现代生物学导论 10 生物技术与人类未来

分子克隆– DNA的无性繁殖技术
（从1973年DNA重组）
重组DNA技术包括了基因克隆为主的一系列的分子 生物学操作步骤，实现不同物种间基因的转移。 从研发到进入市场，需要的周期长，至少5年以上
重组DNA操作的一般步骤：
1）获得需要的目的基因（又称外源基因）；
2）目的基因在限制性内切酶和连接酶作用下与载体 连接，形成新的重组DNA分子（克隆和筛选）；
改进的 pUC18
→

DNA分子杂交直接鉴定分子探针方法鉴定 琼脂培养基上的菌落原 位印迹到滤膜上
制备 32P标记的DNA分子探针 （如用PCR法）
与膜上的核酸杂交 放射自显影法确定转化 子 挑出阳性菌落培养或进 入下一步操作
重组基因导入宿主菌（即转化或转染）
将目的基因克隆或转化到大肠 杆菌细胞中的操作步骤包括： ● 制备感受态细胞 感受态细胞（competent cell）－受体细胞处理后所 处的易接受外源基因的状态 ●用重组质粒转化大肠杆菌感 受态细胞； ●筛选含重组质粒的大肠杆菌 细胞，进行检查或鉴定。
（1）二十世纪后叶，分子生物学等领域一系列突 破性成就，使生命科学在自然科学中的地位发生 了革命性的变化； （2）建立在实验室研究基础上的生物技术的发展 为人类带来了巨大的利益和财富。
生物技术将是未来经济发展的新动力
第一次技术革命 工业革命 解放人的双手
第二次技术革命
第三次技术革命
信息技术
生物技术
基因体外重组（基因克隆）
1973年，由美国斯坦福大学教授Cohn和美国加州大学
教授Boyer带领各自的研究组几乎同时分别完成了DNA
体外重组，一举打开了基因工程学大门。
载体
载体：是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具
（因为切割的DNA并不能直接进入到细菌等宿主细胞中，需要连入到合适载体 中，才可能转入到宿主细胞中并随之繁殖而复制）
Southern分子杂交分析－示例（用探针杂交）
A. DNA体外重组实验
B. 抗生素筛选转化子 细胞
C. 培养突变株细胞 D. Southern杂交实验 结果显示，外源目的基 因已经转入突变株细胞 中
对转化子的筛选和克隆基因的鉴定
原 理 ： 琼脂糖 凝胶 电泳 分 离鉴 定 大小 不等的酶解片段：
(2) 载体
(3) 宿主菌
微量的目的基因必须经过基因克隆获得大量的拷贝后， 才能实现进一步的重组、转化和表达等操作。
限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶， 可以识别并切开核酸序列的特定位点-称分子手术刀 Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方 面的开创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。
通常生物技术主要包括基因工程、细胞工程、发酵工
程、蛋白质（酶）工程四大工程，此外还有单克隆抗 体技术；克隆动物技术、生物芯片技术、生物材料技 术、生物能源技术、利用生物降解环境中有毒有害化 合物的技术等都可属生物技术范畴的内容。
直接相关联的学科：分子生物学、微生物学、生物化 学、遗传学、细胞生物学、生物信息学、化学工程学、 医药学、材料科学等。涉及的学科还远不止这些
11 生物技术与人类未来
11.1 生物技术、主要内容和发展概况 11.2 生物技术方法
一、基因工程-DNA重组技术与蛋白质工程 二、细胞工程 三、动物克隆技术 四、生物芯片技术
11.3 生物技术的应用 11.4 生物技术面临的问题与挑战 11.5 生物技术造福人类
生物科学成为当今世界自然科学的热点和重 点，主要由于两方面的原因：
最终实现该技术的 商业价值。 上游和下游技术
基因工程与建筑工程雷同
基因工程技术是现代生物技术的基础
以克隆和重组DNA为核心的技术即基因工程技 术，又称为重组DNA技术。
重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴 起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。
克隆(clone)---无性繁殖（系）
(2) 逆转录人工合成互Fra Baidu bibliotekDNA－cDNA文库的构建
mRNA
逆
转录
cDNA (互补DNA） 第二条DNA链 克隆、转染、
基因组文库与cDNA文库的比较
构建基因组文库获取目 的基因存在的问题—— 费时费事 有内含子序列 cDNA文库，反转录人工 合成互补DNA方法的优势： 1、 不含内含子序 列 2、获取的DNA片段 往往是具有特定功能的 目的基因
生物技术是对人类和社会生活影响最大的技术领域
按应用领域划分：农业生物技术、医药生物技术、环境生物技 术、海洋生物技术、材料生物技术、能源生物技术等等。
一、基因工程与蛋白质工程
基因工程是指在分 子水平，设计并实 施把一个生物体中 有用的目的基因或 DNA(遗传信息)转入 另一个生物体中， 使后者获得新的遗 传性状或表达所需 要的产物。
生物技术具有多学科交叉和综合运用的特点：
1）其理论来源于实验室大量复杂的基础研究工作
2）微生物学、分子生物学、化学工程、材料科学等多学科 交叉的综合性学科
↓利用生物技术的生产线
生物技术的显著特点 1)高技术（精细和
密集的复杂技术） 2)高投入 3)高利润
周期长(三高一长)
11.2
生物技术方法：
质粒载体
质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复 制的一段环状DNA分子。进入到宿主细胞中的一个 质粒可以大量增加其拷贝数。
例如：细菌质粒pUC18就是一种已被改造的实用载体：
（1) 该质粒比较小，可以插入一段较长的DNA片段。 （2) 进入宿主细菌细胞后，pUC18在每个细胞中可大 量复制，形成大约500个拷贝。 （3) 在pUC18中有一小段人为设计和插入的具有多种 限制性酶切位点 的序列，即多克隆 位点。

PCR技术的发明
PCR的发明是DNA操作技术的革命 美国Kary Mullis教授 开汽车时的联想
逶迤崎岖的山路——DNA双螺旋
行驶的汽车——一小段DNA引物 …… 1988年发明了PCR技术 1993年获得诺贝尔奖
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构建重组DNA和基因克隆
(1) 限制性内切酶 （和连接酶）
基因重组和克隆操作最重要的工具有以下3个：
扩展人的大脑
改造生命本身
11.1 生物技术定义、主要内容和发展概况
生物技术的定义和特点
1982年，国际合作与发展组织的定义为：生物技术 是应用自然科学及工程学的原理，依靠微生物、动 物、植物体作为反应器将物料进行加工以提供产品 为社会服务的技术。 美国政府技术顾问委员会(OAT) 的定义是：应用生 物或来自生物体的物质制造或改进一种商品的技术， 其中还包括改良有重要经济价值的植物与动物以及 利用微生物改良环境的技术。 该定义强调了生物技术的商品属性。生物工程-应
导入基因的大肠杆菌细胞是基因克隆的宿主， 可大量表达目的基因。
植物和动物的遗传转化常用的方法
载体法转化——如上所述的细菌的质粒转化等。
植物采用的是农杆菌介导法（Ti质粒） 基因的直接转移 （1）高压电脉冲
电激穿孔
（2）基因枪法
（3）微注射法
（4）同源重组等等
宿主菌或受体细胞：
大肠杆菌 蓝藻 酵母 昆虫细胞 哺乳动物细胞 植物原生质体细胞（除去细胞壁的）
质 粒 载 体 的 一 般 结 构
（4 ) 带有筛选标记－如lacZ基因的插入失活，筛选重组质粒
pUC118 质 粒 的 多 克 隆 位点整合在lacZ即半乳糖苷酶 的基因中， lacZ可以使细菌在 含有IPTG（即乳糖操纵子的诱导 物）和X-gal（即半乳糖苷酶的 底物）的平板培养基上形成蓝色 的菌落，即X-gal被lacZ基因编 码产生的半乳糖苷酶水解成蓝 色。但是，当外源DNA片段插入 到多克隆位点区时，就破坏了 lacZ基因的结构，使 lacZ基因 失去了活性和表达功能，大肠杆 菌就形成白色菌落,即形成白色 菌落的细菌是携带有插入片段重 组质粒的细菌。
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获得需要的目的基因（外源基因）
获得需要的目的基因常用的方法：
（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA文库 (genomic DNA library)，从文库中调用目的基因；
（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立 cDNA文库，从文库中调用； （3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增得到所 需要的目的基因片段； （4）化学合成等。
（5)带有其他筛选标记：
如pUC18载体携带了另一 种筛选标记－抗生素 （antibiotic）如氨卞青 霉素抗性（AmpR）的基因。 只有插入外源目的基因的 宿主细胞能在含有氨卞的 培养基板上生长，所以也 可依此特性筛选重组质粒。 含有重组质粒的宿主 菌又称 “转化子”。
DNA 克 隆 常 用 质 粒 载 体
(1) 细胞内总DNA的提取分离与基因组文库的构建
细胞内总DNA的提取分离程序：
苯酚变性 沉淀蛋白 质
紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度

基因组DNA文库的构建
将总DNA经过酶解，经蔗糖梯度离心或琼脂糖凝胶 电泳分离不同长短的DNA片段。包含的基因组片段 分别克隆在质粒或噬菌体载体上，转染细菌或体外 包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因组文库。 然后用标记的单链DNA为探针（probe）调用目的基 因。
通过DNA体外重组技术构建的重组质粒除了 转化到细菌中表达外，还可以直接用以转化蓝藻 等原核生物或其他一些原生生物细胞以及酵母、 昆虫、哺乳动物CHO等真核生物细胞。 也可直接转染到动、植物细胞培养。
举蓝藻例： 构 建 缺 失 chlL 基因的蓝 细菌（即蓝藻） 突变株
（直接转化法之一）
chlL－一种控制叶绿素 合成的基因
一般载体要求具备以下特性：
（1）能够自我复制，并带动插入的外源基因一起复制 （2）具有合适的限制性酶切位点 （3）细胞内拷贝数要多 （4）通常载体的分子量要小（有时要求载体分子量要大） （5）具有合适的筛选标记 （6）细胞内稳定性高
目前最常用的原核细胞的克隆载体包括细菌质粒、噬 菌体、cosmid质粒等DNA。
3）转化或转染：用重组的DNA分子转化受体细胞，使 之进入受体细胞并能在受体细胞中复制和遗传； 4）对转化子即获得外源基因的受体细胞进行筛选和 鉴定；(阳性克隆) 5）对获得外源基因的细胞或生物体通过发酵、细胞 培养、养殖或栽培等，最终获得所需的遗传性状或 表达出所需要的产物。
←重组DNA技
术-基因工 程图示
聚合酶链式反应（PCR）
反应步骤：变性、 退火、延伸三步曲
变性：双链DNA解链 成为单链DNA
退火：部分引物与 模板的单链DNA的特 定互补部位相配对 和结合 延伸：以目的基因 为模板，合成互补 的新DNA链
聚合酶链式反应（PCR）
每一轮聚合酶链式反应可 使目的基因片段增加一倍
30轮循环，每一个目的基 因就被选择性放大，获得 230（1.07×109)个片段 循环反应在特制的PCR仪中 可自动进行直到完成
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转化或转染受体细胞及转化子的筛选
基因克隆获得大量目的基因后，就要使其在合适的 宿主细胞中表达，产生需要的基因表达产物或使宿 主生物具备所需的性状，同时目的基因还能在宿主 细胞中稳定遗传。这一过程就是遗传转化。
若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可 对转化的大肠杆菌或转化的细胞（即转化子）进行 培养，使目的基因大量表达和积累，然后对表达产 物分离纯化，便可获得想要的产品。
▽限制性内切酶
识别特定的核苷酸序列，
一般4~6个碱基对。
例如 ： EcoRI特异识别GAATTC 及其互补碱基组成的双链
▽DNA片段酶切后形成粘 性末端或平端，互补的粘 性末端或平端用T4连接酶 可连接起来
限制性内切酶-DNA的分子刀
已经发现和鉴定的限制性内切酶有200多种

限制性内切酶切与DNA重组的操作：
(3) 聚合酶链式反应（PCR技术） PCR技术就是在体外的小试管中通过酶促反应有选择 地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。
该技术高效、快捷、特异性好。
小试管中反应需加入4种物质：
（1）作为模板的DNA序列－－即微量的总DNA； （2）与欲分离的目的基因两条链的各自5’端序列相互补的 DNA引物（约20个左右碱基的短DNA单链）； （3）Taq DNA聚合酶； （4）4种核苷酸 4×dNTP（即dATP, dTTP, dGTP和dCTP）