生物学仪器设备技术试题及答案

中山大学2010年“生物学仪器设备技术”课程期末考试试题及答案1、简述实验室安全注意事项(10分)⑴实验室防火安全⑵实验室化学药品安全⑶实验室生物安全病源微生物实验室生物安全管理实验动物生物安全管理⑷实验室防辐射安全⑸大型仪器设备安全⑹实验技术安全⑺实验室网络安全⑻实验室安全事故应急处理注意事项2、简述离心机的基本分类及超速离心机操作注意事项类型：实验室用与工业用，间歇式与连续式，冷冻式与不冷冻式，地面式与桌式，普通离心机和高速离心机与超速离心机，制备式与分析式。

注意事项：⑴转子型号与设置参数必须一致，所用转速绝对不能超过转子的限定，最高转速通常写在转子上面，若离心机太老旧，必须往下调降；⑵移动转子一定要双手，转子放入离心机舱内时要注意位置平衡；⑶离心管一般只装七成满，并一定要平衡好（落单的离心管要用另一只装有清水的离心管平衡），高速离心实验所用离心管最好选用进口品牌，不得使用伪劣的国产离心管，不得使用老化、变形、有裂纹的离心管；⑷大部分离心管都附有盖子，离心管的盖子也需要一起平衡；⑸一般实验时离心管通常都会放在碎冰上，因此，取出平衡时，要把管壁上碎冰液体擦拭干净。

⑹开闭离心机舱门前需要认证检查转子的盖子是否旋紧；预冷时转头盖可摆放在离心机的平台上，或摆放在实验台上，如果没有拧紧而是浮放在转头上，一旦误启动，转头盖就会飞出，造成事故！；⑺开始加速的时候最危险，若发现声音不对，或产生大震动，请立刻按 Stop；⑼一定要在达到预设转速后，才能离开离心机，若有任何异状，必须立刻停机；⑽离心过程中，必须取出转子清理干净，打开离心机舱门，等结冰融化后，用干净毛巾擦拭及清理舱内水分及样品残留，台面清理要仔细清理干净才离开。

3.简述实时荧光定量PCR仪的主要用途及注意事项（5分）分子生物学研究⑴核酸定量分析。

对传染性疾病进行定量定性分析，病原微生物或病毒含量的检测 , 比如近期流行的甲型H1N1流感，转基因动植物基因拷贝数的检测，RNAi 基因失活率的检测等。

⑵基因表达差异分析。

比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异( 如药物处理、物理处理、化学处理等 ) ，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证⑶SNP 检测。

检测单核苷酸多态性对于研究个体对不同疾病的易感性或者个体对特定药物的不同反应有着重要的意义，因分子信标结构的巧妙性，一旦SNP 的序列信息是已知的，采用这种技术进行高通量的 SNP 检测将会变得简单而准确。

⑷甲基化检测。

甲基化同人类的许多疾病有关，特别是癌症， Laird 报道了一种称作 Methylight的技术，在扩增之前先处理 DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影响，用特异性的引物和 Taqman探针来区分甲基化和非甲基化的 DNA ，这种方法不仅方便而且灵敏度更高。

医学研究⑴产前诊断：人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗，到目前为止，还只能只能通过产前监测，减少病婴出生，以防止各类遗传性疾病的发生，如为减少X连锁遗传病患儿的出生，从孕妇的外周血中分离胎儿DNA，用实时荧光定量PCR检测其Y性别决定区基因是一种无创伤性的方法，易为孕妇所接受。

病原体检测：采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。

与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。

⑵药物疗效考核：对乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析显示：病毒量与某些药物的疗效关系。

HCV高水平表达，干扰素治疗作用不敏感，而HCV低滴度，干扰素作用敏感；在拉米夫定治疗过程中，HBV- DNA的血清含量曾有下降，随后若再度上升或超出以前水平，则提示病毒发生变异。

⑶肿瘤基因检测：尽管肿瘤发病的机理尚未清楚，但相关基因发生突变是致癌性转变的根本原因已被广泛接受。

癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期就可以出现。

实时荧光定量 PCR不但能有效地检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量。

目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病WT1基因、肿瘤 ER基因、前列腺癌PSM 基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。

注意事项：⑴引物设计：引物设计是PCR中最重要的一步。

①序列选取应在基因的保守区段；②扩增片段长度根据技术的不同有所分别：sybr green I技术对片段长度没有特殊要求；Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp。

③避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对；④避免引物自身形成环状发卡结构；⑤典型的引物18到24个核苷长。

Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%；⑥引物之间的TM相差避免超过2℃；⑦引物的3’端避免使用碱基A；⑧引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基。

⑨为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。

⑩为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。

4、什么叫激光扫描共聚显微镜，有哪些功能？在使用中应注意什么？（15分）激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。

由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。

系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。

调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。

激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量, 配合焦点稳定系统可以实现长时间活细胞动态观察。

主要用途：①细胞及生物荧光样品观察分析。

②绿荧光蛋白分析。

③荧光原位杂交分析。

④光切片扫描。

⑤3D图像处理。

⑥时间序列拍摄成像.激光扫描共聚焦显微镜（Laser scanning confocal microscope, LSCM)是近代最先进的细胞生物医学分析仪器之一。

它是在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激光荧光探针，利用计算机进行图像处理，不仅可观察固定的细胞、组织切片，还可对活细胞的结构、分子、离子进行实时动态地观察和检测。

目前，激光扫描共聚焦显微技术已用于细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究，并提供定量荧光测定、定量图像分析等实用研究手段，结合其他相关生物技术，在形态学、生理学、免疫学、遗传学等分子细胞生物学领域得到广泛应用。

5、请在以下利用流式细胞仪进行的实验中任选三种说明其基本原理：⑴ PI染色法检测细胞周期；⑵ Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡；⑶ CFSE染色法检测细胞增殖；⑷ JC-1染色法检测细胞凋亡；⑸ Indo-1或Fluo-3染色法检测钙离子浓度；⑹ PI单染法检测细胞凋亡。

（15）⑴ PI染色法检测细胞周期；PI ,即碘化丙锭,可以与细胞内DNA和RNA结合,采用RNA抑制剂将RNA消化后,通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。

由于细胞周期各时相的DNA含量不同,通常正常细胞的G1 /G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N) ,而G2 /M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N) ,而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。

因此,通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为G1 /G0期,S期和G2 /M期,并可通过特殊软件计算各时相的百分率。

（5）Fluo-3-AM 染色 (测细胞内游离钙离子浓度)原理：AM酯的羧酸经修改不带电荷，易浸入细胞。

一旦进入细胞，亲脂性集团被非特异酯酶切断，使其带电荷，从而溢出细胞大大减慢。

一般，酯化集团水解对于结合靶离子是必须的。

AM酯水解显颜色或荧光的特点可用于检查其自发水解。

（6）PI单染法检测细胞凋亡：其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。

这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：⑴细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。

研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。

许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。

⑵光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。

在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。

在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。

此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。

细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。

但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。

因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。

根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。

也可用于活细胞的分类。

6、高效液相的检测器有哪些？并说出其主要的检测对象。

（10分）检测器的分类⑴紫外检测器（UV）主要用于检测芳烃，含共轭双键和生色团的有紫外吸收的组分，不适用于烃类分析。

⑵光电二极管阵列检测器（DAD 或 PDA）⑶荧光检测器（FD）只用于能产生荧光的物质的检测⑷示差折光检测器（IRD）只要样品组分与流动相的折光指数不同，就可被检测, 对所有溶质都有响应⑸蒸发光散射检测器（ELSD）可检测挥发性低于流动相的任何样品（如糖、抗生素、皂苷、类脂、脂肪酸等）。

流动相低温雾化和蒸发，对热不稳定和挥发性化合物亦有较高灵敏度。

7、色谱分离的类型有哪几个？并请简述其分离原理。

（10分）⑴吸附色谱（液-固吸附色谱）以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm 的硅胶吸附剂。

流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂⑵分配色谱（液-液分配色谱）早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相,现多为化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在担体表面。