大肠杆菌检验

第三章 大肠菌群测定

一、大肠菌群检验

(一)检验方法

(二)培养基

(三)检验时应注意事

二、大肠菌群的卫生学意义

大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。该菌群主要来源于人及温血动物粪便，一般多用来作为食品中的粪便污染指标。过去我国在大肠菌群的检验方面经验不多，对该菌群的认识也不够充分。1974年全国修订食品卫生细菌检验方法座谈会和1976年全国食品卫生标准会议建议以大肠菌群作为粪便污染指标菌，并提出进行有关大肠菌群方面的科研工作。为此，我们成立了大肠菌群科研协作组，对犬肠菌群的检验方法(包括快速检验方法)及其卫生学意义进行了广泛的科学研究和实践，取得了一定成绩，为制订大肠菌群检验方法提供了科学依据。

在这次修订l976年版食品卫生检验方法的过程中，大肠菌群科研协作组又于1983～1985年对大肠菌群检验方法进行了实验研究，并作了对比观察，同时对国内常用的大肠菌群快速检测方法也进行了研讨，为这次修订国家标准食品卫生检验方法微生物学部分中的大肠菌群测定提供了科学依据。

大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出来的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。其定义为：系指一群需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。有些科学工作者又用靛基质、甲基红、V～P、柠檬酸盐、硫化氢、明胶、动力和44．5℃乳糖分解等试验，将这群细菌再分为大肠艾希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。不论分法如何，对大肠菌群的判定，均应以上述定义为基础。

一、大肠茵群检验

(一)检验方法

1．乳糖发酵试验。以无菌操作采取样品，采取量及稀释倍数，依据国家或当地卫生标准要求及样品污染情况而定。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在l m J以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lm1及1mI以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36±l℃温箱内，培养24±2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。

2．分离培养。将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±l℃温箱内，培养18～24小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。

3．证实试验。在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落l～2个进行革兰氏染色，同时

接种乳糖发酵管，置36±1℃ 温箱内培养24±2小时，观察产气情况。凡乳糖管产气，革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。

4．报告。根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每l 00ml(g)大肠菌群的最可能数。

5．检验程序。见图3-1

图3-I大肠菌群检验程序

(=)培养基

1．乳糖胆盐发酵培基

成分：蛋白胨

猪胆盐(或牛，羊胆盐)

乳糖 ．、

0．04％溴甲酚紫水溶液

蒸馏水 ’

pH7．4

制法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，并放入一个小倒管，高压灭菌115℃15分钟。

20g

5g ‘

1 Og

25m1

1 000m1

校正pH，加入指示剂，分装每管l 0ml，

附注：双料乳糖胆盐发酵培基除蒸馏水外，其他成分加倍。

用途：乳糖发酵试验用。

原理：细菌分解糖类是依靠细菌细胞所产生的各种酶类的作用，细菌产生的分解糖

类的酶，随细菌种类不同而异，可以此来鉴别细菌。

乳糖是双糖，细菌分解双糖的酶大多是胞外酶。乳糖被乳糖酶水解成葡萄糖和半乳糖，葡萄糖可直接被细菌利用，而半乳糖则需在细胞内转化为葡萄糖后再被利用。

糖发酵试验主要是测定细菌分解糖类以后所产生的酸，以培基pH降低(指示剂变色)作为观察结果的指标。

大肠杆菌等细菌在酸性环境中，由于甲酸脱氢酶的作用，可使甲酸分解成CO2和H2，在培基中产生大量气体，进入倒管中，以便观察。

注：常用于供发酵试验的各种糖类、醇类和糖苷类(见表3-1)·

2．伊红美蓝琼脂培基

成分：蛋白胨 10g

乳糖 10g

磷酸氢二钾 2g

琼脂 17g

2％伊红Y溶液 20ml

0．65％美蓝溶液 10ml

蒸馏水 1000ml

pH7.1

制法：将蛋l白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH，分装于烧瓶内，高压灭菌121℃15分钟备用。临用时加入乳糖，并加热溶化琼脂，冷至50一55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。

原理：大肠菌群细菌发酵乳糖产酸，使伊红与美蓝结合而成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，有时还可产生金属光泽。黑色程度与光泽产生情况与伊红、美蓝二者比倒有关。不发酵乳糖的细菌(如沙门氏菌、志贺氏菌)则为无色菌落。

3．乳糖发酵培基

成分：蛋白胨 20g

乳糖 10g

O．04％溴甲酚紫水溶液 25ml

蒸馏水 1000ml

pH7．4

制法：将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，按检验要求分装30ml、10ml 或3ml，并放入一个小倒管，高压灭菌115℃15分钟。

附注： ’

(1)双料乳糖发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。

(2)30ml和10ml乳糖发酵管专供酱油及酱类检验用．3ml乳糖发酵管供大肠菌群

证实试验用。

4．蛋白胨水

成分：蛋白胨(或胰蛋白胨) 20g

氯化钠 5g

蒸馏水 1 000ml pH7．4

表3-1 供发酵试验用的糖类、醇类和糖苷类 （一）供发酵试验用的各种糖类

化学上的分类 名 称

戍糖(C5H10O5)

已糖(C6H12O6)

双糖类(C12H22O11)

兰糖类(C6H10O5)3 多糖类(C6H10O5)x 阿拉伯糖 arabinoSe

木糖 xylose

鼠李糖 rhamnose

葡萄糖 glucose dextrose 果糖 fructose,levulose 甘露糖 mannose

半乳糖 galactose

麦芽糖 moltose

乳糖 lactose

蔗糖 sucrose

草搪 trehalose

纤维二糖 cellobiose

木蜜糖 melibiose

棉子糖 raffinose

落叶松糖 melizitose

菊糖 inulin

淀粉 starch

肝糖 glucogen 糊精 dextrin

(二)供发酵试验的各种醇类和糖苷类

化学上的分类 名 称

三元醇C3H5(0H)3 四元醇C4H6(0H)4 五元醇类C5H7(OH)6

六元醇类C6H8(OH)8

环己六醇(CHOH)6 糖苷类 甘 油 glycerol 赤丝藻醇 erythritol 侧金盏花醇 adonitol 阿拉伯胶醇 arabitol 甘露醇 mannitol 卫矛醇 dulcitol． 山梨醇 sorbitol 肌 醇 inositol 水杨苷 salicin

七叶苷 aesculin 松柏苷 coniferlin

制法：按上述成分配制，分装小试管，高压灭菌12l℃15分钟．

附注：蛋白胨内应含有丰富的色氨酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后 方可使用。