CTAB法提取植物DNA
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实验三： CTAB法提取植物DNA
目的要求: 掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理 和方法。
实验内容: 采用CTAB法从植物叶片中提取基因组 DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳。
实验原理
• 1、在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的 形式存在；在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜， 使核蛋白被释放出来。
CTAB法原理
CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基 三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强 度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。
在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白 质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。
• （2）紫外光吸收法：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在 260nm。1ug/mL的DNA溶液A260=0.020，1ug/mL的 RNA溶液或单链DNA的A260=0.022~0.024。1个A260相 当于50ug/mL的DNA，40ug/mL的RNA。
• 蛋白质的最大吸收在280nm，多糖的最大吸收在230nm。 • 纯的DNA的A260/A280在1.8左右，纯的RNA的
• 2、在浓氯化钠溶液(1～2mol／L)中，DNA核蛋白的溶解 度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液 (0.14mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白 的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将 DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。
• 3、进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白：用含 异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去 变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间， 而DNA溶于上层水相。用两倍体积95％乙醇溶液将DNA 钠盐沉淀出来。反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶 液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制 品。为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶 处理。生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖，在用 盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。
• ③酶的作用，细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到 破坏时被释放出来，它会降解DNA分子。故须用酶的变性 剂、抑制剂使之失活。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化 物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、(ETDA-Na)等。
• 操作过程最好在低温(0℃左右)下进行。SDS和苯酚作为 蛋白变性剂，同时可使核酸酶被破wk.baidu.com而失活。
(9) 将DNA沉淀溶于2ul ddH2O,-20℃保存备用。 (10) 取5DNA溶液做0.7%的琼脂糖电泳，检查DNA的大小和质量
注意；所有操作均须温和，避免剧烈震荡。
思考题：
1、用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？
使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处 理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又 含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而 DNA溶于水相。
使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解 作用。缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分 poly(A)RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。 所以提取RNA 时只用氯仿抽提。
2、氯仿的作用？ 氯仿：加速有机相与液相分层；去除核酸溶液中的迹量 酚。（酚易溶于氯仿中）
在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定， 许多因素可破坏其完整结构：
• ①化学因素，核酸的结构在pH值4.0—11.0间较稳定，pH 值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过 酸过碱。
• ②物理因素，DNA分子链很长，是双螺旋结构，既有一定 的柔性。又有一定的刚性，故强机械作用如剧烈搅拌会令 DNA分子断裂，不利于收集，应加以避免。
(5) 加等体积的酚-氯仿-异戊醇抽提（颠倒混匀10次以上）；
(6) 室温下12000rpm离心10分钟；
(7) 小心取上清置于一个新的EP管中（尽量避免吸取中间层）,加 入2倍体积的无水乙醇（或2/3体积的异丙醇）,轻轻混匀，-20 ℃10min,使核酸沉淀下来；
(8) 14000rpm离心10分钟,小心倒去上清液; 1ml 70%乙醇洗涤沉淀 2次；在室温下使DNA沉淀干燥；
A260/A280在2.0左右。
操作方法：
(1) 将CTAB分离缓冲液置于60水浴中预热；
(2) 称取1.5g叶片，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研碎；
(3) 取0.1g粉末直接加入1.5ml的EP管中，加人500ul预热的CTAB 分离缓冲液中，轻轻转动使之混匀；
(4) 样品于65℃保温30分钟；
通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加 入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
CTAB分离缓冲液 2%CTAB，1.4mol/LNaCL, 20mmol/LEDTA（PH8.0), 100mmol/LTris-HCL(pH8.0), 0.2%巯基乙醇
100mL： 2gCTAB，8.18g NaCL， 0.74g EDTA.Na2.2H2O，加入10mL 1mol/L的TrisHCL(pH8.0), 0.2mL巯基乙醇，加水定容到100mL。
1、Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； 2、EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； 3、NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解于液相； 4、 CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； 5、β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐 变，使酚容易去除; PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能 与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA 中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
3、DNA的浓度测定和纯度分析
• （1）定磷法：是对样品中核酸（DNA和RNA）含量的准 确定量。将样品中的核酸用强酸（硫酸或高氯酸）消化成 无机磷，然后用定磷试剂对生成的无机磷酸进行滴定。定 磷试剂是酸性钼酸铵溶液，钼酸铵能与无机磷酸定量结合 成磷钼酸络合物，该络合物能被抗坏血酸等还原剂还原成 兰色的钼蓝，在660nm处有最大光吸收。
目的要求: 掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理 和方法。
实验内容: 采用CTAB法从植物叶片中提取基因组 DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳。
实验原理
• 1、在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的 形式存在；在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜， 使核蛋白被释放出来。
CTAB法原理
CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基 三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强 度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。
在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白 质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。
• （2）紫外光吸收法：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在 260nm。1ug/mL的DNA溶液A260=0.020，1ug/mL的 RNA溶液或单链DNA的A260=0.022~0.024。1个A260相 当于50ug/mL的DNA，40ug/mL的RNA。
• 蛋白质的最大吸收在280nm，多糖的最大吸收在230nm。 • 纯的DNA的A260/A280在1.8左右，纯的RNA的
• 2、在浓氯化钠溶液(1～2mol／L)中，DNA核蛋白的溶解 度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液 (0.14mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白 的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将 DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。
• 3、进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白：用含 异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去 变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间， 而DNA溶于上层水相。用两倍体积95％乙醇溶液将DNA 钠盐沉淀出来。反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶 液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制 品。为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶 处理。生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖，在用 盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。
• ③酶的作用，细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到 破坏时被释放出来，它会降解DNA分子。故须用酶的变性 剂、抑制剂使之失活。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化 物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、(ETDA-Na)等。
• 操作过程最好在低温(0℃左右)下进行。SDS和苯酚作为 蛋白变性剂，同时可使核酸酶被破wk.baidu.com而失活。
(9) 将DNA沉淀溶于2ul ddH2O,-20℃保存备用。 (10) 取5DNA溶液做0.7%的琼脂糖电泳，检查DNA的大小和质量
注意；所有操作均须温和，避免剧烈震荡。
思考题：
1、用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？
使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处 理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又 含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而 DNA溶于水相。
使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解 作用。缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分 poly(A)RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。 所以提取RNA 时只用氯仿抽提。
2、氯仿的作用？ 氯仿：加速有机相与液相分层；去除核酸溶液中的迹量 酚。（酚易溶于氯仿中）
在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定， 许多因素可破坏其完整结构：
• ①化学因素，核酸的结构在pH值4.0—11.0间较稳定，pH 值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过 酸过碱。
• ②物理因素，DNA分子链很长，是双螺旋结构，既有一定 的柔性。又有一定的刚性，故强机械作用如剧烈搅拌会令 DNA分子断裂，不利于收集，应加以避免。
(5) 加等体积的酚-氯仿-异戊醇抽提（颠倒混匀10次以上）；
(6) 室温下12000rpm离心10分钟；
(7) 小心取上清置于一个新的EP管中（尽量避免吸取中间层）,加 入2倍体积的无水乙醇（或2/3体积的异丙醇）,轻轻混匀，-20 ℃10min,使核酸沉淀下来；
(8) 14000rpm离心10分钟,小心倒去上清液; 1ml 70%乙醇洗涤沉淀 2次；在室温下使DNA沉淀干燥；
A260/A280在2.0左右。
操作方法：
(1) 将CTAB分离缓冲液置于60水浴中预热；
(2) 称取1.5g叶片，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研碎；
(3) 取0.1g粉末直接加入1.5ml的EP管中，加人500ul预热的CTAB 分离缓冲液中，轻轻转动使之混匀；
(4) 样品于65℃保温30分钟；
通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加 入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
CTAB分离缓冲液 2%CTAB，1.4mol/LNaCL, 20mmol/LEDTA（PH8.0), 100mmol/LTris-HCL(pH8.0), 0.2%巯基乙醇
100mL： 2gCTAB，8.18g NaCL， 0.74g EDTA.Na2.2H2O，加入10mL 1mol/L的TrisHCL(pH8.0), 0.2mL巯基乙醇，加水定容到100mL。
1、Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； 2、EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； 3、NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解于液相； 4、 CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； 5、β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐 变，使酚容易去除; PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能 与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA 中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
3、DNA的浓度测定和纯度分析
• （1）定磷法：是对样品中核酸（DNA和RNA）含量的准 确定量。将样品中的核酸用强酸（硫酸或高氯酸）消化成 无机磷，然后用定磷试剂对生成的无机磷酸进行滴定。定 磷试剂是酸性钼酸铵溶液，钼酸铵能与无机磷酸定量结合 成磷钼酸络合物，该络合物能被抗坏血酸等还原剂还原成 兰色的钼蓝，在660nm处有最大光吸收。