杀菌剂生讲义物测定技术

抑菌圏法的优缺点
抑菌圏法的优点
精确度高 操作简单
抑菌圏法的缺点
溶解性 扩散性
抑菌圈法示意图
含有孢子 的培养基
不同浓度 的药液
根据施加药剂在洋菜培养基表 面的方式，抑菌圈法又分为管碟法 （牛津杯法）、滤纸片法、孔碟法。
管碟法 又称牛津杯法
（1） 用灭菌蒸馏水将供试药剂配制成一系列 梯度浓度，一般5~7个浓度。 （ 2 ） 制备一定“浓度”的供试菌悬浮液（如 真菌，则宜用孢子悬浮液），浓度以在低倍镜 （15X10倍）下每视野80一100个左右孢子为宜。
抑制率计算
孢子萌发率（%）＝萌发孢子数/检查孢子数X100 若对照组有20%以上孢子不萌发，则应重做。
对照萌发率－处理萌发率 抑制孢子萌发率（%）＝－－－－－－－－－X100
对照萌发率
LC50 和LC95的计算
将抑制孢子萌发率换算成机率值，作为Y； 药剂的浓度以对数值来表示作为X，直线回归， 求得回归方程Y＝a+bx，可得LC50和LC95.。
（3）待培养基冷至50℃左右（凭经验估计）， 迅速吸取10ml菌液加入培养基内，充分混合后， 倒入灭菌的培养皿中，制成含菌培养基平板。
（4）在每皿培养基上按合适的间隔放置6个 不锈钢小管（即牛津杯，外径8.0士 0.lmm。 内径6.0士0.1mm，高10.0士0.lmm），其中1 个管为对照，其余5管为5个不同浓度的药液， 在适合的温度下培养一段时间，取出用十字 交叉法测是抑菌圈的直径。
用十字交叉法测量抑菌圈的直径
孔碟法
二、杀菌剂生物测定的应用
1 从大量合成化合物中筛选出有可能作为 杀菌剂的化合物
2 为特定的植物病害寻找有效的药剂，为 此需要进行筛选杀菌剂毒力的比较
3 杀菌剂作用方式及作用机制的研究
4 杀菌剂抗性的研究 5 杀菌剂混用及剂型研究 6 杀菌剂抗雨水冲刷能力及残效作用的研究 7 某些杀菌剂（特别是农用抗菌素）的微量分析
水稻稻瘟病菌（Piricularia oxyzae） 小麦赤霉病菌 (Gibberella zeae) 小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis） 玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum） 玉米弯孢病菌（Curvularia lunocto） 棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium） 枯草杆菌（Bacillus subtilis） 白菜软腐病菌（Erwinia carotovora sub sp.carotovora） 水稻白叶枯病菌（Xanthomonas campestrispv.oryzae） 等。
三、杀菌剂室内主要生测方法
孢子萌发法 含毒介质培养法
叶碟法
管碟法 滤纸片法 孔碟法 生长速率法 最小浓度法
抑菌圈法
1.孢子萌发法
孢子萌发法是历史最悠久而广泛被采用 的 杀 菌 剂 毒 力 测 定 方 法 。 早 在 1807 年 。 Prevost 就采用此法，后经不少学者改进， 使之日趋规范、合理。
常用的供试菌种
番茄灰霉病菌（Botrytis cintrea） 番茄早疫病菌（Alternaria solani） 辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici） 苹果轮纹病菌（Physalospora berengeriana） 苹果炭疽病菌（Glomerella cingulata） 苹果腐烂病菌（Valsa mali） 葡萄黑痘病菌（Elsinoe ampelina） 葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplodiella）
（4）用消毒镊子夹取灭菌的圆形滤纸片
（直径为0.6或0.8cm）投入不同浓度药液 中，1分钟后取出，放入含真菌孢子的 培养基上，每皿放6片（5个浓度各1片， 另1片为对照片），恒温培养一定时间， 测抑菌圏直径。
注意事项
各滤纸片间距要适合，以防形成的抑菌圈 不园
放滤纸片时要平放、更迅速、准确、放下 后不能再移动
抑菌圈法示意图
注意事项
上述操作应尽量在无菌条件下进行，
以防污染
操作室的温度最好在26～28℃左右，
如室温太低，则50℃左右的培养基在操作 过程中迅速冷凝，无法制作平板
十字交叉法测量抑菌圈的直径 ，消除误
差
滤纸片法
（1） 配制不同浓度的药液
（2） 配孢子悬浮液
（3） 制含孢子的平板
前三步完全和上述管碟法相同
2.含毒介质培养法
有3种： （1）抑菌圈法 （2）生长速率法 （3）最小浓度法
（1）抑菌圈法的原理
基本原理是在已经接种供试菌的洋菜培养基 （通常在培养皿内）表面，利用各种方法（管 碟法，滤纸片法，孔碟法 ）使药液和培养基接 触，恒温培养一定时间后，由于药剂的渗透扩 散作用，施药部位周围的病菌被杀死或生长受 到抑制，从而产生了抑制圏。根据抑菌圈的大 小来比较不同杀菌剂的毒力大小。
原理：都是将供试药剂附着在载玻片上或其 他平面上，然后将供试病菌孢子悬浮液滴在 上面（或将施于悬浮液和药液混合后滴在玻 片上），在保温，保温条件下培养一定时间 后镜检，以孢子萌发率判断杀菌剂毒力。孢 子萌发法的突出优点是快速，试验当天即可 获得结果，尤其适合于保护剂的筛选。
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孢子萌发的标准
以病菌孢子作为指示物进行杀菌剂毒力测定。 用孢子液和不同浓度的药液混合，恒温保湿培养， 培养一定时间后即可检查孢子萌发率。一般在低 倍镜下，每处理随机检查200个孢子。
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杀菌剂生物测定技术
杀菌剂室内生物测定的主要内容 是将杀菌物质作用于细菌、真菌或 其他病原微生物，根据其作用的大 小来判定药剂的毒力。或将杀菌物 质施于植物，对病害发生的有无或 轻重观察比较来判定药剂的效果。
一、供试菌种
供试病原菌要求
在分类上有一定代表性，最好是重要的农 业植物病害的病原菌， 而且容易培养， 多代繁殖不易产生变异。
孢子萌发法的适用范围
孢子萌发法只适用于产生孢子的真菌。 一般的供试病菌有： 马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans） 水稻稻瘟病菌（Piricularia oryzae） 小麦赤霉病菌（Gibberella zeae） 玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）