肥胖MC4R重组腺病毒表达载体的构建及鉴定
大鼠血小板衍生生长因子C重组腺病毒载体的构建及在内皮祖细胞中的表达
大鼠血小板衍生生长因子C重组腺病毒载体的构建及在内皮祖细胞中的表达李锋;罗文军;唐博;陈以宽;孙建明;付健【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2013(42)16【摘要】目的构建含大鼠血小板衍生生长因子C(PDGF-C)基因的pAD-EGFP-PDGF-C的重组腺病毒表达载体,体外转染骨髓源性内皮祖细胞(EPCs)并观察目的基因蛋白及mRNA表达情况.方法通过逆转录聚合酶链式反应技术(RT-PCR)法从pIRES2-EGFP-PDGF-C真核表达载体中获得PDGF-C目的片段,经BP重组与LR 重组插入到pAD/CMV/V5-DEST,构建pAD-PDGF-C-IRES2-EGFP腺病毒载体.酶切及DNA测序鉴定后转染HEK293A包装、纯化,测定病毒滴度后转染大鼠骨髓源性EPCs,应用Real-time qPCR、蛋白免疫印迹法(Western blotting)等方法检测PDGF-C蛋白及mRNA的表达.结果核酸内切酶消化及PCR分析证实PDGF-C基因成功插入pAD/CMV/V5-DEST腺病毒载体,转染后荧光显微镜下观察可见绿色荧光蛋白表达,转染48 h后实时定量酵素聚合反应技术(Real-time qPCR)测定EPCs中PDGF-C含量明显提高(P＜0.05),Wester blotting检测证实在46×103存在特异性条带.结论成功构建了大鼠PDGF-C基因的腺病毒表达载体pAD-EGFP-PDGF-C,体外转染大鼠骨髓源性EPCs能高效表达目的基因产物,为后续研究PDGF-C基因功能以及进一步开展基因治疗奠定了基础.【总页数】4页(P1837-1840)【作者】李锋;罗文军;唐博;陈以宽;孙建明;付健【作者单位】重庆医科大学附属第二医院血管外科 400010;重庆医科大学附属第二医院血管外科 400010;重庆医科大学附属第二医院血管外科 400010;重庆医科大学附属第二医院血管外科 400010;重庆医科大学附属第二医院血管外科 400010;重庆医科大学附属第二医院血管外科 400010【正文语种】中文【相关文献】1.血管内皮生长因子165基因重组腺病毒载体的构建及转染内皮祖细胞的实验研究 [J], 赵洪雯;余荣杰;彭侃夫;刘宏;吴雄飞;贺伟峰;张晓蓉2.内皮抑素重组腺病毒表达载体构建及对内皮细胞增殖的影响 [J], 唐辉;徐永清;李春晓;张秀琼;郑天娥;刘旭盛;梁晚益3.eNOS基因重组腺病毒载体在大鼠骨髓来源内皮祖细胞中的表达分析 [J], 刁玉刚;金强;李林;周锦;陈克研;张铁铮4.pEGFP-Kallikrein重组真核表达载体的构建及其在兔内皮祖细胞中的表达 [J], 姜虹;李大庆;张运;刘春喜;冯进波;王荣5.内皮抑素重组腺病毒表达载体的构建及其对血管内皮细胞增殖特性的影响 [J], 唐辉;刘旭盛;梁晚益;李金玺;张小蓉;黄跃生因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
携带c-myc基因重组腺病毒的构建和鉴定及其在豚鼠耳蜗中的表达与分布
携带c-myc基因重组腺病毒的构建和鉴定及其在豚鼠耳蜗中的表达与分布韩宇;钟翠萍;陈阳;邱建华【期刊名称】《中国听力语言康复科学杂志》【年(卷),期】2011(000)002【摘要】目的构建携带c-myc基因的重组腺病毒表达载体,并观察其在豚鼠耳蜗内的表达分布,为探讨该基因的功能奠定实验基础.方法利用细菌内同源重组的方法.构建携带c-myc基因的重组腺病毒表达载体(Ad.c-myc-EGFP).并分别应用酶切、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和测序方法鉴定腺病毒的构建情况.利用豚鼠耳蜗内显微注射术、Western blot及荧光显微镜观察注射后该蛋白在耳蜗中的表达及分布特性.结果经酶切、RT-PCR和测序鉴定,质粒构建正确,重组腺病毒Ad.c-myc-EGFP构建成功.Ad.c-myc-EGFP腺病毒豚鼠耳蜗内注射后第三天便可通过荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白的广泛分布,且WesternBlot方法证实它可以上调耳蜗内c-Myc蛋白的表达.结论本实验成功构建了携带c-myc基因的重组腺病毒表达载体.它可以有效地感染豚鼠耳蜗内各种细胞.为深入研究C-MYC基因在耳蜗中的作用奠定了实验基础.【总页数】5页(P12-16)【作者】韩宇;钟翠萍;陈阳;邱建华【作者单位】第四军医大学西京医院耳鼻咽喉头颈外科,西安,710032;第四军医大学西京医院耳鼻咽喉头颈外科,西安,710032;第四军医大学西京医院耳鼻咽喉头颈外科,西安,710032;第四军医大学西京医院耳鼻咽喉头颈外科,西安,710032【正文语种】中文【相关文献】1.携带鸡贫血病毒凋亡素基因重组腺病毒质粒的构建及鉴定 [J], 邓守明;蔡召忠2.腺病毒携带的LacZ基因在豚鼠耳蜗中的表达 [J], 时利;翟所强;郭维;胡吟燕3.携带Mathl基因的重组腺病毒构建和鉴定及在豚鼠耳蜗中的表达 [J], 李泽文;刘英鹏;龚树生;王国鹏4.携带人血红素氧合酶 - 1基因重组腺病毒的构建及鉴定 [J], 姜大春;何国祥;刘建平;张倩;唐兵;李德5.携带KGF基因重组腺病毒载体的构建与鉴定 [J], 贾庆华;哈小琴;吕同德;刘春杰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
重组腺病毒载体的构建【精品推荐】
腺病毒载体的特点
n 主要以Ad5型病毒为框架构建 n 具有携带外源基因和转移外源基因的双
重功能 n 可插入长达5kb的外源基因 n 通过受体介导的细胞内吞作用进行基因
转移 n 安全性，复制缺陷（E1区缺陷）
腺病毒载体的特点
n 保留了E3区的腺病毒－－可逃逸宿主免 疫应答，可用于体内基因治疗
重组腺病毒的鉴定
n 病变293细胞于液氮、37°C反复冻融， 离心
n 取上清提取重组病毒DNA n 用目的片段引物和病毒基因组特征片段
引物作PCR
病毒滴度测定
n 24孔培养板每孔接种1×105个293细胞 n 培养24小时后，取病毒转染液0.2ml加
PBS至总量2ml，混匀后作10倍比稀释至 第8管，每孔加入不同稀释度的病毒液 0.2ml。 n 37°C 5%CO2培养1小时后，每孔补加 1.5ml培养液，继续培养36－48小时
病毒滴度测定
n 观察细胞病变情况，取100%出现CPE的 稀释度计算病毒滴度： 105细胞×稀释度×10个病毒/细胞 pfu/ml=
重组病毒的扩增
n 293细胞大规模培养：悬浮培养，单层培 养
n 用收集的病变细胞培养上清或冻融上清 感染293细胞
n 反复培养、感染 收集大量的病变细胞 及病毒上清
n 不整合到宿主基因组 n 增殖和非增殖细胞均可感染
构建腺病毒载体的要素
n 腺病毒基因组质粒 n 穿梭质粒 n 目的基因片段 n 包装细胞
AdMax™ system
穿梭质粒
pDC315
腺病毒载体的包装胞细
n HEK293细胞－－E1区缺陷互补的细胞系 悬浮HEK293细胞，易大规模培养，可用 于腺病毒大规模制备。但不易长期保持 稳定。 单层培养HEK293细胞，稳定，用于 重组腺病毒载体构建、蚀斑挑选。也可 用于腺病毒扩增。
大鼠微管相关蛋白4重组腺病毒载体的构建及在细胞中的表达鉴定
大鼠微管相关蛋白4重组腺病毒载体的构建及在细胞中的表达鉴定房亚东;徐雪;党永明;郑霁;张西联;张家平;陈渝;张琼;黄跃生【期刊名称】《第三军医大学学报》【年(卷),期】2006(28)9【摘要】目的构建大鼠微管相关蛋白4(m icrotubu le-ossoc iated prote in 4,MAP4)重组腺病毒载体,并转染新生大鼠体外培养的心肌细胞进行表达和鉴定,为真核表达及有关实验研究提供基础。
方法设计1对引物,应用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术,从大鼠心肌细胞总mRNA中扩增出MAP4 cDNA,并将MAP4 cDNA克隆到腺病毒穿梭质粒pShuttle2中,构建pShuttle2-MAP4表达质粒。
将此表达质粒扩增纯化酶切获得含有目的片段MAP4 cDNA的表达盒与Ad-eno-X V iru l DNA重组并线性化后转染HEK293T细胞,包装产生大鼠MAP4重组腺病毒。
并且转染新生大鼠原代心肌细胞,应用免疫组化的方法进行表达鉴定。
结果扩增所得的MAP4 cDNA片段经酶切鉴定、PCR扩增、DNA测序最终确定为大鼠MAP4基因,所得大鼠MAP4重组腺病毒滴度为2.3×108pfu/m l。
转染原代心肌细胞48 h后MAP4表达显著增强。
结论为研究MAP4的生物学活性及功能的基因治疗提供了基础。
【总页数】3页(P880-882)【关键词】MAP4;腺病毒;cDNA;微管相关蛋白【作者】房亚东;徐雪;党永明;郑霁;张西联;张家平;陈渝;张琼;黄跃生【作者单位】第三军医大学西南医院全军烧伤研究所创伤烧伤与复合伤国家重点实验室;成都军区总医院普通外科【正文语种】中文【中图分类】Q51;Q782【相关文献】1.大鼠弹力蛋白原基因重组腺病毒载体的构建及在血管平滑肌细胞中的表达 [J], 熊江;殷恒讳;朱易凡;叶财盛;王深明2.hTERT启动子调控的SEA-CD80基因共表达重组腺病毒载体的构建及在不同肿瘤细胞中的表达鉴定 [J], 司少艳;刘俊丽;王晓菲;谭小青;宋淑军3.核心结合因子(Cbfa1/Runx2)重组腺病毒载体的构建、鉴定及在脂肪来源干细胞中的表达 [J], 张辛;杨民;林霖;陈苹;马康涛;敖英芳;周春燕4.人LIM矿化蛋白1基因腺病毒重组表达载体构建及在犬骨髓间充质干细胞中的表达 [J], 蒲超;倪卫东;高仕长;邱宇5.人脑源性神经营养因子重组腺病毒载体的构建、鉴定及其在HEK293A细胞中的表达 [J], 丛明;李谌因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
多药耐药基因-腺病毒重组表达载体的构建及鉴定
多药耐药基因－腺病毒重组表达载体的构建及鉴定【摘要】目的构建多药耐药（multidrug resistance，MDR）基因-腺病毒重组表达载体。
方法将MDR1基因插入到腺病毒载体，用磷酸钙沉淀法将此重组载体转染到293细胞，制备重组病毒悬液并感染靶细胞进行鉴定。
结果构建的MDR1-腺病毒载体在293细胞中大量产生，病毒滴度达109 PFU/ml，此病毒感染靶细胞后，在靶细胞中有MDR1基因的表达。
结论成功构建了MDR1-腺病毒重组表达载体。
【Abstract】Objective Construction of multi-drug resistance gene (MDR) - adenoviral recombinant expression vector．Methods MDR1 gene will be inserted into the adenovirus vector，by calcium phosphate precipitation method the recombinant plasmidtransfect into 293 cells．Recombinant virus suspension is made and infeced target cells and to indentify．Results Constructed MDR1- adenovirus vector produces a large number in 293 cells，the virus titer is up to 109 PFU/ml．After the recombinant virus infectedtarget cells in the target cells have the expression of MDR1 gene．Conclusion MDR1- recombinant adenorirus vector has been successfully constructcd．【Key words】Multi-drug resistance gene (MDR1)；Adenovirus vector；Transfection多药耐药性（multidrug resistance，MDR ）是指肿瘤细胞能对多种结构、功能及杀伤机制均不同的化疗药物产生耐受。
重组腺病毒载体AdOX40Ig的构建、表达及相关体外实验
重组腺病毒载体AdOX40Ig的构建、表达及相关体外实验陈志红;赵媛媛;张守亮;林建扬;魏法星;朱伟【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》【年(卷),期】2013(023)001【摘要】Objective:To construct and identify recombinant adenovirus vector containing the human OX40-Ig1G1 fusion gene,then to infect the HL-7702 liver cells to filter out the best infective dose and detect expression of OX40Ig,which lay a foundation for the immune therapy inhibitory after organ transplantation.Methods:Specific OX40 and hIgG1 Fc primers were designed according to GenBank,and subcloned into the pAdTrack-CMV shuttle plasmid after PCR and identification.Retransformed into BJ5183 competent cells with pAdeasy-1 by calcium chloride method.The recombinant plasmid was detected by PCR and DNA sequence analysis and was transfected into 293A cells.The recombinant adenovirus infected HL-7702 liver cells and filtered out the best infective dose.OX4OIg gene expression was detected by indirect immunofluorescence assay.OX40Ig protein expression was detected by ELISA.Results:pTOX40Ig and pAdOX40Ig were constructed successfully according to restriction endonuclease analysis.293A cells were transfected,and then the purified recombinant adenovirus infected HL-7702 liver cells.10 MOI was the best infective dose.OX40Ig effective expression was detected in HL-7702 liver cells.Conclusion:The recombinantadenovirus vector AdOX40Ig carrying the human OX40-IgG1 fusion gene was successfully constructed,and OX40Ig effective expression was found in HL-7702 liver cells in vitro.%目的:构建并鉴定含人OX40-IgG1融合基因的重组腺病毒载体,并感染人肝HL-7702细胞,筛选出最佳感染剂量并检测OX40Ig的表达情况,为进一步用于器官移植后的抗排斥治疗奠定基础.方法:根据基因库公布的人OX40和hlgGl Fc片断序列设计特定引物,通过聚合酶链反应扩增并鉴定后,酶切插入穿梭质粒pAdTrack-CMV中.随后与pAdeasy-1腺病毒质粒以氯化钙法共转化BJ5183感受态细胞,重组质粒经鉴定正确后,大量扩增为腺病毒载体.再经293A细胞包装、扩增并纯化后感染HL-7702肝细胞,筛选出最佳感染剂量,并采用间接免疫荧光法检测其中外源性OX40lg基因的表达,采用ELISA法测定肝HL-7702细胞上清中OX40Ig蛋白的含量.结果:转移质粒pTOX40Ig经酶切及测序鉴定正确.重组腺病毒质粒经酶切鉴定正确,并成功转染了293A细胞.得到的病毒液经纯化扩增后进一步感染肝HL-7702细胞,经筛选,10 MOI为最佳感染剂量,并且可以检测到OX40Ig目的基因及其蛋白的表达.结论:成功构建了重组腺病毒载体AdOX40Ig,并且可在肝细胞HL-7702中表达相应的目的基因及蛋白.【总页数】5页(P12-16)【作者】陈志红;赵媛媛;张守亮;林建扬;魏法星;朱伟【作者单位】江苏大学附属人民医院普外科,江苏镇江212002;江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏镇江212013;江苏大学附属人民医院普外科,江苏镇江212002;江苏大学附属人民医院普外科,江苏镇江212002;江苏大学附属人民医院普外科,江苏镇江212002;江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏镇江212013【正文语种】中文【中图分类】R967【相关文献】1.重组Ad-Cp-CDglyTK双自杀基因腺病毒载体构建及体外抑制鼻咽癌细胞的实验研究 [J], 王国慧;何军芳;樊卫;吴沛宏2.大鼠UT-B重组腺病毒载体的构建及体外转染Caco-2细胞后基因表达 [J], 张征;刘怡晟;蒋更如;陈凉;潘曙明3.以AdMax载体系统构建和制备肾癌相关抗原G250基因重组腺病毒表达载体[J], 齐桓4.构建人基质金属蛋白酶1基因重组腺病毒载体及体外降解Ⅲ型胶原的检测 [J], 杜超;蒋明德;曾维政;郑淑梅;5.构建人基质金属蛋白酶1基因重组腺病毒载体及体外降解Ⅲ型胶原的检测 [J], 杜超;蒋明德;曾维政;郑淑梅因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
骨形成蛋白9腺病毒表达载体的构建及鉴定
骨形成蛋白9腺病毒表达载体的构建及鉴定方芳;张青蓝;杨孛;鄢国义;朱丹平【摘要】目的构建骨形态发生蛋白9 (BMP9)基因腺病毒表达载体及稳定产毒细胞系,为观察其对T2DM糖、脂代谢异常的干预效应奠定基础.方法质粒pCMV/BMP9双酶切克隆至腺病毒载体Ad5.F,构建重组腺病毒表达载体Ad5.BMP9.F,酶切测序鉴定;转包装细胞,经抗性筛选检测病毒滴度,挑选滴度较高的稳定产毒细胞克隆进行逆转录PCR(RT-PCR)鉴定.结果建立BMP9基因腺病毒表达载体Ad5.BMP9.F经酶切及测序证实目的基因插入位点及读码框架正确;建立稳定产毒细胞克隆最高病毒滴度达7.4×105 CFU/mL,RT-PCR证实BMP9基因整合其中并稳定表达.结论成功构建含BMP9基因的腺病毒表达载体及其稳定产毒细胞系.【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2015(044)017【总页数】3页(P2318-2319,2323)【关键词】骨形成蛋白质类;腺病毒科;糖尿病,2型【作者】方芳;张青蓝;杨孛;鄢国义;朱丹平【作者单位】重庆市中医院/重庆市第一人民医院内分泌科 400021;重庆市中医院/重庆市第一人民医院内分泌科 400021;重庆市中医院/重庆市第一人民医院内分泌科 400021;重庆市中医院/重庆市第一人民医院内分泌科 400021;重庆市中医院/重庆市第一人民医院内分泌科 400021【正文语种】中文【中图分类】Q781骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMP)属转化生长因子B超家族成员，在众多生命活动中均扮演重要角色。
其中BMP9与糖、脂代谢中多个关键转变环节有直接相关性。
本课题组前期发现BMP9基因表达异常可能与2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)代谢紊乱及胰岛素分泌缺陷相关，结合Chen 等[1]的研究，可推测：BMP9基因表达下降也许是导致T2DM代谢异常的重要因素之一，增加其基因拷贝，可能使糖、脂代谢紊乱得到一定程度的改善。
CTLA4Ig重组腺病毒载体的构建与体外表达
CTLA4Ig重组腺病毒载体的构建与体外表达郭小荑;邓宇斌;陆才生;李树浓【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2003(019)005【摘要】目的:构建含有CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体,为下一步在动物模型体内表达和基因治疗提供基础.方法: 自行设计一对分别含有BglⅡ及HindⅢ酶切位点的CTLA4Ig基因上下游引物,以质粒PCDNA3.0/CTLA4Ig为模板,通过PCR扩增获得CTLA4Ig基因全部序列.片段回收以后经BglⅡ及HindⅢ双酶切,定向插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV的启动子下游BglⅡ及HindⅢ位点之间,获得重组质粒pAdTrack-CTLA4Ig.通过BglⅡ/HindⅢ双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体pAdTrack-CTLA4Ig与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌.同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒用脂质体介导转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒.结果:成功构建了含有CTLA4Ig基因的重组腺病毒,病毒滴度为1.65×1012PFU/L. 结论: 该重组腺病毒的构建为下一步研究其在哺乳动物细胞内表达、研究CTLA4Ig的生物学活性及移植排斥、自身免疫病的基因治疗提供了一定的基础.【总页数】5页(P585-589)【作者】郭小荑;邓宇斌;陆才生;李树浓【作者单位】中山大学中山医学院病理生理学教研室,广东,广州,510080;中山大学中山医学院病理生理学教研室,广东,广州,510080;中山大学附属第三医院风湿科,广东,广州,510630;中山大学中山医学院病理生理学教研室,广东,广州,510080【正文语种】中文【中图分类】R392.4【相关文献】1.钙网织蛋白重组腺病毒载体构建及体外表达 [J], 赵丹;刘新莉;马萍2.猪源性CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 朱海涛;田敏;于良;吕毅;王博3.CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及其体外表达 [J], 马会慧;陆才生;陈雪娟;高志良;李刚;杨绍基;姚集鲁4.人CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 王永明;胡燕;黎海芪5.CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及其体外表达 [J], 马会慧;陆才生;陈雪娟;高志良;李刚;杨绍基;姚集鲁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
重组人RAMP-1基因腺病毒载体的构建及鉴定
重组人RAMP-1基因腺病毒载体的构建及鉴定石蓓;宋付凯;赵然尊;刘志江;龙仙萍;盛瑾【期刊名称】《遵义医学院学报》【年(卷),期】2010(33)4【摘要】目的构建携带人受体活性修饰蛋白-1(RAMP1)基因的腺病毒表达载体,为进一步深入研究RAMP1的功能奠定基础.方法通过基因工程技术将RAMP1基因克隆到穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV中;I-Ceu I+I-Sce I双酶切穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV-RAMP1,将回收的GFP-CMV-RAMP1片段,亚克隆至腺病毒骨架载体pAdxsi得到重组腺病毒质粒;重组腺病毒质粒酶切线性化后应用脂质体法转染293细胞进行包装扩增,得到重组腺病毒Ad-RAMP1并进行PCR鉴定及滴度测定.结果构建的重组穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV-RAMP1双酶切后,得到0.8kb(RAMP1)和5.1kb(pShuttle-GFP-CMV)两个片段;重组腺病毒质粒pAdxsi-GFP-CMV-RAMP1用XhoI酶切得到7个片段,而作为对照的空腺病毒质粒只得到6个片段;重组腺病毒Ad-RAMP1 PCR鉴定可见阳性扩增条带;病毒滴度检测达4.5×1011PFU/ml.结论成功构建了携带人RAMP1基因的重组腺病毒载体,为进一步研究RAMP1的功能研究奠定了基础.【总页数】3页(P330-332)【作者】石蓓;宋付凯;赵然尊;刘志江;龙仙萍;盛瑾【作者单位】遵义医学院附属医院,心内科,贵州,遵义,563000;遵义医学院附属医院,心内科,贵州,遵义,563000;遵义医学院附属医院,心内科,贵州,遵义,563000;遵义医学院附属医院,心内科,贵州,遵义,563000;遵义医学院附属医院,心内科,贵州,遵义,563000;遵义医学院附属医院,心内科,贵州,遵义,563000【正文语种】中文【中图分类】R512.36【相关文献】1.人白细胞介素32γ基因重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 李松林;朱妍妍;李霏;尹元琴2.双表达人Arid5a及报告基因eGFP的重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 王顺娟;夏海滨3.人PPARγ基因过表达重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 李腾;李琼;严国强;储佳佳;沈小丹;温见炳;黄起壬;钟荣梅4.人转录因子 PU ．1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 刘晨阳;颜文杰;王敏;孙文逵;苏欣;施毅5.人PPARγ基因过表达重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 李腾;李琼;严国强;储佳佳;沈小丹;温见炳;黄起壬;钟荣梅;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
重组MIF腺病毒载体的构建、包装与纯化及其意义
重组MIF腺病毒载体的构建、包装与纯化及其意义蓝海兵;罗亮;齐协飞;龚园其;陈玉【摘要】Objective To construct a recombinant adenovirus vector containing (Macrophage migration inhibitory factor,MIF) and identify the function of the Ad-MIF. Methods Amplify MIF gene plasmid with molecular biological technique. Identify the success of MIF gene plasmid amplification with gel electrophoresis,sequencing and Western Blot technique. Amplify MIF gene with PCR technology,then recombinate gene to adenovirus vector and prepared for adenovirus packaging. Amplify virus in HEK293 cells,After 3 cycles of amplification,the titer of adenovirus containing MIF reached an appropriate level. and The protein expressed in the infected human airway smooth muscle cells significantly increased. Results It is correct when identify the MIF gene plasmid using gel electrophoresis,sequencing and Western Blot technique.The the virus titre was 2E+9PFU/ml. Conclusions The successful construction of the recombinant adenovirus containing MIF,which provides an experimental basis for the basic re-search of MIF gene therapy on asthma.%目的：采用分子生物学技术构建人巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）基因腺病毒表达载体，检测AD-MIF腺病毒转染人气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cell，ASMC）后蛋白表达。
大鼠TCF4和ΔTCF4重组腺病毒载体的构建和鉴定
［ Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ］ ０ｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ： Ｔ ０ ｃ ｏ ｎ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｒ ｅ ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ａ ｎ ｔ ａ ｄ ｅ ｎ ｏ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ｅ ｎ ｃ ｏ ｄ ｉ ｎ ｇ ｆ ｕ ｌ ｌ — ｌ ｅ ｎ ｇ ｔ ｈ Ｔ ｃ ｅ ｌ ｌ ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ ４ （ Ｔ Ｃ Ｆ ４ ）
Ｊ ｕ １ ．２ ０１ ３
大鼠Ｔ Ｃ Ｆ ４和 Ａ Ｔ Ｃ Ｆ ４重 组 腺 病 毒 载 体 的构 建 和 鉴 定
胡君 ，叶荣 ， 王春 燕 ， 崔恒进 ， 徐 晓静 ， 张焕相
（ 苏州大学基础 医学与生物科学学院细胞生物学 系 ， 江苏 苏州 ２ １ ５ １ ２ ３ ）
［ 摘要 ］ 目的 ： 构建腺病毒表达 载体 Ａ ｄ — Ｔ Ｃ Ｆ ４和 Ａ ｄ — Ａ Ｔ Ｃ Ｆ ４ （ 缺 失了 Ｂ — ｃ ａ ｔ ｅ ｎ ｉ ｎ结合位点 ） ， 并初 步鉴定其在 问充质干 细胞 （ ｍｅ ｓ ｅ ｎ ｃ ｈ ｙ ｍ ａ ｌ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ， ＭＳ Ｃ ｓ ） 中 的表 达 ， 为进 一 步 研究 Ｗｎ ｔ ／ ［ ３ 一 ｃ ａ ｔ ｅ ｎ ｉ ｎ信号 通 路在 ＭＳ Ｃ ｓ中 的功 能 以及应 用 ＭＳ Ｃ ｓ 进行 干细胞移植 和基因治疗奠定基础 。方法 ：以 ＭＳ Ｃ ｓ 的ｃ Ｄ Ｎ Ａ为模板 ， 扩增 Ｔ Ｃ Ｆ ４和 Ａ Ｔ Ｃ Ｆ ４基因 ， 将基 因序列 定向克隆至穿梭质粒载体 ｐ Ｓ ｈ ｕ ｔ ｔ ｌ ｅ — Ｃ ＭＶ后 ， 转化 含 ｐ Ａ ｄ Ｅ ａ ｓ ｙ 一 １的 Ｂ Ｊ ５ １ ８ ３感 受态 细胞进行 同源重 组 ， 获 得重组腺 病毒 载体 Ａ ｄ — Ｔ Ｃ Ｆ ４和 Ａ ｄ — Ａ Ｔ Ｃ Ｆ ４ 。Ｐ Ｃ Ｒ以及 Ｐ ａ ｃ Ｉ 酶切鉴定后 ， Ａ ｄ — Ｔ Ｃ Ｆ ４和 Ａ ｄ — Ａ Ｔ Ｃ Ｆ ４转染 Ｑ Ｂ Ｉ 一 ２ ９ ３ Ａ进行包装和扩增 。检 测重组 载体的病毒滴度 以及感染 ＭＳ Ｃ ｓ的最适 病毒复数 （ ｍ ｕ ｌ ｔ ｉ ｐ ｌ ｉ ｃ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ ｉ ｎ ｆ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ， ＭＯ Ｉ ） ， 并探 讨 Ａ ｄ — Ｔ Ｃ Ｆ ４和 Ａ ｄ — Ａ Ｔ Ｃ Ｆ ４ 在 Ｍ Ｓ Ｃ ｓ中的表达 以及对迁移 的影 响。结果 ： 成 功构建 Ａ ｄ — Ｔ Ｃ Ｆ ４和 Ａ ｄ — Ａ Ｔ Ｃ Ｆ ４， 病 毒滴度分 别为 １ ． １ ×１ ０ ｐ ｆ ｕ ／ ｍ Ｌ和 １ ． ３×１ ０ ｐ ｆ ｕ ／ ｍ Ｌ， １ ５ ０ ＭＯ Ｉ 病毒感染 Ｍ Ｓ Ｃ ｓ 的效率达到 ９ ０ ％ 以上 ； 蛋 白质印迹 和 Ｔ Ｏ Ｐ Ｆ ｌ ａ ｓ ｈ ／ Ｆ Ｏ Ｐ Ｆ ｌ ａ ｓ ｈ报告基 因检测 显 示Ｔ Ｃ Ｆ ４在 ＭＳ Ｃ ｓ中表达增加 ， 并具有调节下游靶基 因转 录的活性 ； Ｂ ｏ ｙ ｄ ｅ ｎ小室迁移 实验 发现感染 Ａ ｄ — Ａ Ｔ Ｃ Ｆ ４能显 著 抑制 Ｍ Ｓ Ｃ ｓ向 Ｌ ｉ Ｃ １ 的迁 移能 力 ， 而感 染 Ａ ｄ — Ｔ Ｃ Ｆ ４并 不能 提高 ＭＳ Ｃ ｓ的迁移 能力 。结 论 ：成功 构建 Ａ ｄ — Ｔ Ｃ Ｆ ４和 Ａ ｄ — Ａ Ｔ Ｃ Ｆ ４， 能高效感染 ＭＳ Ｃ ｓ 并正确表达 。
腺病毒载体构建PPT课件
2021/7/23
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腺病毒
•腺病毒 Adenovirus 最初由人类腺样增殖体组织培养中分 离得到的，此病毒名称也由此而来。质粒是直径约70毫微米 的正二十面体，各顶点具有突起。结构亚基总数为252个。 核酸是双链DNA，分子量20—25×106。无包膜。在被感染的细 胞核中增殖，病毒蛋白在细胞质内合成，再输送到细胞核。
包装容量 改建腺病毒基因部分缺失载体的克隆容量可达10kb， 大 腺病毒基因完全缺失载体克隆容量可达37kb。
安全性好 无需整合进宿主细胞基因组中，目的基因在宿主细胞
基因组外游离状态下表达，整合突变致癌可能性小。
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几种病毒载体的区别
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10
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11
包装和其他蛋白表达翻译所必须的，但其对细胞毒性也是很强的。
E2蛋白涉及AdDNA复制
E3蛋白对抗宿主的抗病毒防御系统
E4蛋白调节有效的晚期基因转录
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4
腺病毒分类
第一代腺病毒载体：一般将E1或E3基因缺失的腺病毒载体成为一代
载体。此类型载体在未纯化时可引发机体产生较 强的炎症反应和免疫反应，纯化后可安全使用， 体内表达周期可达4周。（科研、临床应用最广泛 ，一般常用Ad5型腺病毒）
第二代腺病毒载体：一般将E2A或E4基因缺失的腺病毒载体成为二代
载体。产生的免疫反应较弱，其安全性和载体容 量有所改进，但病毒包装难度和出毒滴度下降厉 害，应用局限。
第三代腺病毒载体：缺失了全部的（无病毒载体等）或大部分腺病毒
基因，仅保留ITR和包装信号序列。这一载体系 统需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒。
•腺病毒可见于人、鸡、牛、狗、鼠、猪和猴中，并各自具 有严格的寄主特异性，不感染他种动物。对人类可引起感冒 症状、呼吸系统不适等。
重组腺病毒载体pAd-CD的构建和鉴定的开题报告
重组腺病毒载体pAd-CD的构建和鉴定的开题报告一、研究背景和意义腺病毒是一种广泛存在于哺乳动物中的DNA病毒，能够感染多种类型的细胞，具有高效的基因转导能力和良好的安全性。
因此，腺病毒已经成为了重要的基因转导载体，被广泛应用于基因治疗、基因工程和生物学研究等领域。
其中，重组腺病毒作为基因转导载体具有如下的优点：（1）能够稳定地表达外源基因：腺病毒具有较高的基因转导率，可以长时间稳定地表达外源基因，从而实现目标蛋白的大量表达。
（2）病毒颗粒结构复杂：腺病毒颗粒结构复杂，能够有效地包装外源基因，从而保证表达的效率和精度。
（3）有良好的生物安全性：腺病毒基因组不会整合到宿主细胞基因组中，从而减少对宿主基因组的影响，有良好的生物安全性。
本研究主要针对重组腺病毒载体pAd-CD的构建和鉴定展开，主要研究内容包括以下几个方面：1. 进一步优化pAd-CD载体的构建，提高其基因转导效率。
2. 针对pAd-CD载体的具体应用领域，开展针对性的效果评价和分析。
3. 探索pAd-CD载体在基因治疗、基因工程和生物学研究等方面的应用潜力。
本研究的开展能够拓展腺病毒在基因转导载体方面的应用范围，对基因治疗、生物学研究等领域具有一定的应用前景。
二、主要研究内容和研究方案1. 重组腺病毒载体pAd-CD的构建（1）提取并纯化腺病毒：采用经典的离心法等分离技术，从已知类型的腺病毒细胞株中提取并纯化腺病毒。
（2）选择并设计适合的pAd-CD载体：根据研究方向选择并设计适合的重组腺病毒载体。
（3）克隆外源基因：将目标基因与pAd-CD载体进行克隆，形成包含外源基因的载体。
（4）包装重组腺病毒：使用适当的技术和装置，将载体转化为重组腺病毒并包装成病毒颗粒。
2. 重组腺病毒载体pAd-CD的鉴定（1）DNA测序鉴定：使用合适的方法对构建出的pAd-CD载体进行测序鉴定。
（2）病毒包装率检测：测定包装率，评估重组腺病毒的制备质量。
（2）病毒的基因转导效率检测：采用不同的检测方法检测病毒的基因转导效率，分析重组腺病毒的基因转导效率及其影响因素。
重组载体的构建方法及其构建的重组载体及应用[发明专利]
![重组载体的构建方法及其构建的重组载体及应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/f17475cb2f60ddccdb38a008.png)
专利名称：重组载体的构建方法及其构建的重组载体及应用专利类型：发明专利
发明人：李闰婷,陈龙欣,张丽萌,聂晓宁,马润林,王峰
申请号：CN202010288990.9
申请日：20200414
公开号：CN111454980A
公开日：
20200728
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及分子生物学和蛋白质技术领域，具体涉及重组载体的构建方法及其构建的重组载体及应用。
本发明提供的构建方法操作简便，本发明提供的重组载体能够表达包括IgG抗体、Fab 抗体、Fv抗体、人源化ScFv‑Fc抗体以及鼠/人嵌合抗体等各类不同功能的抗体，提高了抗体表达效率。
申请人：郑州师范学院
地址：450044 河南省郑州市惠济区大学城北区英才街6号
国籍：CN
代理机构：北京市恒有知识产权代理事务所(普通合伙)
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人血管内皮细胞生长因子重组腺病毒载体的构建、鉴定及在骨髓间充质干细胞的表达
人血管内皮细胞生长因子重组腺病毒载体的构建、鉴定及在骨髓间充质干细胞的表达郜勇;杨述华;杨操;王瑞英;叶树楠【期刊名称】《中华实验外科杂志》【年(卷),期】2006(023)002【摘要】目的构建人血管内皮细胞生长因子(VEGF)165腺病毒表达载体,体外转染大鼠骨髓间充质干细胞研究其相关特性.方法利用细菌内同源重组技术快速构建Ad-VEGF165腺病毒重组质粒,经酶切及测序鉴定正确后转染人胚肾细胞HEK293包装成为重组Ad-VEGF165腺病毒,并进行电镜观察及滴度测定.感染大鼠骨髓间充质干细胞观察VEGF165基因的转录和表达.结果酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒含有hVEGF165 cDNA,电镜显示包装细胞中有大量病毒颗粒存在,测定包装的病毒滴度为6.3×1010 TCID 50/ml.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组织化学及免疫印迹检测骨髓间充质干细胞内有VEGF165的转录和表达.结论构建的VEGF腺病毒表达载体可有效感染骨髓间充质干细胞,并在体外高效表达,为将表达VEGF基因的骨髓间充质干细胞用于基因治疗提供了实验依据.【总页数】3页(P138-140)【作者】郜勇;杨述华;杨操;王瑞英;叶树楠【作者单位】430022,武汉,华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科;430022,武汉,华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科;430022,武汉,华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科;430022,武汉,华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科;430022,武汉,华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科【正文语种】中文【中图分类】R68【相关文献】1.重组人血管内皮生长因子165腺病毒载体的构建与鉴定 [J], 何春耒;高辉;刘午阳;姬广林;王茂源;肖文德;吴东保;何澄;叶勇军;莫建文2.人LIM矿化蛋白1基因腺病毒重组表达载体构建及在犬骨髓间充质干细胞中的表达 [J], 蒲超;倪卫东;高仕长;邱宇3.血管内皮生长因子121和骨形态蛋白2双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 钟声;刘丹平;刘素伟;李晓禹;李谌;李媛4.构建含人胰岛素样生长因子基因腺病毒载体及在兔骨髓间充质干细胞的表达 [J], 丁幸坡;金先庆;罗小辑;邱林;刘伟5.构建含人血管内皮细胞生长因子121腺病毒表达载体的体外表达实验 [J], 王建忠;李兵仓;陈菁;陈志强因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及其体外表达
CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及其体外表达马会慧;陆才生;陈雪娟;高志良;李刚;杨绍基;姚集鲁【期刊名称】《中山大学学报（医学科学版）》【年(卷),期】2005(026)0z1【摘要】[目的]构建表达人CTLA4Ig的非复制型重组腺病毒载体并检测其在真核细胞中的表达.[方法]分离人外周血单个核细胞,提取细胞总RNA,经RT-PCR分别扩增含抑瘤素M信号肽的CTLA4胞外段及IgG恒定区(含绞链区-CH2-CH3)基因片段.将PCR产物克隆入pCDNA3,阳性重组子以双酶切和测序鉴定.将目的基因CTLA4-Ig亚克隆入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染BJ5183,经细菌内同源重组构建重组腺病毒载体.采用脂质体法转染293细胞包装产生重组腺病毒,进一步感染HepG2细胞,采用RT-PCR及ELISA测定CTLA4Ig表达情况.[结果]构建了表达人CTLA4Ig基因的重组腺病毒,病毒滴度可达6×109 pfu/mL,并能在HepG2和骨髓间充质干细胞中表达CTLA4Ig.[结论]成功构建表达CTLA4Ig的重组腺病毒载体,为进一步研究肝细胞移植排异及自身免疫性疾病的免疫调节治疗提供有力的手段与工具.【总页数】3页(P157-159)【作者】马会慧;陆才生;陈雪娟;高志良;李刚;杨绍基;姚集鲁【作者单位】中山大学附属第三医院传染科,广东,广州,510630;中山大学附属第三医院风湿科,广东,广州,510630;中山大学附属第三医院传染科,广东,广州,510630;中山大学附属第三医院传染科,广东,广州,510630;中山大学附属第三医院传染科,广东,广州,510630;中山大学附属第三医院传染科,广东,广州,510630;中山大学附属第三医院传染科,广东,广州,510630【正文语种】中文【中图分类】R742.4【相关文献】1.CTLA4Ig重组腺病毒载体的构建与体外表达 [J], 郭小荑;邓宇斌;陆才生;李树浓2.猪源性CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 朱海涛;田敏;于良;吕毅;王博3.人CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 王永明;胡燕;黎海芪4.CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及其体外表达 [J], 马会慧;陆才生;陈雪娟;高志良;李刚;杨绍基;姚集鲁5.hNET基因重组腺病毒载体构建和体外表达 [J], 贾志云;欧晓红;魏海燕;邓候富;黄蕤;王金蓉;张仕琼因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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人CTLA-4Ig腺病毒载体的构建鉴定与表达冯宁翰;张炜;吴军;眭元庚;钱立新;华立新;贺伟峰;宋宁宏;吴宏飞【期刊名称】《河北医学》【年(卷),期】2005(011)006【摘要】目的:运用PAdEasy系统构建了带荧光蛋白的人CTLA-4Ig腺病毒载体,为进一步研究CTLA-4Ig诱导免疫耐受的机制奠定了基础.方法:采用基因技术,将目的基因克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,利用PAdEasy系统进行重组,然后在293细胞中进行扩增.并进行病毒滴度测定.体外感染人肾小管上皮细胞.结果:酶切鉴定和PCR证明重组人CTLA-4Ig腺病毒载体构建正确.结论:应用PAdEasy细菌内重组技术成功构建了人CTLA-4Ig带荧光腺病毒载体.【总页数】3页(P481-483)【作者】冯宁翰;张炜;吴军;眭元庚;钱立新;华立新;贺伟峰;宋宁宏;吴宏飞【作者单位】南京医科大学第一附属医院泌尿外科,江苏,南京,210029;南京医科大学第一附属医院泌尿外科,江苏,南京,210029;第三军医大学西南医院全军烧伤研究所,重庆,400038;南京医科大学第一附属医院泌尿外科,江苏,南京,210029;南京医科大学第一附属医院泌尿外科,江苏,南京,210029;南京医科大学第一附属医院泌尿外科,江苏,南京,210029;第三军医大学西南医院全军烧伤研究所,重庆,400038;南京医科大学第一附属医院泌尿外科,江苏,南京,210029;南京医科大学第一附属医院泌尿外科,江苏,南京,210029【正文语种】中文【中图分类】R392.4【相关文献】1.人PPARγ基因过表达重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 李腾;李琼;严国强;储佳佳;沈小丹;温见炳;黄起壬;钟荣梅2.人3突变型低氧诱导因子1 α真核表达载体和腺病毒表达载体的构建及鉴定 [J], 赖艳娴;刘城;王月刚;谢宜军;童锴;胡英芳;韦莉莉;吴平生3.人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因共表达腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 郭伟韬;刘思景;王辉;肖启贤;陈子秋;黄云;王斌4.人PPARγ基因过表达重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 李腾;李琼;严国强;储佳佳;沈小丹;温见炳;黄起壬;钟荣梅;5.人CTLA-4Ig融合基因减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体的构建及表达 [J], 周春丽;郝进;唐书谦;钟白玉;吴军;贺伟峰;郝飞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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葡萄糖摄取与转运增加 。通过增加脂肪代谢相关基 因的表达 ， 响糖 代谢 ， 影 减少 Ｉ Ｒ引起 的高血糖 ； 通 过抑 制肝 脏 中长链 脂 肪 酸 氧化 ， 抑制 １６二磷 酸 ，～ 果 糖激 酶 ， 少 肝 脏 中 葡 萄 糖 生 成 ， 进 葡 萄 糖 利 减 促 用 ， 而 降 低 血 糖 ， 善 糖 毒 性 。 临 床 试 验 证 从 改 实 Ｊ盐 酸 毗格 列 酮不 论 单 独使 用 或 与 磺 脲 类 、 ， 双 胍类抗糖尿病药物联合使用 ， 均可使血糖 和 Ｈ Ａ Ｃ ｂ 明显降低 。
Ｈｎ Ｄ Ａ Ｍａｋｒ１５２ １０ｂ ） 小量 质粒提 取 ｉ ｍ Ｎ ｒｅ（２ －３３ ｐ ； ｄ
穿梭 载体 ｐｈｔｅＣ Ｓｕｆ —ＭＶ． ４ ｌ ＭＣ Ｒ载 体 ， 全 部 酶 切 产 取 物 ｌ 琼脂糖 凝胶 电泳 ， Ａ ｙｅ ％ 用 ｘｇｎ胶 回收 试 剂盒 回 收纯 化 酶 切 产 物 。将 该 线 性 化 的 ｐｈ ｔｅＣ ／ Ｓｕｆ—ＭＶ 犬 ｌ ＭＣ Ｒ载体 转 化进含 ｐ ｄａｙ１的 Ｅ ｅｌＢ５ ８ ４ Ａ ｅｓ一 ．ｏ Ｊ１３感 ｉ
［ ］Ｒ ｄｆ ｅ Ａ Ｒ ｖ ｉ ｏ ，ｄ ｄ ａ ，ｔ １ Ｓ — ｏｔ ｅ ｅｔ ｅｅ ５ ｏｒ ｕｚ ， ｅｉｅ Ｐ ａ ￣ ｅ ａ ｉ ｍ ｎ ｆ ｉ ｎ ｓ ｇ ｒｇ Ｊ Ｐ ． ｘ ｈ ｃ ｖ ｓ
ａ ｄ ｔｌ ｒ ｂ ｌ ｙ ｏ ｉｇ ｉ ｚ ｎ ｎ ｃ ｍｂ ｎ ｔｏ ｉｈ ｓ ｌ ｎ ｌ ｒ ａ ｒ ｎ ｏ ｅ ａ ｉ ｔ ｆ ｐ ｏ ｌ ａ ｏ ｅ ｉ ｏ ｉ ａｉ ｎ ｗ ｔ ｕ ｆ ｙｕ ｃ ｓ ｏ ｉ ｔ ｏ
吡格 列酮 保 护 胰 岛 Ｂ细 胞 的机 制 复 杂 。 本 研
［ ］陈灏 珠． ３ 实用内科 学 ［ ．２版． Ｍ］１ 北京 ： 民卫 生 出版 社 。０５ 人 ２０ ：
ｌ４ ． Ｏ ６
［ ４］王长 江， 叶山东 ， 王德全 ， 盐酸吡格列酮治疗 ２型糖尿病的疗 等．
效及安全性 ［］中 国Ｉ Ｊ． 晦床药理学杂志 ， ０ ，８３ ：６— ０ ２ ２ １（ ） １７１ ． ０ ７
近 年来 ， 因 治疗 成 为许 多遗 传 疾 病 治 疗 的趋 基 势… ， 亦为肥胖 的治疗 提供 了一种有效手段。黑素 皮质素 受体 ４（ ４ ） 表 达 于下 丘 脑 神 经元 细胞 ＭＣ Ｒ 是
基金项 目： 辽宁省科技 厅基 金资助项 目（ ｏ ９ｏ ０ １４ 。 ２ ｏ ４ ８ｏ —） ＋ 讯 作 者 通
１ 材 料与 方 法
４ ５
山东医药 ２ １ 年第 ５ 卷第 １ 期 ０１ ｌ ５
１ １ 材 料 载 体 和 菌 种 ： ｃ Ｎ ３ １ｍｙ—ｉ Ａ ． ｐ Ｄ Ａ ． － ｃｈｓ — ／ 受态 Ｂ ５ ８ 。限 制 性 内切 酶 Ｐ ｅＩ酶 切 线 性 处 理 Ｊ１３ ｍ
ｃ Ｃ Ｒ载体 （ Ｍ４ 本实验室构建） 骨架载体 ｐ ｄ ａｙ 、 ； Ａ Ｅ ｓ一 １ 穿 梭 载 体 ｐｈｔｅＣ Ｓｕｔ —ＭＶ、Ｂ５８ 感 受 态 细 胞 。 ｌ Ｊ１３ ｐ １－ 体 、 Ｈ５ｔ 受 态 细 胞 、 Ｘ Ｔ ｑ Ｎ 聚 ＭＤ ８Ｔ载 Ｄ ｏ感 Ｅ ａＤ Ａ 合酶、 Ｎ Ｐ Ｔ ｄ Ｔ 、 ４噬 菌体 Ｄ Ａ连 接 酶、 Ｎ ａ ｅ Ｎ Ｄ ＡＭ ｒ ｒ ｋ （０ － ００ｂ 、０ — ０ ｐ 、 制 性 内切 酶 Ｂ １０６ ０ ｐ ５０１ ００ｂ ） 限 ２ Ｉ、ｈ 限制 性 内切 酶 Ｐ ｃ Ｉ Ｘ ｏ Ｉ； ａ Ｉ、ｍｅ Ｐ Ｉ； Ｄ Ａ ＸＮ ／
Ｃ Ｖ 犬 ＭＣ Ｒ后 ， Ｍ／ ４ 转化到含 ｐ ｄ ａｙ１的 Ｂ５ ８ 受态细胞 ， Ａ ｅｓ一 Ｊ １３感 采用 细菌 内同源重 组法构建腺病 毒载体 ｐ ｄ ａｙ１ Ａ ｅｓ．／
ｐｈ ｔｅＣ ／ ＡＲ； 选 阳性 克 隆 子 ； ａ 切 鉴 定 。结 果 ｓｕｔ — ＭＶ ＭＣ ｌ 筛 ＰｃＩ酶 线 性 化 的 ｐ ｈ ｔｅＣ ／ ＡＲ转 化 含 ｐ ｄ ａｙ１的 Ｓ ｕｌ—ＭＶ ＭＣ ｔ Ａ ｅｓ－
ｔ ｚ ｎ ｎ ｉ ｓ ｌ ｅ ｓｔ ｉ ｎ ｎ ｕ ｉ ｅ ｒ ｔ ｎ ｉ ｙ ｅ ２ ｄ ａ ｅ ｅ ａ ｏ ｅ ｏ ｎ ｕ ｉ ｓ ｎ ｉ ｖ ｔ ａ ｄ ｉ ｓ ｌｎ ｓ ｃ ｅ ｏ ｎ ｔｐ ｉｂ ｔ ｓ ｎ ｉ ｙ ｉ
成、 转运及 利 用 的 多 种 基 因 的转 录 Ｊ在 不 刺 激 ｐ ，
受态细胞中， 转化成功 的阳性克隆菌可以在含卡那 霉 素 抗性 的平板 上 生 长 ， 取 单 菌 落 ， 大 培 养 后 ， 挑 扩 提取 重组 体 进行 鉴 定 ， Ｐ ｃ 经 ａ Ｉ酶切 ，． ％琼 脂 糖 ０７ 凝胶上 电泳 ， 出现一大于 ２ ｂ和 ４ ５ｋ 若 ０ｋ ． ｂ或 ３ ０ ． ｋ ｂ的特 征性 条带 ， 为阳性 重组 体 。 即
用， 其机制可能为降低血糖 、 ｂ 和 ＦＮ 水平 ， Ｈ ＡＣ ＩＳ 改
善糖 毒性 和 Ｉ Ｒ。
参 考文 献 ：
［ ］Ｍ ｙｚ ｉ Ｍ ｔ ｄ Ｄ ｈ ｎｏＲ ． ｏ － ｓｏ ｓ ｅ ｅｔ ｆ ｉｉ １ ｉ ａ ａｕａ ａ ｋ Ｙ， ｓ Ｍ， ｅ￣ ｚ Ａ Ｄ ｓ ｒ ｐ ｎ ｃ ｇ— ｅｅ ｅ ｆ ｏ ｐ ｌ
Ｐｉ ｒ ． ｒ ０和 Ｏｉｏ ． ｍｅ ５ ｌ ０设计 扩增 犬 ＭＣ Ｒ编码 区 的 ｇ６ ４
２ １ Ｐ Ｒ扩 增 产 物 ． Ｃ
犬 ＭＣ Ｒ Ｐ Ｒ 产 物 为 １０ ３ ４ Ｃ ２
引 物 ， 游 引 物 Ｐ ： Ｇ Ａ Ｇ Ｔ Ｔ Ｃ Ａ Ｃ Ｔ 上 ｌ ５一 Ｇ Ａ Ａ Ｃ Ｇ Ｃ Ｃ Ａ － Ｇ Ａ Ｔ Ｃ Ｃ ＣＩＩ Ｇ 一 （ Ａ Ｃ Ｃ Ａ Ｃ ，ＩＡ Ｃ３ 引入 Ｂ Ⅱ酶 切位 点 ） Ｔ Ｃ ； 下 游引 物 Ｐ ： Ｃ Ｇ Ｔ Ｇ Ｇ Ｔ Ｇ Ａ Ｃ Ｇ Ｔ Ｇ — ２５一Ｃ Ｃ Ｃ Ａ Ｃ Ａ Ｔ Ｔ Ｔ Ｃ Ａ Ａ
２ 结果
试剂盒和胶回收试剂盒 。其余试剂均由辽宁医学院 科 学实验 中心 提供 。 １２ 犬 ＭＣ Ｒ重组 腺病 毒 载体 的构建 及 鉴 定 ① ． ４ 引物设计 ： 根据 Ｇ ｎ ａｋ上 公 布 的犬 ＭＣ Ｒ基 因序 ｅＢｎ ４
列 （ 录 号 ： Ｑ ８２０） 利 用 生 物 软 件 Ｐｅ ｉｒ 登 Ｄ ０４１ ， ｒｍｅ
ｍ ｆ ｒ ｉ ｆ ｅ ｔａ ｅｔ ｐ ｉ ｅ ｅｉ ｓ Ｊ ． ｅ ｅｏ ｎ ｏ ｔ ｅｔ ｎ ｏ ｔ ｅ２ ｄ ｂ ｔ ｍ ｌｔ ［ ］ Ｍ ｄ ｍ ｒ ｈ ｒ ｍ ｙ ｆ ａ ｅ ｓ ｌｕ
Ｃｉ，０ ８ １ １ １ ）７ １７０ ｌ ２０ ，３ （ ９ ：２ －３ ． ｎ （ 收稿 日期 ：０ １ ２１ ） 的重组腺病 毒载体 ； 载体为 人类 肥胖症的基 因治疗研 究奠定 了基础 。 ４ 该 关键词 ： 肥胖 ； 素皮质素受体４； 黑 同源重组 ； 病毒载体 腺
中图分类号 ：７４ Ｑ ８ 文 献 标 志 码 ： Ｂ 文 章 编 号 ：０ ２２ ６ ２ １ ） ５０４ －３ １０ －６ Ｘ（ ０ Ｉ １ － ５０ ０
摘要 ： 目的
构建黑素皮质素受 体４（ Ｃ Ｒ 重组腺病毒表达载体 ， ＭＡ ） 为肥胖症 的基 因治疗 研究奠 定基 础。方 法
Ｐ Ｒ扩增犬 ＭＧ Ｒ目的基 因后与 Ｔ载体 连接 ， Ｃ ４ 双酶 切鉴 定正 确 的 ＴＡ载体 获得具 有 黏性末 端 的 ＭＣ Ｒ 目的基 － ４ 因； 将其亚克 隆至腺 病 毒 穿 梭 载体 ｐ ｈ ｔｅＣ Ｖ 中 ， 建 穿梭 载 体 ｐ ｈ ｔｅＣ ／ ＡＲ； ｍ Ｉ单 酶 切 ｐｈ ｔｅ Ｓｕｔ — Ｍ ｌ 构 Ｓ ｕｔ ．ＭＶ ＭＣ ｌ Ｐｅ ｓｕｌ． ｔ
膜 上 的一 种特 定受 体 ， 在动 物体 质 量 、 能量 稳态 和 采 食 量 的调控 中具 有重 要 作 用 ］ ０ ９年 ５月 ， 。２０ 我们 应用 Ｅ １区 和 Ｅ ３区 缺失 的 复 制 缺 陷 ５型 腺 病 毒 系 统构 建 犬 ＭＣ Ｒ重 组 腺 病 毒 载 体 ， ４ 旨在 为 人 类 肥 胖 症 的基 因治疗 研 究奠 定基 础 。
肥 胖 ＭＣ Ｒ重 组腺 病 毒 表 达 ４ 载 体 的构 建 及 鉴 定
王玉 彬 吕金钢 苏 荣健 。 王光 川 巴彩凤 ， 。 ， 。
（ １辽 宁 医学院 附属 第一 医院 ， 宁锦 州 １１０ ； 宁 医学 院 实验 动物 中心 ； 辽 ２０ １２辽
３辽宁 医学院省高校分子细胞生物 学与新药开发重点实验室）
山东医药 ２ １ 年第 ５ 卷第 ｌ 期 ０１ １ ５
吡格 列 酮 是 噻 唑 烷 二酮 类 药 物 ， 通 过增 加 胰 其 岛素 敏感 组织 骨骼 肌 、 脂肪 组织 、 脏等 部位 的胰 岛 肝 素敏 感性 而 降 低 血 糖 Ｊ改 善 胰 岛素 抵 抗 （Ｒ） 通 、 Ｉ ； 过激 活靶 组 织 中过 氧 化 物 酶 体 增 殖 物 激 活 型 受 体
Ｂｎ ａｋ公布 的 同源性达 ９ ％ ， 有 第 １０位碱 基 ｃ ＋ ９ 仅 ２ ＿ Ｔ 第 ７ ７位 碱 基 Ｔ Ｃ， 表 达 犬 ＭＣ Ｒ蛋 白无 影 、 ７ — 对 ４
响， 目的基 因成 功插入 ｐ １ － 体 上 。 ＭＤ ８Ｔ载
连 ＴＫ Ｒ ａ ａ ａ公 司 合 成 。② ｐ ８Ｔｃ ４ ＭＤ １一—ＭＣ Ｒ载 体 构
Ｂ５８ Ｊ １３感受态细胞 ，６ｈ 获得 阳性克隆子 ， Ｐ ｃＩ １ 后 经 ａ 酶切鉴定 出一 大于 ２ ｋ ０． ｂ的大片段 和 ３ ０ｋ ． ｂ的特征性 片段 ， 通过 Ｂ ｌ、 ｈ 双酶切切 下约 １ ０ ｐ的片段 ， ＭＣ Ｒ 目的基 因的重组腺病毒载体构建成 功。结论 ＩＸｏＩ ０ｂ ０ 含 ４ 细 菌内
ＣＡＴＡ一（ Ａ Ｇ Ｃ Ｃ ３ 引入 Ｘ ｏ ｈ Ｉ酶 切位 点 ） 引物 由大 。
ｂ ｐ的均一条带 ， 与预期扩增产物大小基本一致 ， 且 无 非 特异 性扩 增条带 。 ２２ ｐ １一—ＭＣ ． ＭＤ ８Ｔｃ ＡＲ重 组体 的酶切 鉴定 及 测序 重组体 ｐ Ｄ ８Ｔｃ Ｃ Ｒ经 Ｂ ｌ、 ｈ 双酶切 ， Ｍ １．． ４ Ｍ ＩＸ ｏ Ｉ 分别 得到 １ ０ ｐ和 ２６２ｂ 条 带 ， 小 与预 期 ０ｂ ０ ９ ｐ两 大 相符 ， 图 １ 见 。测 序 结 果 经 Ｂａｔ ｌ 比对 分 析 ， Ｇ ｎ ｓ 与 ｅ—