[课件]Nrf2传导通路PPT
第三节 神经传通路PPT课件
副交感神经节前纤维 动眼神经 眶内 睫状神经节
副交感神经节后纤维
瞳孔括约肌 睫状肌
（四）听觉传导通路
内耳螺旋器 蜗神经节 内耳道底
内耳门 脑桥小脑三角
蜗神经核
交叉
斜方体
不交叉
外侧丘系
下丘 上丘 顶盖脊髓束
下丘臂
脊髓前角运动细胞
内侧膝状体
听觉反射活动
听辐射
内囊后肢
颞横回
位听觉传导路
二、下行传导通路
（一）锥体系
1.皮质脊髓束
中央前回中上部 中央旁小叶前部
锥体细胞
轴突
皮质脊髓束
内囊后肢
大脑脚底中间3/5外侧部
脑桥基底部 延髓
脊神经前根 脊神经运动纤维
躯干四肢骨骼肌
锥体
交叉
锥体交叉
不交叉
皮质脊髓侧束
前角运动细胞
皮质脊髓前束
逐节交叉
前角运动细胞
躯干肌
2.皮质核束
中央前回下部 锥体细胞 轴突 皮质核束 内囊膝
背侧丘脑腹后外侧核-内侧丘系 脊髓丘系
（三）视觉传导通路
1.视觉传导通路
视网膜视锥细胞 视杆细胞
神经细胞：
视(感光)细胞 双极细胞
节细胞
双极细胞 节细胞 视神经盘
视神经
视交叉
鼻侧半交叉 颞侧半不交 叉
视束
内囊后肢 距状沟周围皮质
外侧膝状体
视辐射
2.瞳孔对光反射途径
视网膜 视交叉
视束 顶盖前区 动眼神经副核
第五篇 神经系统
nervous system
第三节 神经传导通路
第三节 神经传导通路
一、上行(感觉)传导通路
躯干四肢的意识性深部感觉传导通路 躯干四肢的浅部感觉传导通路 头面部的浅部感觉传导通路 视觉传导通路 瞳孔对光反射途径 听觉传导通路
传导通路 ppt课件
第3级神经元：
胞体：丘脑腹后外侧核 轴突：组成丘脑中央辐射，经内囊后肢上升
投射部位：中央后回上2/3及中央旁小叶后部，部分到达中央前回
延 髓
脊 髓
脑 中
脑 桥 延 髓
躯干和四肢意识性本体感觉和精细触觉传导通路
中央后回上2/3；中央旁小叶后部；中央前回（精细触觉）
丘脑中央辐射
第3级神经元：
内侧丘系
2．交叉平面不同
（1）脊丘系在脊髓内经白质前连合斜升1~2个节段逐级交叉至对侧。
（2）内侧丘系在延髓内集中交叉。
（3）三叉丘系在脑干内逐级交叉
（三）关于头面部触觉
头面部触觉分两路上传，三叉神经脑桥核（传递触觉信息）所发出的二级纤
维参予双侧三叉丘系的组成，故一侧三叉丘系损伤，对侧头面部损伤平面以下痛 觉和温度觉丧失，而触觉不会完全丧失（此即头面部浅感觉分离现象）。
（四）深、浅感觉传导路在大脑皮质的投射特点
体倒头正，对侧管理（大部），投射区的大小决定于所表器官(或部位)
功能的复杂(精细)程度，而与其体积大小无关。
三.视觉传导路
(1)组成：由三级神经元组成 1级神经元：
胞体：视网膜内的双极细胞
2级神经元：
胞体：位于视网膜内层的节C
3级神经元：
胞体：外侧膝状体
投射部位：距状沟两侧
1．第Ⅰ躯体运动区 位置：中央前回、中央旁小叶前部
特点： （1）上下颠倒，头正 （2）左右交叉 （3）身体各部分投影 区的大小取决于 功能的重要性和 运动的精细程度有关
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2．第Ⅰ躯体感觉区
位置：中央后回、旁中央小叶后部 特点： （1）上下颠倒，头正； （2）左右交叉； （3）身体各部在该区投 射范围的大小取决 于该部感觉敏感程度。
传导路-PPT课件
传导路
1、 感受器
传入神经
上行传导路（感觉传导路）
脊髓 上行
脑干
脑
下行
2、 脑
脊髓
脑干
传出神经
效应器
下行传导路（运动传导路）
神经系统的传导通路
一、 感觉传导通路
（一） 躯干四肢的意识性本体觉和精细触觉传导通路
感受器
肌、肌腱、 骨膜、关节
皮肤的精细 触觉
脊神经节
脊神经
（周围突）
第1级神经元
薄、楔束核
④小部分终止于对侧面神 经核下部和舌下神经核， 支配对侧的面下部肌、舌 肌
中央前回下 部的锥体细 胞（上运动 神经元）
双侧脑神 经运动核
皮质核束
内囊膝部、大脑脚底
动眼神经核
眼球外肌
三叉神经运动核
咀嚼肌
疑核
咽喉肌
面神经核上半
面上部表情肌
对侧脑神 经运动核
面神经核下部 舌下神经核
口周围表情肌 舌肌
一侧皮质核束损伤，只有对侧面下部表情肌和对侧舌肌瘫痪， 而受面神经上部支配的上部面肌以及其余脑神经躯体运动核 支配的咀嚼肌、眼球外肌、咽喉肌均不受影响。
3.上、下运动神经元
①上运动神经元： 大脑皮质的锥体细胞及其轴突 ②下运动神经元： 脊髓前角细胞和脑神经躯体运动核
锥体系的任何部位损伤都可引起其支配的骨骼肌的随意 运动障碍，出现瘫痪。
由于下运动神经元受上运动神经元的控制，下运动 神经元对肌肉还有营养作用并组成反射弧，故上下两级 神经元受损后，瘫痪所表现的体征不同。
①视神经损伤：
患侧瞳孔直接对光反射消失
患侧瞳孔间接对光反射存在
②动眼神经损伤：
患侧瞳孔直接对光反射消失
Nrf2传导通路
冷应激的危害：
冷应激对鸡的危害表现为生长缓慢，饲料 报酬降低，蛋鸡产蛋率明显下降，发病率高 及死亡率高等。冷应激对体温调节功能还不 完善的雏鸡的影响更大且死亡率也高。
目的意义
冷刺激→自由基变化→氧化应激。因此研究 Nrf2-ARE通路对鸡冷应激的调控机理，主要 是为了探索冷应激的科学解决方法，对提高 应激预防水平，保障畜牧业发展有重要意义。
谢谢大家
❖什么是Nrf2
Nrf2(nuclea factor erythroid-2-related factor 2)即核因子E2相关因子2，它是一种氧化应激 基本表达的关键转录因子，存在于全身多个 器官，它的缺失或激活障碍直接引起细胞对 应激源的敏感性变化。
图1： Nrf2的主要功能区分布示意图
❖什么是Keap1
通常是指家禽对温度突然下降10以上的环境刺激或是长期处于低温环境下4以下所产生的一系列生理或病理反应既有抗损伤反应的发生也有病理损伤的出现关键取决于应激反应的强弱和鸡对寒冷应激的适应性或抵抗力
❖冷应激及其危害 ❖目的意义 ❖Nrf2-ARE通路的调控机理
冷应激：
通常是指家禽对温度突然下降(10℃以上)的 环境刺激或是长期处于低温环境下(4℃以下) 所产生的一系列生理或病理反应，既有抗损 伤反应的发生，也有病理损伤的出现，关键 取决于应激反应的强弱和鸡对寒冷应激的适 应性(或抵抗力)。
❖什么是ARE
ARE（antioxidant response element）即抗 氧化反应元件，是一个特异的DNA-启动子结 合序列。
Nrf 2
Keap 1
Reactive Oxygen Species
Nrf 2
Keap 1
RO S
Reactive Oxygen Species
Keap1-Nrf2通路在防御药物毒性中的防御机制
Keap1-Nrf2通路在防御药物毒性中的调控机制摘要药物副作用是公众健康的重要问题。
在一些情况下，药物代谢过程中能通过生物活化将母体分子转化为化学活性中间体而产生毒性。
为了维持生物活化和解毒之间的良好平衡，哺乳动物细胞演化出可以被诱导的细胞防御系统即抗氧化反应通路。
转录因子Nrf2主要通过调控大量II型解毒和抗氧化代谢酶来激活细胞保护通路。
然而，Nrf2的活性被细胞质中富含半胱氨酸的Nrf2阻抑蛋白Keap1调控，使得Keap1成为化学/氧化压力的感应器。
本文总结了我们现阶段对调控Keap1-Nrf2通路的分子机制，强调Nrf2在防御药物毒性中的重要作用。
关键词：Nrf2，Keap1，抗氧化反应元件，细胞防御The Keap1-Nrf2 Cellular Defense Pathway:Mechanisms of Regulation and Role in Protection Against Drug-Induced ToxicityAbstractAdverse drug reactions pose a significant public health problem . In some cases, the process of drug metabolism can contribute to the onset of toxicity through the bioactivation of a parent molecule to a chemically reactive intermediate. In order to maintain a favorable balance between bioactivation and detoxification, mammalian cells have evolved an inducible cell defense system known as the antioxidant response pathway. The activity of this cytoprotective pathway is largely regulated by the transcription factor Nrf2, which governs the expression of many phase II detoxification and antioxidant enzymes. In turn, the activity of Nrf2 is regulated by the cysteine-rich cytosolic inhibitor Keap1, which acts as a “sensor”for chemical/oxidative stress . This article summarizes our current understanding of the molecular mechanisms that regulate the function of the Keap1-Nrf2 pathway and highlights the importance of Nrf2 in the protection against drug-induced toxicity. Keywords:Nrf2, Keap1, Antioxidant response element, Cell defense前言药物副作用成为病人发病和死亡的主要原因[1]，在英国药物副作用是1974到1994年4%药物被撤销的原因[2]。
化学防癌药物keap1_nrf2信号通路活化剂的研究进展_芦秀丽
辽宁大学学报自然科学版第39卷第3期2012年JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITYNatural Sciences EditionVol．39No．32012化学防癌药物keap1－nrf2信号通路活化剂的研究进展芦秀丽1，2*，张勇1，2（1．辽宁大学生命科学院，辽宁沈阳110036；2．辽宁省生物大分子计算模拟与信息处理工程技术中心，辽宁沈阳110036）摘要：化学防癌是应用天然的或合成的化学物质来阻断、抑制或治疗癌症的过程，这一过程与肝内的Ⅱ相代谢酶的作用有关．研究表明，Keap1/Nrf2/ARE 信号传导通路能有效地诱导Ⅱ相代谢酶基因的表达，而这一作用是作为碱性亮氨酸拉链蛋白家族的转录因子nrf2从胞质蛋白keap1上解离，然后转位至核内并与ARE 结合后完成．这一传导通路机制加深了我们对于化学防癌机制的认识，并且为化学防癌药物的筛选提供了有效的靶点．就以Keap1/Nrf2/ARE 传导通路为靶点的化学防癌药物的国内外研究进展进行了综述．关键词：化学预防；Nrf2；Ⅱ相代谢酶；Keap1；ARE 中图分类号：Q55文献标识码：A文章编号：1000-5846（2012）03-0199-08*作者简介：芦秀丽（1973－），女，北京人，辽宁大学生命科学副教授，研究方向为生物化学与分子生物学．基金项目：辽宁省高等学校优秀人才支持计划资助项目（LJQ2011004）收稿日期：2012－05－180引言癌症是环境和遗传因素相互作用而引起基因突变和其他生物大分子改变积累的结果，其过程涉及到启动、促进和发展等多阶段的复杂的过程．为了有效预防癌症，我们可以利用毒性较低的天然或化学合成物质，抑制前体化合物形成真正的致癌物，并阻止其与细胞内的大分子，如DNA 、RNA 或者蛋白质接触和反应，并进一步将其完全排到体外，从而达到预防、抑制或者逆转癌症发生的效果，这一过程即癌症的化学预防．化学预防是癌症预防的最为主要和有效的手段之一，针对作用于癌症过程的不同阶段，化学预防剂可以分为两大类：（1）阻断剂：其作用机制是阻止前体物形成致癌物并阻止致癌物达到其靶点，包括抑制致癌物的产生和活化、增强抗氧化酶和加强解毒能力等；（2）抑制剂：其作用机制是抑制肿瘤的促进和发展、阻止启动细胞获得恶性表现而变成恶性，包括诱导细胞凋亡和促进细胞分化、抑制鸟氨酸脱羧酶和环氧化酶、抑制新生血管形成、抗炎活性和加强细胞间缝隙的链接等［1］．化学致癌物的体内生物转化主要是依靠肝脏的Ⅱ相和Ⅱ相代谢酶来完成的．化学致癌物经Ⅱ相酶（如细胞色素P450）作用下加入羟基以增加其亲电子活性，接着在肝脏中Ⅱ相代谢酶［如谷胱甘肽转硫酶（GST ）、NADP （H ）、醌氧化还原酶（NQO1）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGT ）］［2］的作用下，在其已产生的羟基的基础上再进一步糖基化从而增强其亲水性而排出体外．与Ⅰ相酶不同的是II 相代谢酶的诱导不会增加致癌风险，因此诱导II 相代谢酶的活性是化学防癌的关键步骤．近年来，在一些II 相代谢酶基因的上游启动子区域发现了一段抗氧化反应元件（antioxidant response element ，ARE ），这一序列只对一些具有抗氧化能力的外来物反应，且具较强的专一性．目前证实，碱性亮氨酸拉链蛋白家族的转录因子nrf2（nuclear factor E2p45－related fac-tor2）被激活后，发生核内转位，与maf等转录因子形成杂化二聚体结合到ARE元件［3］，参与下游II相代谢酶基因的调控［4］．目前，已证实多种化学预防剂可通过nrf2/ARE机制诱导II相代谢酶表达，作为II相代谢酶的强力诱导剂的异硫氰酸酯是研究的比较多的一种抗肿瘤的物质，能显著诱导体内大鼠膀胱组织和体外膀胱细胞中GST和NQO1酶的表达［5］．下面就这些化学预防剂的研究现状进行综述．1Nrf2与Keap1作用机制在一般条件下，nrf2能被蛋白酶体迅速的降解，这种降解是通过他的一种特殊的、针对Cul3泛素链接酶复合物的衔接蛋白keap1来完成的．利用酵母双杂交筛选分析技术研究发现，Keap1（kelch－like ECH－associated protein1）是一种存在于胞质的、锚定于肌动蛋白的细胞质蛋白，与果蝇管家结合蛋白kelch属于同系物．Keap1包含三个重要的结构域：N端BTB结构域（broad com-plex，tramtrack，and bric－a－brac），一个linker结构域，和一个C端kelch结构域．BTB区的作用是介导keap1二聚化，与nrf2－keap1结合力有关，BTB区ser－104突变影响Keap1二聚化，可干扰keap1锚定nrf2的功能．Linker结构域富含半胱氨酸，对keap1的激活至关重要．C端kelch结构域包含六个保守的kelch重复序列，是keap1与nrf2的neh2区结合位点，也是keap1与胞浆内肌动蛋白结合区位［6］．Keap1中半胱氨酸残基与II相酶诱导物的结合可以通过探针、酶学、放射标记和uv色谱等方法进行证明，巯基的氧化或共价修饰是识别Ⅱ相代谢酶诱导物并与之反应的重要细胞感应器．巯基的修饰改变keap1的结构，从而降低了keap1/nrf2的稳定性，并使nrf2解离下来从而转运到细胞核中与maf等转录因子形成二聚体后结合到Ⅱ相代谢酶基因5'上游的ARE元件启动子区，进而活化Ⅱ相代谢酶基因的转录［7］．在针对其功能位点的加成和氧化实验中表明keap1结构的变化导致了keap1从cul3上解离了下来从而抑制了nrf2的降解．研究发现一些化合物可以与keap1发生反应改变其结构，促使其泛素化并降解，从而使与之结合的nrf2解离下来转运到细胞核中与其他转录因子结合后链接到ARE通路，启动第Ⅱ相解毒酶和抗氧化应激蛋白基因的转录，提高细胞抗氧化损伤能力（如图1）［8］．所以针对keap1的结构筛选出能与之活性位点反应进而改变其构象，从而活化keap1/nrf2/ARE通路的化合物的研究工作已经成为当今社会预防癌症的最有效的策略之一．图1醌还原酶诱导化学预防的机制［9］2Keap1的高活性半胱氨酸残基研究2．1Keap1蛋白的结构域Keap1是一个以BTB－KELCH为底物的能反应nrf2稳定水平的衔接蛋白，蛋白所包含的半胱氨酸残基在氧化应激反应中起着相当重要的作用，其中在BTB功能域的cys151和IVR上的两个临界半胱氨酸残基273和288对于抑制nrf2的活性起着一定的作用．已有的实验数据已经证明了keap1上的kelch结构域能有效的结合到具有高度保守DxETGE序列的nrf2蛋白的某一肽段上，通过天冬氨酸和苏氨酸残基的作用，能在kelch的顶端表面形成了一个结合口袋从而使两者更好的连接．图2keap1蛋白的各个结构域（NTR：N terminal region；BTB：broad complex，tramtrack，and bric－a－brac；IVR：intervening region；DGR：double glycine repeat；CTR：C terminal region．）002辽宁大学学报自然科学版2012年2．2Keap1的高活性半胱氨酸残基研究通过质谱法的研究在人体和鼠类的keap1中发现使nrf2活性的化合物能与半胱氨酸形成共价化合物［10］（如dexamethasone21－mesylate与cys－257，273，288，297和613位点；iodoacetyl－N－biotinylhexylenediamine/biotinylated iodoacet-amide（IBA/BIA）与cys－196，226，241，257，288和319位点；sulforaphane与cys－77，226，249，257，489，513，518和583位点；xanthohu-mol与cys－151，319和613位点；isoliquiritige-nin与cys－151和226位点；以及10－shogaol与cys－151，257和368位点）．这些实验都证明了nrf2的活化物可以与keap1以共价加成的方式发生反应，改变keap1的构象进而释放nrf2到细胞核中启动第Ⅱ相解毒酶和抗氧化应激蛋白基因的转录，但进一步的研究表明能有效的活化nrf2的活化剂与keap1的反应不仅仅是加成反应，他们之间也可以发生氧化等诸多的作用机制．在稳定的细胞内环境的条件下，因为依赖Cul3的E3泛素连接酶介导nrf2的氨基端的neh2功能域在赖氨酸44、50、52、56、64和68位点泛素化，nrf2维持在一个较低的水平［11］．Nrf2的neh2功能域可以被keap1的kelch领域的羧基端所获取，进而形成二聚体以及与BTB功能域氨基端的相互作用后连接到cul3上［12］．但是并不是所有的keap1上的半胱氨酸的突变都可以影响到keap1构象，也就是说某一半胱氨酸的突变不一定影响到keap1的结构和功能，但是当keap1的结构和功能发生变化的时候，一定是半胱氨酸突变所造成的结果［13］．Cys151位点的突变可以使亲电体和氧化剂诱导的keap1从cul3解离下来，这一现象在体内对于nrf2泛素化的实验中得到了证明．无论是cys273或者是cys288的突变都会抑制keap1导致nrf2泛素化的能力，并且这一抑制是通过nrf2的核内定位以及nrf2定向基因的转录来完成的［14］．研究表明，在keap1的插入区域，无论是氧化修饰还是亲电体加成都会导致keap1的kelch功能域从一个较低亲和力的nrf2/DLG结合位点上解离下来．就Ub－E2共轭酶来讲，kelch/DLG的缺失是影响neh2功能域定位的基本条件，并能抑制nrf2的泛素化［15］．这一模型可以有效的应用在半胱氨酸的突变与keap1结构和功能之间变化的关系的分析上面，但是当前的keap1/nrf2之间的化学计量关系以及其外部形态的可塑性还需要进一步的调整．表一简单的介绍了当今的cysteine加成和氧化反应的研究进展．BMCC：1－biotinamido－4－（4'－［maleimi-diethylcyclohexane］－carboxamido）butane［10，17］．GSSG：glutathione disulfide［12］．IAB：N－iodoacetyl－N－biotinylhexylenedia-mine［17，18］．ISO：isoliquiritigenin［10］．Ligustilide［19］．SHO：10－Shogaol［10］．SUL：sulforaphane［20］．XAN：xanthohumol［10］，X*IAB addition to Cys residue in vivo．Murine Keap1denoted in col-umns identified using blue numbers．DEM：diethylmaleate［21］．DEX#：dexamethasonemesylate adduction to murine Keap1［22，23］．NAPQ1：N－acetyl－p－benzoquinonei-mine［23］．15d－PGJ2：15－deoxy－Δ12，14－prosta-glandin J2［21，23］．2．3作用于keap1－nrf2通路药物的分类2．3．1氧化作用具有强氧化作用的H2O2对于keap1有着相当重要的氧化作用．通过分析海拉细胞中HA－keap1氧化还原态的异常表达来评判H2O2能否氧化keap1．来源于未经处理的细胞裂解液中的HA －keap1被β巯基乙醇还原后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，在 70KDa处出现一条单一条带；在相同情况下，氧化还原被抑制，则在相同的分子量处出现大量条带．在非氧化还原状态下，经过H2O2五分钟处理的细胞裂解液中提取的keap1在102第3期芦秀丽，等：化学防癌药物keap1－nrf2信号通路活化剂的研究进展70KDa处的条带亮度减弱，并有2条较小迁移率的带出现，并可观察到有OxIM量的增加，OxIM 对应着分子内的二硫化物，从而影响到聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移率．这一实验现象表明了H2O2能有效地作用到keap1并伴随着二硫化物的产生［24］．2．3．2迈克尔加成反应迈克尔加成反应是亲电的共轭体系（电子受体）与亲核的负碳离子（电子给体）进行的共轭加成反应．在keap1/nrf2/ARE通路中，keap1上的半胱氨酸残基对于nrf2活化物间的反应也以加成反应为主，下面就不同的反应位点对于keap－nrf2通路药物进行一下分类．表1半胱氨酸不同位点与众多化合物之间关系［16］Domain DEX GSSG IAB ISO LIQ SHO SULF XAN DEM DEX#NAPQ115d－PGJ2BMCC FAL N－terminus12ˑˑ13ˑˑˑ23ˑˑ38ˑˑˑˑBTB77ˑˑˑˑˑˑ151ˑˑˑˑˑˑˑˑˑ171IVR196ˑˑˑˑˑ226ˑˑˑˑˑˑˑ241ˑˑ249ˑˑˑ257ˑˑˑˑˑˑ273ˑˑˑˑˑˑˑ288ˑˑˑˑˑˑˑ297ˑˑˑˑˑKelch319ˑˑˑˑˑˑˑˑ368ˑˑˑˑˑˑ395ˑ406434ˑˑˑˑˑ489ˑˑˑˑˑˑˑˑˑˑ513ˑˑ518ˑˑˑC－terminus583ˑˑˑ613ˑˑˑˑˑˑˑˑ622ˑˑ624ˑˑ注：a，上表根据文献17内容并进行一定增加．b，表中第一竖行是keap1的功能域；第二竖行是kelch上能够连接到nrf2或者有利于你靶基因表达的氨基酸残基；其中BMCC、DEX、GSSG、IAB、ISO、LIQ、SHO和SULF分别是与人体作用的，而XAN DEM、DEX#、NAPQ1和15d－PGJ2则是与鼠类作用．2．3．2．1主要作用于cys151位点的药物多种研究方法证明，主要作用于cys151位点而发挥二相酶诱导作用的成分主要有isoliquiriti-genin、10－shogaol、xanthohumol、diethylmate和fal-carindiol．用胰蛋白酶对keap1进行消化，模型生物素基化的亲电体甲基巴豆辅酶A羧化酶可以通过FT－ICR－MS以及LC－MS－MS测量人类keap1蛋白修饰后的烷基化半胱氨酸残基的量，这一方法也同样适用于isoliquiritigenin、10－shog-aol和xanthohumol这三种物质对于keap1作用的鉴定［25］．Dem在斑马鱼实验模型中进行keap1特异性靶点的研究，通过对全标本包埋的4天的原位杂交斑马鱼幼虫中谷胱甘肽－S－转移酶1的分析结果表明，加入dem的实验组中谷胱甘肽－202辽宁大学学报自然科学版2012年S －转移酶1的表达量要高于空白对照组，表明了dem 与keap1－nrf2可以有效的作用．下面的15d －PGJ2、D3T 、sulforaphane 、tBHQ 也可以通过这一实验得到证明［26］．Falcarindiol 这一物质在NMR 分析中能显示出其连接丁二炔的碳在与半胱氨酸残基形成巯基时可以充当着亲电子的部分，加成反应过程中运用矩阵辅助激光飞行时间质谱法和循环二色相质谱法可以检测出其烷基化半胱氨酸残基并改变其二级结构的现象，进而有效地活化keap1－nrf2信号通路［27］．2．3．2．2主要作用于cys273和cys288的迈克尔受体分子实验表明主要作用于cys273和cys288的受体分子有IAB 、ligustilide 、DEX#、NAPQI 、15－de-oxy －Δ12、15d －PGJ2．IAB 在进行生物素标记后，作为巯基活性亲电体的他可以诱导HepG2细胞中的ARE1胸苷激酶绿色荧光蛋白表达出绿色的荧光，并且在HEK293细胞中诱导了nrf2的积累及血红素氧化酶的产生．同样的反应在tBHQ 的作用下也可以发生．在HePG2－A RE －C8细胞中进行的ARE 表达基因活性的分析证明，在剂量一定的条件下，经过藁本内酯诱导24小时后，ARE 的荧光素酶的表达活性提高了，这一实验中以当归提取物为对照组，从而证明了藁本内酯对于癌症的治疗有一定的作用．NAPQ1是醋氨酚的代谢产物，可以通过修饰半胱氨酸残基活化nrf2在肝脏细胞中的通路，诱导适当的防预RNAi 定向的反应，在经过MS 分析后，其是有选择的修饰了keap1中的半胱氨酸残基，进而表达keap1．2．3．2．3主要作用于cys294的物质DEX#、sulforaphane 能有效地作用到cys294位点．实验证明，DEM 在GSH /GSSG 氧化还原电对发生变化时伴随着keap1中的半胱氨酸残基对于氧化应激反应．一定条件下加入过量的碘乙酰胺和胰蛋白酶后的keap1产生的肽图可以通过LC －MS 进行分析，并且GSH 被同等浓度的GSSG 置换后，其中13个原始的甲酰胺化的肽是稳定的，其他的则检测不出来．在同等的条件下，针对不同的GSH /GSSG 比值，在甲酰胺化合色氨酸溶胞作用后就能分析出不同的半胱氨酸对于keap1的不同的影响．Sulforaphane 是一种基于十字花科的异硫氰酸盐，通过修饰keap1上的巯基来诱导ARE 通路的Ⅱ相酶和nrf2转录因子的抗氧化剂基因的表达从而完成防癌作用．Sulfora-phane 通过对keap1的特异性修饰，在体外可以应用LC －MS －MS 进行检测其加成反应的完成，也可以通过2．2．2．1中的斑马鱼模型得到验证［26］，从而达到修饰后构象的变化．2．3．2．4主要作用于其他位点的药物经实验证明，BMCC 、GSSG 也能有效地作用302第3期芦秀丽，等：化学防癌药物keap1－nrf2信号通路活化剂的研究进展到keap1蛋白上［25］．BMCC 在与IAB 的对照实验中，经过MS －MS 分析，IAB 修饰的是keap1中的中心连接域，而BMCC 修饰的是其他区域，在用这两种物质处置FLAG －keap1转染HEK293后，产生了高分子量的keap1，并可以通过免疫印记法和MS －MS 得以验证．2．3．2．5主要作用于keap1但是位点未明的药物TBHQ 、2，3－dimercaptoprotanol 、1，2－dithiole －3－thione 三种物质可以作用到keap1上，但其具体作用位点尚不明确．2，3－dimercaptoprotanol 可以在以arsenic 为基础下通过FLAHS 和PAO 进行探针检测其与keap1的结合，在结合的部位产生强荧光现象，通过免疫印记和MS －MS ［28］得到验证［29］．3总结化学防癌是癌症预防的重要策略之一，其中通过keap1/Nrf2/ARE 通路诱导Ⅱ相代谢酶基因的表达是化学防癌的重要机制．作为一种能通过被称为抗氧化剂应答元件或亲电体反应元件的常见的DNA 调控元件所调控的能转录细胞保护基因的转录因子，nrf2在Ⅱ相酶基因表达诱导中发挥着至关重要的作用．随着对于ARE 调控区域的解析以及keap1和nrf2之间相互作用的进一步的了解，更多的有效的防癌化合物将会被发现，我们对于化学防癌机制的认识也将会更深一步，从而更好的促进化学防癌研究工作的发展，为我们发现和设计潜在的抗癌药物提供了新的思路和方法．参考文献：［1］Naghma Khan ，Farrukh Afaq and ，Hasan Mukhtar．Cancer Chemoprevention Through Dietary Antioxida-nts ：Progress and Promise ［J ］．Antioxidants ＆Redox Signaling．March ，2008，10（3）：475－510．［2］YE She －fang ，HOU Zhen －qing ，ZHONG Li －ming ，ZHANG Qi －qing．Role of Nrf2/ARE in che-moprevention of cancer ［J ］．Chinese Journal of Cancer Prevention and Treatment ，February ，2007，14（3）：222－225．［3］Momoko Kimura ，Tae Yamamoto ，Jianyong Zhang ，etal．Molecular Basis Distinguishing the DNA Binding Profile of Nrf2－Maf Heterodimer from That of Maf Homodimer ［J ］．The Journal of Biological Chemistry ，2007，282：33681－33690．［4］Aldo Giudice and Maurizio Montella．Activation of 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agentsulforaphane［J］．Chem．Res．Toxicol．18：1917－1926．［23］Kobayashi，M．，Li，L．，Iwamoto，N．，Nakajima－Takagi，Y．，Kaneko，H．，Nakayama，Y．，Eg－uchi，M．，Wada，Y．，Kumagai，Y．，Yamamoto，M．，2009．The antioxidant defense system K－eap1－Nrf2comprises a multiple sensing mechanism forresponding to a wide range of che－mical compounds［J］．Mol．Cell．Biol．29：493－502．［24］Dinkova－Kostova，A．T．，Holtzclaw，W．D．，Cole，R．N．，Itoh，K．，Wakabayashi，N．，Katoh，Y．，Yamamoto，M．，Talalay，P．，2002．Direct evidencethat sulfhydryl groups of Keap1are the sensors regu-lating induction of phase2enzymes that protect a-gainst carcinogens and oxidants［J］．Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．99：11908－11913．［25］Copple，I．M．，Goldring，C．E．，Jenkins，R．E．，Chia，A．J．，Randle，L．E．，Hayes，J．D．，Kitteri－ngham，N．R．，Park，B．K．，2008．The hepatotoxicmetabolite of acetaminophen directly activates the502第3期芦秀丽，等：化学防癌药物keap1－nrf2信号通路活化剂的研究进展Keap1－Nrf2cell defense system［J］．Hepatology48：1292－1301．［26］YU Hong，ZHUANG Qingqi；经Nrf2/ARE通路发挥化学防癌作用的天然化合物［J］．Pharm Care＆Res2008Jun；8．［27］Simon Fourquet，Rapha？l Guerois，Denis Biard，and Michel B．Toledano．Activation of NRF2by Ni-trosative Agents and H2O2Involves KEAP1DisulfideFormation［J］．Biol Chem．2010March12，285（11）：8463－8471．［28］YU Fu－xian；LIUYang；YAN Dong．Determination of diclofenac in human plasma by LC－MS/MS［J］．Chinese Journal of New Drugs2011，20（9）：806－728．［29］nkova－Kostova AT，Holtzclaw WD，Kensler TW：The role of Keap1in cellular protective responses［J］．Chem Res Toxicol2005，18（12）：1779－1791．Progress in Research on Cancer Chempreventive AgentActivating Keap1－nrf2SignalingLU Xiu-li1，2*，ZHANG Yong1，2（1．Life Science School，Liaoning University，Shenyang110036，China；2．Technology Center for Computer Simulation of Biological Macromolecule and InformationProcessing Engineering of Liaoning Province，Shenyang110036，China）Abstract：Chemoprevention comprises multiple intervention methods using either pharmacological or dieta-ry agents to impede，arrest or reverse carcinogen esis at various stages，which is associated with hepatic phase Ⅱdetoxifying enzymes．This protective function is mediated mainly by nuclear factor keap1/E2－related fac-tor/antioxidant responsive element（Keap1/Nrf2/ARE）pathway．It is proved that Nrf2，a member of the bas-ic－leucine zipper family of transcription factors，is dissociated from cytoplasmic protein Keap1firstly in re-sponse to activation by chemopreventive agents，then translocated into nucleic，and binding with the antioxi-dant response element（ARE）to induce expressions of phaseⅡenzyme genes．This pathway provides the ef-fective target for chemopreventive drug screening．The progress of study on the chemopreventive drug activa-ting the phase II enzyme pathway is reviewed in the present paper．Key words：chemoprevention；nrf2；phaseⅡmetabolic enzymes；keap1；ARE（责任编辑李超）602辽宁大学学报自然科学版2012年。
NRF2-KEAP1信号通路的研究进展
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《雷帕霉素诱导经Nrf2途径增强肿瘤相关巨噬细胞功能在膀胱癌进展中的作用》
《雷帕霉素诱导经Nrf2途径增强肿瘤相关巨噬细胞功能在膀胱癌进展中的作用》一、引言膀胱癌是一种常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均较高。
近年来，随着肿瘤微环境研究的深入，越来越多的学者开始关注肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）在肿瘤进展中的作用。
其中，雷帕霉素作为一种免疫调节药物，在肿瘤治疗中具有重要地位。
本文旨在探讨雷帕霉素诱导经Nrf2途径增强肿瘤相关巨噬细胞功能在膀胱癌进展中的作用。
二、文献综述1. 膀胱癌与肿瘤相关巨噬细胞膀胱癌的发生和发展与肿瘤微环境密切相关，其中TAMs是肿瘤微环境中重要的组成部分。
TAMs能够通过分泌细胞因子、生长因子和酶等物质，促进肿瘤的生长、侵袭和转移。
2. 雷帕霉素与Nrf2信号通路雷帕霉素是一种免疫调节药物，能够通过多种途径发挥抗肿瘤作用。
其中，Nrf2信号通路是雷帕霉素发挥抗肿瘤作用的重要途径之一。
Nrf2信号通路能够调节细胞的氧化应激反应和炎症反应，从而影响TAMs的功能。
三、研究内容1. 研究方法本研究采用体外实验和动物实验相结合的方法，探讨雷帕霉素诱导经Nrf2途径增强TAMs功能在膀胱癌进展中的作用。
2. 实验结果（1）体外实验结果：通过细胞实验发现，雷帕霉素能够显著增强TAMs的活性，促进其分泌细胞因子和生长因子等物质。
同时，雷帕霉素能够激活Nrf2信号通路，从而影响TAMs的功能。
（2）动物实验结果：通过构建膀胱癌小鼠模型，发现给予雷帕霉素治疗后，小鼠的肿瘤生长得到抑制，TAMs的浸润程度也明显降低。
同时，Nrf2信号通路的激活程度与TAMs的功能呈正相关。
四、讨论本研究结果表明，雷帕霉素能够通过激活Nrf2信号通路增强TAMs的功能，从而抑制膀胱癌的进展。
这一发现为膀胱癌的治疗提供了新的思路和方法。
首先，雷帕霉素作为一种免疫调节药物，能够通过调节TAMs的功能来抑制肿瘤的生长和转移。
其次，Nrf2信号通路在调节TAMs功能中发挥了重要作用，因此针对Nrf2信号通路的调控可能成为治疗膀胱癌的新策略。
Nrf2相关知识普及
精心整理
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Reference:FreeRadicalBioMed.2012,52,973-982.
附：泛素与泛素化
泛素是一类低分量的蛋白质，泛素化是指泛素分子在一系列酶作用下，对靶蛋白进行特异性修饰的过程。
泛素化修饰涉及泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的一系列反应:首先在ATP供能的情况下酶E1粘附在泛素分子尾部的Cys残基上激活泛素；接着,E1将激活的泛素分子转移到E2酶上；随后,E2酶和一些种类不同的E3酶共同识别靶蛋白,对其进行泛素化修饰。
E3酶的外形就像一个夹子,靶蛋白连接在中间的空隙内，酶的-侧结构域决定靶蛋白的特异性识别,另一侧结构域定位E2酶以转移泛素分子。
蛋白质泛素化的结果是使得被标记的蛋白质被蛋白酶分解为较小的多肽、氨基酸以及可以重复使用的泛素。
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图2 Keap1的主要功能区分布示意图
什么是ARE
ARE（antioxidant response element）即抗 氧化反应元件，是一个特异的DNA-启动子结 合序列。
Reactive Oxygen Species
Reactive Oxygen Species
Reactive Oxygen Species
Nrf2传导通路
冷应激及其危害 目的意义 Nrf2-ARE通路的调控机理
冷应激：
通常是指家禽对温度突然下降(10℃以上)的 环境刺激或是长期处于低温环境下 (4℃以下 ) 所产生的一系列生理或病理反应，既有抗损 伤反应的发生，也有病理损伤的出现，关键 取决于应激反应的强弱和鸡对ctive Oxygen Species
Nrf2-ARE通路
冷应激的危害：
冷应激对鸡的危害表现为生长缓慢，饲料 报酬降低，蛋鸡产蛋率明显下降，发病率高 及死亡率高等。冷应激对体温调节功能还不 完善的雏鸡的影响更大且死亡率也高。
目的意义
冷刺激 → 自由基变化 → 氧化应激。因此研究 Nrf2-ARE通路对鸡冷应激的调控机理，主要 是为了探索冷应激的科学解决方法，对提高
什么是Keap1
Keap1 （ Kelch 2 like ECH2 associated protein 1) ）即 Kelch2 样 ECH2 相关蛋白，是 Nrf2 在细胞质中的结合蛋白，主要通过结合 Nrf2 使之无法进入细胞核，从而抑制 Nrf2 的 活性,避免引起细胞对应激源的敏感性升高。
应激预防水平，保障畜牧业发展有重要意义。
什么是Nrf2
Nrf2(nuclea factor erythroid-2-related factor
2)即核因子E2相关因子2，它是一种氧化应激
基本表达的关键转录因子，存在于全身多个
器官，它的缺失或激活障碍直接引起细胞对
应激源的敏感性变化。
图1： Nrf2的主要功能区分布示意图