第八章 酶的固定化
酶的固定化
3.扩散限制效应
酶固定化使生物催化反应从均相转化为多相，于是产 生了扩散阻力：
●
外扩散阻力是底物从宏观环境向酶颗粒表面传递过
程中的一种扩散限制效应，发生在固定化颗粒周围的液膜
层。它会使底物在固相酶周围形成浓度梯度，通过增加搅 拌速度和底物流速的方法可以减少外扩散效应。
●
内扩散阻力是指底物分子达到固相酶表面后传递到
缺点：
● ● ●
固定化时，酶活力有损失； 增加了生产的成本，工厂初始投资大； 只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物， 与完整的菌体相比不适于多酶反应，特别是需要辅 胞内酶必须经过酶的分离手续。
对大分子底物不适宜；
●
助因子的反应；
●
三、影响固定化酶性质的因素
分配效应 空间障碍效应 扩散抑制效应
在具体选择时，一般应遵循以下几个原则：
（1）必须注意维持酶的构象, 特别是活性中心的构象。
（2）酶与载体必须有一定的结合程度。
（3）固定化应有利于自动化、机械化操作。 （4）固定化酶应有最小的空间位阻。 （5）固定化酶应有最大的稳定性。 （6）固定化酶的成本适中。
1.吸附法
吸附法（Adsorption） 是通过载体表面和酶分子 表面间的次级键相互作用 而达到固定目的，是固定 化中最简单的方法。只需 将酶液与具有活泼表面的 吸附剂接触，再经洗涤除 去未吸附的酶便能制得固 定化酶。
●
●
●
1.分配效应
由于载体和底物的性质 差异引起了微环境和宏观 环境之间的性质不同。微 环境是在固定化酶附近的 局部环境，而将主体溶液 称为宏观环境。由这种不 同造成的底物、产物和各 种效应物在两个环境之间 的不同分配，被称为分配 效应。
2.空间障碍效应
酶与细胞的固定化
发酵液中含菌体少，有利于产品的分离纯化，提高产品质量等
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
• 缺点：酶与载体相互作用力弱，酶易脱落等 1）引入功能团和间隔臂；
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方 固定化后酶的哪些主要性质发生了变化?变化的趋势及原因分析.
常见非共价法?常见共价法?
法。 少量的持续不断的配基的脱落;
交联法由于不需要活化基团,所以条件比较温和,酶活的回收率比较高? 活力回收:指固定化后固定化酶(或细胞)所显示的活力占被固定的等当量游离酶(细胞)总活力的百分比. 第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。颗粒状占 绝大多数，它和线条主要用于工业发酵生产 ，薄膜主要用于酶电极。酶管机械强度较大 ，主要用于工业生产。
固定化酶的优势：
① 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶 液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；
② 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱 连续反应
③ 酶反应过程能够加以严格控制； ④ 较游离酶更适合于多酶反应； ⑤ 在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； ⑥ 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ⑦ 酶的使用效率提高、成本降低。
在中性pH下优先与a-氨基反应,因此有一定的选择性 缺点：在包埋过程发生的化学反应同样会导致酶的失活。
• 优点：酶活性中心不易被破坏，酶高级结构 二、载体活化程度和固定化配基密度的测定
固定化过程中，酶分子空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；
用此法制备的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。
酶的固定化方法
多媒体教学参考资料/备课资料
酶的固定化方法
酶的固定化方法不下百种，归纳起来大致可以分为三类，即载体结合法、交联法和包埋法。
载体结合法是指将酶固定到非水溶性载体上的方法。
根据固定方式的不同，这种方法又可以分为物理吸附法、离子结合法和共价结合法。
物理吸附法是指将酶吸附到固体吸附剂表面的方法，固体吸附剂多为活性碳、多孔玻璃等。
离子结合法是指通过离子键将酶结合到具有离子交换基团的非水溶性载体上的方法，载体有离子交换树脂等。
共价结合法是指酶和载体以共价键的形式结合在一起的方法，这种方法需要酶和载体都具有氨基、羧基或羟基等官能团。
交联法是指通过双功能试剂，将酶和酶联结成网状结构的方法。
交联法使用的交联剂是戊二醛等水溶性化合物。
包埋法是指将酶包裹在多孔的载体中，如将酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶等高分子凝胶中，或包裹在硝酸纤维素等半透性高分子膜中。
前者包埋成格子型，后者包埋成微胶囊型。
清华同方教育技术研究院。
酶的固定化技术
摘要：酶的固定化技术是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。
酶的固定化技术已经成为酶应用领域中的一个主要研究方向。
经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。
因此酶的固定化技术研究已成为十分引人注目的领域。
本文简要介绍了固定化酶技术的概念、制备方法(包括传统固定化技术、传统固定化技术的改进方法、新型固定化技术) 及其在化学化工、食品行业、临床医药、生物传感器和环境科学等领域中的应用现状与存在的问题,并对固定化酶技术的应用前景进行了展望。
关键词：固定化酶；制备；应用；磁性载体；定向固定固定化酶的研究始于1910年,正式研究于20世纪60年代,70年代已在全世界普遍开展。
酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。
与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。
固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。
固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。
物理方法包括物理吸附法、包埋法等。
物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。
但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用。
化学法是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法。
酶的固定化方法-共价偶联法和交联的比较
3.吸附法：
①物理吸附法
将酶吸附到固体吸附剂表面的方法，对蛋白质有高度的吸附能力、又不引起酶变性且能保持一定酶活性。如：活性碳、多孔玻璃、石英砂、有机硅等酶固体吸附剂。
②离子交换法
利用蛋白质的两性性质，使其带有电荷的基团与离子交换剂
形成离子键，而被交换结合在交换剂上酶和载体结合不牢固，在使用过程中容易脱落，所以使用 受到限制。
学生的问题：教材上说酶的固定方法主要有四类，即吸附法、共价偶联法、
交联法和包埋法等，那么，共价偶联法和交联法有什么区别？
固定化酶技术即将酶固定在一定空间
内的技术（如固定在不溶于水的载体上）。将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。
吸附法和共价偶联法又可统称为载体结合法。
2.交联法－之间相互交联呈网状结构的固定化方法。
其中使用最广泛的是戊二醛。戊二醛和酶蛋白中的游离氨基发生 反应，从而使酶分子之间相互交联形成固定化酶。
但是，交联法中酶的活性中心构造可能受到影响，而使酶失活明显。
4.包埋法
包括凝胶包埋法和微胶囊包埋法，将酶包裹在多孔的载体中，包埋成格子型或包埋成微胶囊型。
固定化酶技术的优点：（1）使酶既能与反应物接触，又能与产物分离；（2）固定在载体上的酶可以被反复利用。
1．共价偶联法
是将酶与聚合物载体以共价键结合的固定化方法。酶中的氨基、羧基、巯基、羟基、咪唑基、吲哚基、苯环等常与载体共价结合
但必须注意，参加共价结合的氨基酸残基应当是酶催化活性非必需基团，如若共价结合包括了酶活性中心有关的基团，会导致酶的活力损失。
《酶的固定化》课件
稳定性评估可 以帮助选择合 适的固定化方 法，提高酶的
固定化效果
稳定性评估还 可以帮助优化 固定化酶的生 产工艺，降低
生产成本
固定化酶的使用寿命
固定化酶的稳定性：在固定化过程中，酶的活性和稳定性得到提高
固定化酶的寿命：固定化酶的寿命通常比游离酶长，可以延长酶的使用寿命
固定化酶的再生：固定化酶可以通过再生技术恢复活性，延长使用寿命
添加标题
酶的固定化可以减少污染，提高环 保性能
酶的固定化可以简化生产工艺，提 高生产效率
酶的固定化未来 发展展望
新技术的开发与应用
酶固定化技术的发展：从传统的物理吸附到新型的化学键合 新型酶固定化技术的应用：在生物催化、生物制药、环境保护等领域的应用 酶固定化技术的挑战：如何提高酶的活性和稳定性，降低成本 酶固定化技术的未来：开发新型酶固定化材料，提高酶的固定化效率和稳定性，拓展应用领域
酶的固定化应用
环境保护：酶的固定化可以用 于污水处理、废气处理等领域
生物催化：酶的固定化可以 提高反应速率和选择性
食品加工：酶的固定化可以用 于食品加工，如酿酒、制糖等
医药工业：酶的固定化可以用 于药物合成、药物分析等领域
酶的固定化技术
吸附法
原理：利用酶与载体之间的物理或化学作用力，使酶固定在载体上 优点：操作简单，成本低，固定化效果好 缺点：酶活性易受载体影响，固定化后酶活性降低 应用：广泛应用于生物催化、生物制药等领域
提高固定化酶的稳定性与活性
改进固定化技术：提高酶的固 定化效率和稳定性
优化酶分子结构：提高酶的活 性和稳定性
筛选和优化固定化载体：提高 酶的固定化效率和稳定性
研究酶的固定化机制：为提高 酶的稳定性与活性提供理论支 持
第八章酶工程
按现代观点，酶工程主要包括以下内容 ① 酶的大量生产和分离纯化及它们在细胞外的应用 ② 新颖酶的发现、研究和应用 ③ 酶的固定化技术和固定化酶反应器 ④ 基因工程技术应用于酶制剂的生产与遗传修饰酶的研究 ⑤ 酶分子改造与化学修饰以及酶结构与功能之间关系的研究 ⑥ 有机介质中酶的反应 ⑦ 酶的抑制剂、激活剂的开发及应用研究 ⑧ 抗体酶、核酸酶的研究 ⑨ 模拟酶、合成酶以及酶分子的人工设计、合成的研究
第八章-酶工程
2023/12/28
第八章酶工程
酶工程
一． 概述 二． 酶的命名和分类 三． 酶的化学本质、来源和生产 四． 酶催化反应机理及反应动力学 五． 酶的固定化和固定化酶反应器 六． 酶工程的应用 七． 酶工程的研究进展
第八章酶工程
一 酶和酶工程的概述
（一）、 酶的概念 （二）、 对酶的认识和研究历程 （三）、 酶工程的概念
通过适应、诱导、诱变以及基因工程等方法 培育出新的高产酶的菌株。
第八章酶工程
微生物细胞产生的酶分类 结构酶：在细胞的生长过程中出于其自身需要而表达， 诱导酶：加入相应的诱导剂后才会表达，诱导剂一般是
该酶所催化反应的底物或产物。 一般而言，野生型微生物需要经过遗传改造后，才能变
为高产酶的菌株。其方法包括 ① 物理诱变育种 ② 化学诱变育种 ③ 基因工程构建
第八章酶工程
3）发酵条件控制 营养条件 环境条件，注意溶氧浓度、温度、pH值 特别注意剪气力对蛋白质的影响，因为在高剪
切力下，蛋白质容易失活。 注意发酵的泡沫，因为蛋白质是表面活性剂，
大量的蛋白质积累在发酵液中使得在鼓泡条 件下很容易形成泡沫，影响发酵正常操作。 因此应该考虑除泡装置，并添加消泡剂。
第八章酶工程
第八章酶在果蔬类食品生产中的应用
研究表明，用果胶酯酶和聚半乳糖醛酸酶处理 苹果汁有很好的效果，但大部分商品酶对柠檬 汁、酸橙汁等pH值低的果汁的澄清作用不理想， 原因主要是过低的pH值抑制了酶的活性，研究 发现利用酶作用的产物即聚半乳糖醛酸可以起 到澄清作用。
固定化多酶系统（果胶酶、淀粉酶）
现在的研究趋向是使用固定化的多果胶酶系统 讲行果汁澄清，这些酶中包括降低果汁粘度、 降解果实组织的酶，甚至包括除去果汁中淀粉 的淀粉酶系统，因为一般果汁中都含有一些淀 粉，这些淀粉的存在会引起贮藏过程中果汁的 混浊，必须除去。
基因枪原理
导入ACC合成酶反义基因的番茄
Hamilton等于1990年首次构建了ACC氧化酶反 义RNA转基因番茄，在纯合转基因番茄果实中， 乙烯的合成被抑制了97%，从而使果实的成熟 延迟，贮藏期延长。导入ACC合成酶反义基因 的番茄也得到了类似的结果。转基因番茄的乙 烯合成也被抑制了99.5%，果实中不出现呼吸 跃变，叶绿素降解和番茄红素合成也都被抑制。 果实不能自然成熟，不变红，不变软，只有用 外源乙烯处理6天后才能使转基因番茄正常成 熟。因此，利用反义基因技术可以成功的培育 耐贮藏果蔬。
8.3 控制酶的基因表达进行果 蔬保鲜
控制果实成熟的酶
促进果实和器官衰老是乙烯最主要的生理功能。 在果实中乙烯生物合成的关键酶主要是乙烯在 直接前体—1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(ACC 合成酶)和ACC氧化酶。在果实成熟中这两种 酶的活力明显增加，导致乙烯产生急剧上升， 促进果实成熟。
基因技术控制酶的表达
在对这两种酶基因克隆成功的基础上，可以利 用反义基因技术抑制这两种基因的表达，从而 达到延缓果实成熟，延长保质期的目的。利用 反义RNA技术抑制酶活力已有许多成功的例子， 其中最成为成功的就是延缓成熟和软化的反义 RNA转基因番茄。
酶的固定化
13
吸附法 包埋法 共价结合法通过载体表面 和酶分子表面间的次级键相 互作用而达到固定目的的方 法. 只需将酶液与具有活泼 表面的吸附剂接触,再经洗 涤除去未吸附的酶便能制得 固定化酶.是最简单的固定 化技术,在经济上也最具有 吸引力.
常用的固体吸附剂有活性炭,氧化铝, 活性炭,氧化铝, 活性炭 硅藻土,多孔陶瓷,多孔玻璃,硅胶, 硅藻土,多孔陶瓷,多孔玻璃,硅胶,羟 基磷灰石等. 基磷灰石 操作简便,条件温和,不会引起酶变性 失活,载体廉价易得,而且可反复使用 由于靠物理吸附作用,结合力较弱 结合力较弱,酶 结合力较弱 与载体结合不牢固而容易脱落,所以使用 受到一定的限制.
离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂. 世界第一例获得工业应用的固定化酶是 DEAE-Sephadex A-25吸附的氨 基酰化酶反应用于 DL-AA的光学分析.
16
2,包埋法(Entrapment) 包埋法(Entrapment)
包埋法是将游离酶包埋于格子或微胶囊内 包埋法是将游离酶包埋于格子或微胶囊内,格子的结构 格子 可以防止酶渗出到周围的培养基中, 可以防止酶渗出到周围的培养基中,而底物分子仍能渗 入格子内与酶接触. 入格子内与酶接触. 包埋类型可有:网格型,微囊型及脂质体液膜型. 包埋类型可有:网格型,微囊型及脂质体液膜型.
15
根据吸附剂的特点又分为两种: 根据吸附剂的特点又分为两种:
物理吸附法是通过氢键,疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载
体的方法. 常用的载体有:高岭土,皂土,硅胶,氧化铝,磷酸钙 胶,微空玻璃等无机吸附剂,纤维素,胶原以及火棉胶等 有机吸附剂. 离子结合法是指在适宜的pH和离子强度条件下,利用酶的侧链 解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法 (离子键). 最常用的交换剂有CM-纤维素,DEAE-纤维素,DEAE葡聚糖凝胶等;其他离子交换剂还有各种合成的树脂如 Amberlite XE-97,Dowe X-50等.
【中图版】高中生物选修一34《酶的固定化》PPT课件
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固定化细胞的优点 (1)固定化细胞含有一系列的酶，可以催化一系列的反应。 (2)反应的条件较易控制。 (3)使用时间更长。
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1．生产酒精时，使用固定化细胞比固定化酶更好，原因不包括( ) A．固定化细胞中含有一系列酶(与生产酒精有关) B．固定化细胞比固定化酶更经济、成本更低 C．固定化细胞需要提供营养物质 D．固定化细胞比固定化酶对环境条件要求低
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(4)制备固定化大肠杆菌的步骤为： ①______________________________________________________________； ②______________________________________________________________； ③______________________________________________________________； ④______________________________________________________________。
优点
催化效率高、耗能低、 污染低
①既能与反应物接触， 又能与产物分离 ②可以反复利用
成本低，操作容易、 寿命长
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①固定化细胞使用的都是活细胞，因此应提供一定的营养物质。 ②固定化细胞由于保证了细胞的完整性，因而酶的环境改变较小，酶活性受 外界影响也较小。
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二、固定化酶的制备及利用 1．酶的固定化：(1)18.6%的 CaCl2 溶液和甲醇溶液处理(10 s)，冲洗、吸干。 (2)3.65 mol/L 的盐酸水解(45 min)，蒸馏水冲洗至中性。 (3)在 5%的戊二醛溶液中浸泡(20 min)。 (4)0.1 mol/L 的磷酸缓冲液洗涤，(多次)吸干。 (5)放 1 mg/mL 的木瓜蛋白酶溶液中(4 ℃处理 3.5 h)。 ↓
《酶的固定化》课件
02
03
酶的固定化步骤：
实验 木瓜蛋白酶的固定化
取出尼龙布，用0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH值7.8）反复洗涤，洗去多余的戊二醛，吸干之后，立即用酶液（0.5～1mg/mL）在4℃下固定3.5h（酶液用量每块尼龙布不宜超过0.8mL）。
从酶液中取出尼龙布（保留残余酶液作测定用），用0.5mol/L NaCl溶液（用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.2）配制），洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。
热处理法只适用于热稳定性较好的酶的固定化，在热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活。
（4）热处理法
步骤step
总体积Volume(ml)
总活力Total activity(u)
总蛋白Total protein(mg)
比活力Specific activity(u/mg)
纯化倍数Purification(fold)
缺点
（2）固定化（增殖）细胞的优点和缺点
（3）固定化细胞的制备（P169-178）
一般说，对于一步和两步反应的转化过程，用固定化酶较合适；对多步转化，采用整体细胞有利。
合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙等）
ⅰ.优点：酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。 ⅱ.缺点：反应条件苛刻，操作条件复杂； 酶蛋白高级结构变化，破坏活性中心，活力降低。
1
2
3
4
5
6
1
重氮法
2
叠氮法
3
烷基化反应法
4
溴化氰法
⑤载体活化方法
A．重氮法
反应示意式
NH2
NaNO2/HCl
.缩短发酵周期，提高生产能力（产率）；
酶的固定化方法及优缺点
酶的固定化方法及优缺点以酶的固定化方法及优缺点为标题，本文将详细介绍酶的固定化方法以及各种方法的优缺点。
一、酶的固定化方法1. 物理吸附法：将酶直接吸附在固体载体表面，如活性炭、硅胶等。
这种方法简单易行，不需要化学反应，但酶容易失活和流失。
2. 共价键结合法：通过化学手段将酶共价键结合在载体表面，常用的方法包括交联、酯化、酰胺化等。
这种方法能够稳定地固定酶，但可能会影响酶的活性和稳定性。
3. 包埋法：将酶包裹在多孔载体中，如凝胶、微胶囊等。
这种方法能够保护酶免受外界环境的影响，但可能会降低酶的反应速率。
4. 共聚物法：利用聚合物将酶固定在载体上，如聚丙烯酰胺凝胶、聚乙烯醇等。
这种方法可以提高酶的稳定性和反应速率，但可能会影响酶的活性。
二、各种固定化方法的优缺点1. 物理吸附法的优点是操作简单、成本低廉，但缺点是酶容易失活和流失，固定效果不稳定。
2. 共价键结合法的优点是能够稳定地固定酶，固定效果较好，但缺点是可能会影响酶的活性和稳定性。
3. 包埋法的优点是能够保护酶免受外界环境的影响，固定效果较稳定，但缺点是可能会降低酶的反应速率。
4. 共聚物法的优点是可以提高酶的稳定性和反应速率，固定效果较好，但缺点是可能会影响酶的活性。
在实际应用中，选择适合的固定化方法需要考虑多个因素，如酶的特性、反应条件、载体的稳定性和成本等。
不同的固定化方法适用于不同的酶和反应条件。
例如，对于温度敏感的酶，可以选择物理吸附法或包埋法；对于活性较强的酶，可以选择共价键结合法或共聚物法。
总结起来，酶的固定化方法有物理吸附法、共价键结合法、包埋法和共聚物法等。
每种方法都有其优缺点，选择适合的固定化方法需要综合考虑多个因素。
通过固定化方法，可以提高酶的稳定性、反应速率和重复使用性，从而在酶工业和生物催化领域具有广泛的应用前景。
酶固定化
酶的固定化摘要：水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水的但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。
在催化反应中以固相状态作用于底物。
关键词：固定化酶；不溶于水；包埋法；活性中心；功能基团。
正文：固定化酶（immobilized enzyme）不溶于水的酶。
是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的。
酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。
便于运输和贮存，有利于自动化生产。
固定化酶是近十余年发展起来的酶应用技术，在工业生产、化学分析和医药等方面有诱人的应用前景。
固定化酶的研究始于1910年,正式研究于20世纪60年代,70年代已在全世界普遍开展。
酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。
与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。
固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。
固定化酶操作的注意事项1．活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定化酶时，需要在非常严密的条件下进行。
2．功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固定化结合。
3．酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。
固定化的优点：1．不溶于水，易于与产物分离；2．可反复使用；3．可连续化生产；4．稳定性好。
酶的固定化方案
酶的固定化的方案一、材料和方法1.实验材料及试剂酶，25%戊二醛溶液，带氨基的载体，考马斯亮蓝，牛血清白蛋白。
2. 主要实验仪器紫外可见光分光光度计Uv-1800，THZ一C恒温振荡器，MD200一3型电子天平PHS一3C酸度计3.酶的固定化方法1）载体的活化a 对所得的载体表面带有大量的氨基，对其进行活化处理可用于酶蛋白的共价结合。
采用戊二醛为活化试剂，使凝胶表面连接上游离的醛基。
具体方法为:将lg带氨基的载体颗粒臵于3ml、10%的戊二醛溶液中振荡24h，然后真空过滤。
所得固体用去离子水洗涤多次，干燥后即为戊二醛活化的树脂颗粒。
b大孔树脂预处理方法：称取10g树脂于锥形瓶中，用95%的乙醇浸泡24h，真空抽滤，用1L蒸馏水冲洗。
树脂依次用25mL的5%HCl和5%NaOH溶液浸泡4h后抽滤，用蒸馏水洗至中性。
抽滤后臵于4℃冰箱中干燥4h，室温保存备用。
举例：称取适量经预处理的大孔树脂于50mL锥形瓶中，加入适量磷酸缓冲液（pH7.5，0.05mol/L）和适量的酶，臵于恒温水浴振荡器中吸附一定时间后（37℃，150r/min）真空抽滤，并用100mL缓冲液冲洗载体，抽干后臵于4℃冰箱中干燥4h，并于4℃冰箱中密封保存。
2）固定化方法a 共价结合法准确称量20g戊二醛活化的树脂颗粒臵于50ml的离心管中，向其中加入体积为2ml的一定浓度的酶液(酶粉溶于pH7.0、0.03M的磷酸缓冲液)。
然后于冰浴中缓慢振荡24h。
之后离心收集固体，用相同的磷酸缓冲液洗涤固体5次以上。
b 酶聚集体包被法准确称量20g戊二醛活化的树脂颗粒臵于50ml的离心管中，向其中加入体积为2ml的一定浓度的酶液(酶粉溶于pH7.0、0.03M的磷酸缓冲液)。
然后于冰浴中缓慢振荡24h。
之后向混合液中加入0.5ml、2%的戊二醛溶液，继续振荡10h，离心收集固体。
最后用相同的磷酸缓冲液洗涤固体5次以上。
c.酶活性的测定d. 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度固定化时溶液中的蛋白质含量采用考马斯亮蓝染色法测定：考马斯亮蓝试剂的配制：将考马斯亮蓝 G-250 100mg 溶于 50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至 1000mL。
第八章 现代酶工程技术
Flash1
(四） L-苹果酸生产
L—苹果酸是一种重要的有机酸， 在医药和食品工业中有广泛用途。L— 苹果酸生产途径有（1）用葡萄糖直接 发酵：（2）用延胡索酸为原料酶法合 成；目前国内L—苹果酸工业化生产主 要是用延胡索酸为原料的酶法合成。普 遍使用的包埋载体是卡拉胶（K— carrageenan）。
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三、 固定化酶技术 （一）固定化技术概述 （二）酶和菌体固定化技术 （三）固定化细胞的反应器
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（一）固定化技术概述
• 概说：酶已广泛应用工业及家庭日常生活 中。如 • 1、淀粉酶都采用酸解法，现在很多都用 酶解法。家庭所用甜酒药就是根霉。我们 知道还有 • 2、蛋白酶（如酱油、豆腐乳等）； • 3、果胶酶（如酒类澄清、白莲脱皮）； • 4、脂肪酶（如皮毛脱脂）等。
2．酶促效率明显提高 和固定化酶不同，菌体细胞在固定 化过程中通常不损伤细胞本身，细 胞内的酶系统也最大限度地保持着 天然状态，因此它具有较高的酶促 效率。
3．热稳定性增强 如恶臭假单孢菌经包埋后 最适反应温度较游离细胞提高 20℃，而且热稳定性也增强。
4．易产生副反应
微生物菌体细胞内含有庞大而复杂的酶系 统，其中一些酶在生产时是我们不需要的， 某些酶甚至是有害的，它们可催化生产影 响产品质量的物质。如包埋黄色短杆菌 （产延胡索酸酶）生产L—苹果酸时，便有 副产物琥珀酸产生，它是影响产品出口的 主要因素。生产上一般采用胆汁酸处理固 定化细胞，可显著降低琥珀酸的含量。
（四）菌体包埋 （1）卡拉胶熔化 生理盐水500Kg，卡拉胶20Kg， 加入1.5m3的搪瓷罐中，开搅拌， 夹套加热，升温到100℃，保温 10min，卡拉胶彻底熔化。降温到 50℃，夹套保温备用。
（四）菌体包埋 （2）混合 湿菌体114Kg，加100Kg生理盐水 放另一搪瓷罐中混匀，保温45℃， 然后压入卡拉胶罐中，恒温45℃， 搅拌10min。
酶的固定化
选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。
1）离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法所用载体是某些不溶于水的离子交换剂。
常用的有：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。
2）共价键结合法载体基质通常是水不溶性的，这些载体包括：（1）天然载体：琼脂、琼脂糖、几丁质、纤维素、胶原蛋白等；（2）有机合成聚合物：聚亚胺酯、聚环氧丙烷、聚乙烯醇、尼龙等（3）无机载体：玻璃、氧化铝、硅胶、磁铁矿、氧化镍等。
用于连接载体的酶蛋白氨基酸残基上的反应功能基团有：Asp Glu侧链的—COOH、C-末端的—COOH；Tyr的苯酚基；Cys的—SH；Lys的ε-NH2、N-末端—NH2；Thr、Ser的—OH；His的咪唑基。
在酶的固定化过程中，由于疏水性氨基酸通常被掩藏在酶蛋白分子的内部，所以疏水性氨基酸通常不参与形成共价键。
载体活化方法：（1）重氮化法（2）叠氮法（3）溴基化法（4）烷基化法等。
4、交联法借助双功能试剂使酶分子之间、酶分子之内、酶与惰性载体间进行相互交联，制成网状结构的固定化酶的方法，称为交联法。
常用的双功能试剂有戊二醛、已二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮联苯等。
其中戊二醛最为常用，酶表面含有不止一个—NH2，戊二醛与酶上的-NH2发生Schiff反应，形成席夫碱，形成一个复杂的酶交联网络。
交联酶法借助双功能试剂使可溶性酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。
可视为一种无载体的固定化方法。
如木瓜蛋白酶在0.2%酶蛋白浓度，2.3%戊二醛，pH5.2～7.2，0℃下交联24h，可制成固定化酶。
共交联法共交联法是指酶分子在双功能试剂的作用下，与一些惰性蛋白或水不溶载体之间发生交联，可降低单纯酶分子之间交联反应所引起的活性丧失。
通常选用的惰性蛋白有牛血清蛋白、卵清蛋白、明胶、胶原蛋白、血红蛋白等。
如一定量的脲酶加入到2.5mL含6%牛血清蛋白、0.2%戊二醛的0.02mol/L 磷酸缓冲液中，混合均匀后降温至-30℃，再升温至4℃，静置4h，形成泡沫状聚合物，冷冻干燥后，即为固定化酶。
酶的固定化
(2)离子交换吸附法: 这是将酶与含有离予交换基的 水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法。酶吸附 较牢，在工业上颇具广泛的用途。常用的载体有阴离 子交换剂，如二乙基氨基乙基(DEAE)-纤维素、混合胺 类（ECTEDLA）—纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)—纤维 素、DEAE—葡聚糖凝胶、Amberlite IRA—93、410、 900等。阳离子交换剂基，如羧甲基(CM)—纤维素、纤 维素柠檬酸盐、Amberlite CG50、IRC—50、IR—200、 Dowex—50等。
载体的选择
载体直接关系到固定化酶的性质和形成。对载体的一般 要求是: ①一般亲水载体在蛋白质结合量和固定化酶活力及其稳定 性上都优于疏水载体。 ②载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度。 ③载体必须含有在温和条件与酶共价结合的功能基团。 ④载休没有或很少有非专一性吸附。 ⑤载体来源容易、便易、并能反复使用。
E.多孔玻璃的氨基硅烷衍生物。 玻璃的化学改造物多孔玻璃在丙酮中与Y—氨基丙基三氧 乙烷硅回流加热，生成烷基胺玻璃:
烷基氨玻璃用对硝基苯酚氯处理后，再还原，转变为芳香基衍 生物:
此芳香基衍生物经重氮化后与酶结合．产生固定化酶。
取代反应 具有卤素取代的高聚物以及含有卤乙酰基的高聚物，在 碱性条件下，与酶分子上的氨基、酚基、巯基等反应，如： 将纤维素在二恶烷(Diaxanc)-溴乙酸中与嗅乙酰溴反应，形成溴 乙酰纤维素，可供胰蛋白酶、糜蛋白酶和核糖核酸酶之固定化：
His
Lys
A. 多糖类的芳香族氨基衍生物。我国独创的使用对-β-硫酸脂 乙砜基胺(ABSE—)多糖(纤维素，葡聚糖，文联琼脂糖，交联琼 脂及淀粉) 载体。在碱性条件下用对-β-硫酸脂乙砜基胺活化多 糖，制得的醚键连接的乙砜基苯胺衍生物，经重氮化后偶联酶：
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5.5 固定化酶的应用
1．固定化酶在工业生产中的应用
现已用于工业生产的固定化酶主要有： ① 氨基酰化酶 ② 葡萄糖异构酶 ③ 天门冬氨酸酶 ④ 青霉素酰化酶 ⑤ 延胡索酸酶 ⑥ β －半乳糖苷酶 ⑦ 天门冬氨酸-β -脱羧酶 ⑧ 脂肪酶 ⑨ 植酸酶
2. 固定化酶在酶传感器方面的应用
酶传感器是由固定化酶与能量转换器（电极、场效应管、离 子选择场效应管等）密切结合而成的传感装置，是生物传感 器的一种。 广泛用于临床诊断、工业发酵过程控制和环境监测等领域。
游离酶的不足：
1. 不稳定：在高温、高压、强酸、强碱下易失活，
即使在最适条件下反应；
2. 回收困难，不能重复使用：经济上不合算；
3. 反应速度减慢，不容易与毒副分子和产物分离。
酶的固定化
什么是固定化酶？
水溶性酶 水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶（固相酶、固定化酶） 固定化酶：固定在一定载体上并在一定的空间范围内 进行催化反应的酶。
包埋法
离子键结合 法 共价结合法
交联法
可用的交联试剂多，技术简 反应条件较激烈，致使酶活力损失较大， 易，酶的结合力强，稳定性 而且制备成的固定化酶颗粒较小，给使用 高，可长期使用 带来不便。
制作方便，酶活力高，稳定 只适用于热稳定性好的酶 性高
热处理法
5.1.3 固定化酶的特性
（1）酶的活性 ：
5.2 细胞固定化
固定在载体上并在一定空间范围内进行生命活动（生长、
繁殖、新陈代谢）的细胞。
固定化细胞的分类
分类方式 固定化细胞 分类方式 固定化细胞 死细胞:完整细胞,细胞碎片, 细胞器 活细胞:增殖细胞,静止细胞, 饥饿细胞
微生物
细胞类型 植物 动物 生理状态
5.3 原生质体固定化
原因之一:细胞壁对物质扩散的障碍 原生质体
四、交联法：借助双功能试剂使酶分子之间
发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联 法。 交联的形式：
（1）酶直接交联法 （2）酶与辅助蛋白交联法
各种固定化方法的优缺点比较
固定化 方法
制备难易 结合程度 活力回收 再生 固定化成本 底物专一性 结合法 包埋法 难 强 低 不能 高 可变 较难 强 高 不能 低 不变 吸附法 易 弱 高，酶易 流失 可能 低 不变 交联法 较难 强 中等 不能 中等 可变
（4）酶的最适pH
a.载体性质的影响
带负电荷载体 ： 带正电荷载体 ： 最适pH 向酸性偏移。
b. 产物性质对最适pH值的影响
产物为酸性：最适pH值高一些； 产物为中性：最适pH值一般不改。
最适pH 向碱性偏移。 产物为碱性：最适pH值低一些；
（5）米氏常数 米氏常数Km反映了酶与底物的亲和力。使固定化酶Km变
固定化酶的优点
增加酶稳定性，可反复或连续使用，提高使用效 率，降低成本
易于和反应产物分开，产物溶液无酶残留，简化 提纯工艺
酶反应过程可严格控制
较游离酶更适合多酶反应
增加产物收率，提高产物质量
5.1.1 酶的固定化方法
固定化方法
吸附法
结合法
交联法
包埋法
离子键 结合法
共价键 结合法
网格型
微型
B. 半透膜包埋法(微囊）：
将酶或细胞包埋于由各种高分子聚合物（直径几十微
米～几百微米，厚约25mm的半透膜）制成的小球内，制成
固定化酶或固定化细胞。(适用于产物、底物分子量小的）
① 常用载体———半 透膜有：聚酰胺膜、 火棉胶膜 ② 制备方法：将酶液 滴分散在与水互不相 溶的有机溶剂中，再 在酶液滴表面形成半 透膜，将酶包埋在微 胶囊之中。
离子键
易 中等 高 可能 低 不变
共价键
各种酶固定化方法的比较
方 法 优 点 缺 点
吸附法
制作条件温和、简便、成本 结合力弱，对pH、离子强度、温度等因素 低、载体再生、可反复使用 敏感，酶易脱落，酶的装载容量较小 操作简单，固定化酶活力较 仅可用于低分子量的底物，不适用于柱系 高，适用性广。 统，常有扩散限制问题 条件温和，操作简便，活力 由于离子键结合力弱，酶与载体之间结合 损失小，结合量大。 不牢固，在pH、离子强度等条件改变时， 酶易脱离。 载体与偶联方法可选择性大 偶联条件激烈，易引起酶失活；成本高， ；酶的结合力强，非常稳定 某些偶联试剂有一定毒性，制作较繁琐
微生物细胞和植物细胞除去细胞壁后就可获得 (1)保护了原生质体 (2)利于氧的传递、营养成分的吸收和胞内产物的分泌
一般采用网格包埋法（即凝胶包埋法）。 常用凝胶：琼脂凝胶，海藻酸钙凝胶，角叉菜胶和光交联树
脂。
注意：一般要加渗透压稳定剂，以防止原生质体破裂。
（二）固定化原生质体的特点 有利于胞内物质的分泌 稳定性好 有利于产物的分离纯化 需添加渗透压稳定剂
1. 同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次的使用； 2. 易与底物、产物分开有利于控制生产过程；产物溶液
中没有酶的残留，简化了提纯工艺；
3. 在绝大多数情况下提高了酶的稳定性；
4. 较能适应于多酶反应；
5. 提供了研究酶动力学的良好模型。
固定化酶的缺点：
（1）酶固定化时酶的活力有所损失。
（2）增加了固定化的成本，使工厂开始投资大。 （3）比较适应水溶性底物和小分子底物。 （4）与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅 因子的反应，同时对胞内酶需经分离后，才能固定化。
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生物传感器原理图
本章重点
何谓固定化酶？ 酶的常见固定化方法有哪些？分别以什么为载体？ 如何操作？各自有何优缺点？ 相对游离酶，固定化酶有何优缺点？经过固定化以 后酶的催化特性有何改变？ 固定化酶活测定的方法？ 什么是固定化细胞和固定化原生质？ 固定化酶的应用
通常低于天然酶（有例外）。
（2）酶的稳定性 酶的热稳定性、储存稳定性、操作稳定性以及对变性剂、 抑制剂、蛋白酶的抵抗力增加。
可能的原因：
①固定化增加了酶活性构象的牢固程度，可防止酶分子伸展 变形；
②抑制酶的自身降解。
③固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭。
（3）酶的最适温度
最适温度变化不大。
有些酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升（有 例外）。
动的原因，主要是由于载体与底物间静电相互作用。
固定化载体与底物电荷相反，固定化酶的表观 Km值降低。 固定化载体与底物电荷相同，固定化酶的表观Km值显著增加。
（6）底物特异性
作用于低分子底物的酶 特异性往往会变化。
特异性没有明显变化
既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶
固定化酶的优点（与游离酶比较）：