
5 加入4ｍｌ氯仿/异戊醇(24∶1),摇匀,平衡,2700×ｇ离心15ｍｉｎ。
6 在另一新的15ｍｌ离心管中加入5ｍｌ预冷的异丙醇,将上清液用移液枪转入此管,在-20℃冷却30ｍｉｎ以上。
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目的要求: 掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理 和方法。
实验内容: 采用CTAB法从植物叶片中提取基因组 DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳。
实验原理
• 1、在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的 形式存在；在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜， 使核蛋白被释放出来。
• ③酶的作用，细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到 破坏时被释放出来，它会降解DNA分子。故须用酶的变性 剂、抑制剂使之失活。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化 物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、(ETDA-Na)等。
使核酸酶被破坏而失活。
3、DNA的浓度测定和纯度分析
• （1）定磷法：是对样品中核酸（DNA和RNA）含量的准 确定量。将样品中的核酸用强酸（硫酸或高氯酸）消化成 无机磷，然后用定磷试剂对生成的无机磷酸进行滴定。定 磷试剂是酸性钼酸铵溶液，钼酸铵能与无机磷酸定量结合 成磷钼酸络合物，该络合物能被抗坏血酸等还原剂还原成 兰色的钼蓝，在660nm处有最大光吸收。
CTAB法原理
CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基 三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强 度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。
在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白 质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。
使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解 作用。缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分 poly(A)RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。 所以提取RNA 时只用氯仿抽提。
2、氯仿的作用？ 氯仿：加速有机相与液相分层；去除核酸溶液中的迹量 酚。（酚易溶于氯仿中）
• 2、在浓氯化钠溶液(1～2mol／L)中，DNA核蛋白的溶解 度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液 (0.14mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白 的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将 DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。
• 3、进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白：用含 异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去 变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间， 而DNA溶于上层水相。用两倍体积95％乙醇溶液将DNA 钠盐沉淀出来。反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶 液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制 品。为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶 处理。生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖，在用 盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。
• （2）紫外光吸收法：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在 260nm。1ug/mL的DNA溶液A260=0.020，1ug/mL的 RNA溶液或单链DNA的A260=0.022~0.024。1个A260相 当于50ug/mL的DNA，40ug/mL的RNA。
• 蛋白质的最大吸收在280nm，多糖的最大吸收在230nm。 • 纯的DNA的A260/A280在1.8左右，纯的RNA的
(9) 将DNA沉淀溶于2ul ddH2O,-20℃保存备用。 (10) 取5DNA溶液做0.7%的琼脂糖电泳，检查DNA的大小和质量
注意；所有操作均须温和，避免剧烈震荡。
思考题：
1、用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？
使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处 理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又 含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而 DNA溶于水相。
通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加 入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
CTAB分离缓冲液 2%CTAB，1.4mol/LNaCL, 20mmol/LEDTA（PH8.0), 100mmol/LTris-HCL(pH8.0), 0.2%巯基乙醇
100mL： 2gCTAB，8.18g NaCL， 0.74g EDTA.Na2.2H2O，加入10mL 1mol/L的TrisHCL(pH8.0), 0.2mL巯基乙醇，加水定容到100mL。
1、Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； 2、EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； 3、NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解于液相； 4、 CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； 5、β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐 变，使酚容易去除; PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能 与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA 中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
A260/A280在2.0左右。
操作方法：
(1) 将CTAB分离缓冲液置于60水浴中预热；
(2) 称取1.5g叶片，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研碎；
(3) 取0.1g粉末直接加入1.5ml的EP管中，加人500ul预热的CTAB 分离缓冲液中，轻轻转动使之混匀；
(4) 样品于65℃保温30分钟；
(5) 加等体积的酚-氯仿-异戊醇抽提（颠倒混匀10次以上）；
(6) 室温下12000rpm离心10分钟；
(7) 小心取上清置于一个新的EP管中（尽量避免吸取中间层）,加 入2倍体积的无水乙醇（或2/3体积的异丙醇）,轻轻混匀，-20 ℃10min,使核酸沉淀下来；
(8) 14000rpm离心10分钟,小心倒去上清液; 1ml 70%乙醇洗涤沉淀 2次；在室温下使DNA沉淀干燥；
在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定， 许多因素可破坏其完整结构：
• ①化学因素，核酸的结构在pH值4.0—11.0间较稳定，pH 值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过 酸过碱。
• ②物理因素，DNA分子链很长，是双螺旋结构，既有一定 的柔性。又有一定的刚性，故强机械作用如剧烈搅拌会令 DNA分子断裂，不利于收集，应加以避免。