第2章 细胞培养-2

对培养中的细胞提供某些保护作用
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使用血清的缺点：

可能改变某种细胞在体内的正常状态。 血清中含有一些物质对细胞会产生毒性作用 每批血清之间都有差别，其成分不能保持一致 取材过程有可能带入支原体、病毒，对培养的细胞 产生潜在影响，可能导致实验失败或实验 结果的不
可靠性
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血清的质量标准
• 表面张力较低
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细胞膜下皮质层:
微丝(microfilament,MF)
中等纤维(intermediate filament,IF) 微管(microtubule,MT)
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动物细胞之间的连接形式
• 紧密连接(tight junction)
• 间隙连接(gap junction)
• 隔壁连接(separate junction)——无脊椎动物细胞 • 中间连接(intermediate junction)——脊椎动物细胞 • 桥粒连接(desmosome junction)
长期传代发生偏离二倍体现象
2.细胞性别 Barr小体 Y小体
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体内外细胞的差异及培养细胞的分化
• 体内外细胞的差异 • 培养细胞的分化
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细胞培养液
• 常用液体
1.水 2.平衡盐溶液 3.消化液 4.消化酶抑制液
5.pH调整液
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平衡盐水BSS
成分： 无机盐
葡萄糖
作用：
维持渗透压，调节pH， 供给能量和无机离子
1912-1946
Culture Chicken Embryo Fibroblast
Plasma+tissue homogenate 在没有抗生素的条件下，使鸡胚心脏细胞维持生存 34年，先后传代3400次。
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•1934年 •1937年 •1940年
荷兰温特
发现生长素，并证实了对植物细胞
培养的作用
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消化酶抑制液
大豆胰酶抑制液 •终浓度：0.1% ~ 0.5% 常以DMEM/F12培养液配制
•过滤除菌
•-20 ℃保存
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pH调整液
1) 3.7％，5.6％，7.4％NaHCO3溶液 0.22μ m滤膜过滤除菌 NaHCO3+H2O Na++OH-+ H2O+CO2
2) HEPES 0.22μ m滤膜过滤除菌
用途:
作为培养基的基础液 洗涤组织、细胞等
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常用:Hanks液 Earle液 PBS
配制要求:防止钙沉淀 良好的缓冲作用
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细胞消化液:
1) 胰蛋白酶(trypsin)溶液
浓度——0.125%和0.25% 最适条件——pH8.0 37 ℃
配制——无Ca2+、Mg2+及血清的平衡盐溶液 2) 乙二胺四乙酸二钠(EDTA)溶液 Versen液，常用浓度0.02％ 3) 其他：链霉蛋白酶，骨胶原酶，透明质酸酶
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细胞器的化学组分：
• 有机分子：蛋白质类（结构蛋白，分泌蛋白，酶等）
脂类（磷脂，卵磷脂，脑磷脂，心磷脂） 多糖类（糖脂，糖蛋白等） 核酸类（DNA,RNA等） 固醇类（胆固醇等）
•无机分子：水（结合水，游离水）
无机离子（Na+,K+,Ca2+,Mg2+)
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细胞质膜生物学特性：
• 对水具有很强的通透性 • 对脂溶性物质的通透性大于非脂溶性物质 • 电阻率很高，一般在109－1011Ω ／㎝
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合成培养基
1951年,Earle——Earle基础合成培养基MEM
(minimum essential media) 无机盐 氨基酸：12种必需氨基酸 维生素 碳水化合物：葡萄糖 （酚红）
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基本组分：
合成培养基常见种类:
MEM DMEM(Dulbecco’s modified Earle medium) RPMI 1640 199,109培养基
间。 •1902年 哈泊兰德 预言植物细胞的全能性 •1903年 Jolly 将蝾螈的白细胞保存在悬滴中并维持了1个月。 •1906年 Beebe&Ewing 在动物的血液中尝试培养了传染狗淋巴肉 瘤病毒的细胞。
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1907年
Ross Harrison （美国）
将蛙胚神经管区的一片组织移植到蛙的淋巴液凝块中，
这些组织在体外不但存活若干周，而且居然从细胞中 长出了轴突（神经细胞）。 意义：１．公认的组织培养开始标志； ２．解决了轴突发生的争论； ３．培养方法－－将培养物放在盖玻片上并 倒置于凹玻片腔中培养。
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1923 Alexis Carrel (surgeon) Aseptic techniques Carrel Flask
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天然培养基
血清 组织提取液 鸡胚汁
鼠尾胶原
水解乳蛋白
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血清
• 种类: 小牛血清
牛血清：
新生牛血清
胎牛血清
马血清
鸡血清 兔血清 羊血清
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主要成分：
• 各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激 素、无机物等。
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血清的主要作用：
提供基本营养物质 提供贴壁和扩展因子 提供激素和各种生长因子 提供结合蛋白
HamF10, HamF12——适合于单个细胞分离培养
McCoy’s 5A——适合于原代细胞培养，适合于较难培
养的细胞的培养
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无血清培养基
无血清培养基即不需要添加血清就能维持细胞在体外较 长时间生长繁殖的合成培养基。
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基础培养液
HamF12
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DMEM
促贴壁物质 促生长因子及激素 添加组分 酶抑制剂 结合蛋白和转运蛋白
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抗生素溶液：
• 青、链霉素(双抗) 青霉素——抑制细菌细胞壁的合成 100U/ml
链霉素——抑制细菌蛋白质的合成
• 卡那霉素
100μ g/ml
• 制霉菌素
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谷氨酰胺补充液
• 溶液中不稳定 • 过滤除菌 • -20 ℃保存
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培养基——天然培养基、合成培养基
营养成分： 氨基酸：L型 单糖：葡萄糖 维生素 其他成分 ：核酸降解物、抗氧化剂等 促生长因子及激素 pH 渗透压
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稳定期(stationary phase)
培养空间和营养物质有限
代谢废物积累
新分裂细胞数=死亡细胞数
（稳定期）
注：细胞代谢活动仍在进行中
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衰亡期(senescence phase)
营养物的耗尽
有害物质作用
死亡细胞数>分裂细胞数 （衰亡期）
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培养细胞的遗传学特征
1.染色质与染色体 原代培养多呈二倍体
高特里特,诺比考特(法) Earle 几乎同时离体培养 了胡萝卜组织，并使细胞增殖 建立了可无限传代的C3H小鼠的结缔组 织细胞系－L系（曾在体外经甲基胆蒽
转化）。
•1951年 Gay 建立了人第一个细胞系－－人体宫颈癌 Hela细胞系（原报道为鳞癌，1971年更
正为腺癌）。
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动物细胞的生长
动物细胞特性: 真核细胞基本结构：亚显微水平(<0.2μ m) 膜囊结构——质膜，核膜，内膜系统 纤维结构——染色质，细胞骨架系统 颗粒结构——核糖体
S ——时间较恒定，平均6-8hr
G2——对环境敏感
M ——持续时间很短
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细胞系的生长过程
• 细胞在培养中存活时间的长短，主要取决于细胞的种类、性
状、和原供体的年龄等。
•三个生长阶段： 原代培养期——从体内取出组织接种培养到第一次传代的 阶段，一般维持1~4周。
传代期
衰退期
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每代细胞的生长过程
每代细胞一般经过三个生长阶段：
潜伏期
指数生长期
停止期（平台期）
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群体细胞的生长过程
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潜伏期(1atent phase)
初代培养细胞贴壁较慢，约24—96小时，
连续细胞系和恶性细胞系贴壁较快，<24小时。
潜伏期
细胞接种量——接种量大比接种量小的潜伏期短
潜伏期长短
细胞种类——初代培养细胞潜伏期长
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微量元素
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种类：
1) 不含蛋白质，只有成分已知的小分子物质和带微量
元素的聚合物，价格便宜，适于某些确立的细胞系；
2)
含有纯大分子物质，如蛋白质、激素等。适用 的细胞株较多，但成本较高，大多无血清培养 基属于此类；
3)
所含成分不完全清楚，以成分简单、成本低而 适于大规模生产使用。
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细胞培养发展历史
•1885年 Wilhelm Roux 将鸡胚髓板在温热的盐水中维持存活 若干天，是有记录的第一个体外移植成功的例子。 •1887年 Amold 把桤木的木髓碎片接种到蛙皮下，当白细胞侵入 到木髓碎片后，他将这些白细胞收集到盛有盐水的小碟
中，接下来观察到这些白细胞在运动，并存活一个短的时
培养基性质
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对数生长期(logarithmic growth phase)
对数生长期——最具活力时期（细胞分裂旺盛，分 裂相增多。） 细胞分裂指数(mitotic index，MI) MI＝(分裂相个数／1000个细胞)×100％ 接触抑制(contact inhibition) 正常细胞会因为细胞接触而发生相 互抑制分裂和限制运动的现象。
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培养细胞的生物学特征
上皮细胞型 1.贴壁型细胞 成纤维细胞型
游走细胞型
多形性细胞 2.悬浮型细胞
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培养细胞的生长特点
1.贴附 影响因素：离子（Ca2+) 机械、因子）