第15章 柠檬酸循环

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六. 柠檬酸循环的生理意义
柠檬酸循环是绝大多数生物体主要的分解代谢途 径，也是准备提供大量能量的重要代谢系统，在 循环过程中产生的还原型NADH和FADH2，进一 步通过电子传递和氧化磷酸化被氧化，所释放出 的自由能形成ATP分子。 TCA循环既在分解代谢中提供大量能量，其中间 产物又是合成代谢的前体来源，具有分解代谢和 合成代谢的双重性 柠檬酸循环将糖代谢、脂代谢和蛋白质代谢有机 地联系起来，是整个新陈代谢的中心环节
苹果酸脱氢酶 1、辅酶为NAD+ 2、第四次氧化还原反应 3、所有已知的脱氢酶都有立 体结构专一性，NAD+的腺 嘌呤核苷部分结合在疏水裂 缝中，烟酰胺与酶结合使其 活性部位暴露在极性环境中， 酶呈伸展的构象。
四 TCA循环总结
乙酰CoA+3NAD+ +FAD+GDP+Pi +H2O→ 2CO2 + 3NADH+3H+ +FADH2 + CoASH +GTP
激活
磷酸酶 NAD+
激酶
失活
线粒体膜
丙酮酸
每个分子具有4 个碳的草酰乙 酸库（基质中）
每个分子具有3个碳 的丙酮酸库（基质 中） 第一个碳以 CO2形式失去
六碳三羧酸
第二个碳以 CO2形式失去 第三个 碳以CO2 形式失 去
重新加入到 草酰乙酸库
五碳二羧酸 四碳二羧酸
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维生素B1和硫胺 素焦磷酸(TPP) TPP功能—— 脱羧酶辅酶
+
脱羧酶 丙酮酸脱氢酶系 α-酮戊二酸脱氢酶系
维生素PP和烟酰胺辅酶
1、结构 烟酸及烟酰胺皆为吡 啶衍生物。烟酸为吡 啶-3-羧酸，烟酰胺为 烟酸的酰胺，它们结 构式为 烟酰胺与核糖、磷酸 、腺嘌呤组成脱氢酶 的 辅 酶 NAD+ 和 NADP+
（4）α－酮戊二酸氧化脱羧形成琥珀酰CoA
α－酮戊二酸脱氢酶系
第二次氧化还原反应，第二次脱羧 反应不可逆 反应释放的能量主要存于琥珀酰CoA的高能硫酯键中； 第三个调控酶
α-酮戊二酸脱氢酶系
1、三种酶构成 α－酮戊二酸脱氢酶（E1) 二氢硫辛酰转琥珀酰酶（E2) 二氢硫辛酰脱氢酶（E3) 2、六种辅助因子： TPP、硫辛酸、CoA、FAD、NAD+、Mg2+
异柠檬酸脱氢酶
1、目前发现有两种： 以NAD+为辅酶，存在于线粒体中，Mg2+， Mn2+ 以NADP+为辅酶，存在于线粒体和细胞 溶胶中， 2、别构调节酶（能荷调节）： 它的活性受ADP别构激活。 NADH、ATP抑制作用
3、细菌中的异柠檬酸脱氢酶受磷酸化的 共价修饰调节： 异柠檬酸脱氢酶激酶：酶活性部位的Ser 被磷酸化，抑制酶与底物的结合； 异柠檬酸脱氢酶磷酸酶：使酶脱去磷酸 而激活 两种酶位于同一条多肽链上
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2、功能
CoA 是酰基载体，是体内酰化酶的辅酶，在糖、脂和蛋白质 代谢过程中的酰基转移作用；ACP与脂肪酸的合成关系密切
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硫辛酸
结构：以闭环二硫化合物形式和开环还原形式两种结 构混合物存在。 通过赖氨酸残基的ε-氨基共价结合到酶上
1 、三羧酸循环是乙酰 CoA 和草酰乙酸缩合生 成含三个羧基的柠檬酸，反复的进行脱氢脱 羧，又生成草酰乙酸，再重复循环反应的过 程。整个循环反应为不可逆反应 2、TAC过程的反应部位是线粒体。
3、三羧酸循环的中间产物 三羧酸循环中间产物起催化剂的作用， 本身无量的变化，不可能通过三羧酸循环直 接从乙酰CoA合成草酰乙酸或三羧酸循环中 其他产物。
第一阶段：糖酵解途径 第二阶段：丙酮酸的氧化脱羧 第三阶段：三羧酸循环 第四阶段：氧化磷酸化
G（Gn） 胞液 丙酮酸 乙酰CoA 线粒体 TCA循环 CO2
H2O，CO2的来源？
H2O [O] ATP ADP NADH+H+ FADH2
一 丙酮酸的氧化脱羧
（一）反应过程
IRREVERBiblioteka BaiduIBLE
丙酮酸脱氢酶复合体的组成
HSCoA
NAD+
酶 E1：丙酮酸脱氢酶 E2：二氢硫辛酰转乙酰酶 E3：二氢硫辛酸脱氢酶
辅酶 TPP 硫辛酰胺（ L S HSCoA FAD, NAD+ S )
六种辅助因子：TPP，CoA-SH，硫辛酰胺，NAD+，FAD，Mg2+
1. 丙酮酸与TPP结合并 脱羧形成羟乙基TPP。 2. 羟乙基TPP氧化转变成 乙酰基同时转移到E2的 H 辅基硫辛酰胺上。
3、变构调节酶：受到产物（琥珀酰CoA和 NADH）的抑制和高能荷抑制 4、与丙酮酸脱氢酶复合体不同之处： 复合体中的E1不受磷酸化和去磷酸化的共 价修饰的调节
催化反应机理与丙酮酸脱氢酶系相一致
（5）琥珀酰CoA转化成琥珀酸并产生一 分子高能磷酸键
—催化此反应的酶为琥珀酰CoA合成酶 —高能硫脂键的断裂与GDP磷酸化偶联 —该反应为TCA是唯一直接产生高能磷酸键的步骤， 也是一步底物水平磷酸化产生能量的步骤； —反应生产的GTP在蛋白质的生物合成中起磷酰基 供体及激活信号蛋白的作用，也可以与ADP磷酸 化生成ATP相偶联产生能量。
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功能 是一种酰基载体，存在于丙酮酸脱氢酶系和α酮戊二 酸脱氢酶系，行使偶联酰基转移和电子转移的功能。
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（三）砷化物对硫辛酰胺的毒害作用
砷化物与丙酮酸脱氢酶系中的E2辅基硫辛酰胺的 巯基发生共价结合，使还原型硫辛酰胺形成失去 催化能力。
第十五章 柠檬酸循环
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TCA背景知识
为什么称为柠檬酸循环、三羧酸循环 （Tricarboxylic acid cycle, TCA） 、Krebs循环？ 在有氧的情况下，糖酵解产生的丙酮酸氧化 脱羧形成乙酰CoA。乙酰CoA经一系列氧化、 脱羧，最终生成C2O和H2O并产生能量的过 程，称为柠檬酸循环，亦称为三羧酸循环,简 称TCA循环。由于它是由H.A.Krebs（德国） 正式提出的，所以又称Krebs循环。
P 辅酶I
NADP+ 辅酶II
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反应中心
电子受体 接受氢负离子
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电子供体 给出氢负离子
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NAD和NADP参加两个电子的转移反应
维生素B2和黄素辅酶
1、结构 由异咯嗪与核糖醇所组成， 分子结构如下： 体内的核黄素是以黄素单核 苷酸 FMN 和黄素腺嘌呤二核 苷酸FAD的形式存在
1、催化可逆反应 2、含有Fe-S聚簇： 4Fe-4无机硫化物-4Cys-S 铁-硫蛋白：与Fe-S聚簇结 合的蛋白质
（3）异柠檬酸氧化形成α－酮戊二酸
异柠檬酸脱氢酶
—催化此反应的酶为异柠檬酸脱氢酶； —TCA循环中第一个氧化还原反应 —反应为TCA二次氧化脱羧中的第一个反应； —调控酶；
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FMN和FAD是生物体内一些氧化还原酶的辅基， 发挥传递氢的作用，能以3种不同的氧化还原状态存在
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维生素B3（泛酸）和辅酶A
1、结构
是β- 丙氨酸与α、γ- 二羟 -ββ- 二甲基 丁酸结合而成的有机酸。分子结构 有一肽键 辅酶 A 是泛酸的主要活性形式常简 写成CoA 泛酸的另一种活性形式是酰基载体 蛋白（ACP）
2、磷酸化和去磷酸化的调控： 在处于丙酮酸脱H酶复合体核心位置的E2分 子上结合着两种特殊的酶 激酶： 可使E1组分磷酸化，使丙酮酸脱H 酶复合体失去活性 磷酸酶：可使E1组分去磷酸化，使丙酮酸 脱H酶复合体活化， Ca2+：通过激活磷酸酶的也使丙酮酸脱H酶 系活化。
共价调节
HSCoA
3、包含有两个亚基，含有三个不同的 铁硫聚簇组分：2Fe-2S、3Fe-4S、4Fe-4S
（7）延胡索酸水合成L-苹果酸
—催化此反应的酶为延胡索酸酶；
—该酶具有严格的立体专一性，即只生成L-苹 果酸；
（8）L-苹果酸脱氢生成草酰乙酸
—催化此反应的酶为苹果酸脱氢酶； —该酶的辅基为NAD+； —由于草酰乙酸与乙酰CoA合成柠檬酸的反应是高度放能反应， 因此通过草酰乙酸的不断消耗来驱使该反应不断向生成草酰 乙酸方向进行。
五 柠檬酸循环的调控 1、柠檬酸本身制约系统的调节 起关键作用的三种酶 柠檬酸合酶 异柠檬酸脱氢酶 α-酮戊二酸脱H酶系 酶活性受到底物的推动和产物（NADH） 的抑制
2、ATP、ADP+对TCA循环的调节 ADP是异柠檬酸脱氢酶的别构激活剂 ATP对该酶产生别构抑制 3、Ca2+对TCA循环的调节 Ca2+在机体内的生物功能是多方面的，除 了许多其他生物功能外，它还在几个位 点上调节三羧酸循环。
由氟乙酸形成的氟乙酰CoA可被该酶催 化形成氟柠檬酸，从而抑制下一步的顺乌 头酸酶催化的反应。此称为致死性合成反 应。 用于制造杀虫剂
o 哺乳动物体内柠檬酸合成酶以二聚体形式存在。 o 与草酰乙酸的结合使酶发生有利于和乙酰CoA 结合的形变。
（2）柠檬酸异构化形成异柠檬酸
－H2O
＋H2O
乌头酸酶
（6）琥珀酸脱氢生成延胡索酸
—催化此反应的酶为琥珀脱氢酶；它以FAD为辅基； —该酶具有严格的立体专一性，即只生成反式延胡索酸； —与琥珀酸结构类似的化合物如丙二酸、戌二酸等是该酶的竞 争性抑制剂。 —第三次氧化还原反应
琥珀酸脱氢酶
1、酶和辅基的关系：共价键相连 2、唯一嵌入到线粒体内膜的酶，TCA循环中的其 它酶存在于线粒体的基质中
它激活丙酮酸脱氢酶磷酸酶，从而激活丙酮酸脱氢酶复合 物，产生乙酰CoA。 Ca2+还激活异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊 二酸脱氢酶。 因此，Ca2+ 不仅是刺激肌肉收缩的信号，而且也促进ATP 的生成，以提供能量。
丙酮酸脱氢酶复合体： 抑制：ATP，乙酰 CoA，NADH，脂肪酸 激活：AMP，CoA，NAD+，Ca2+ 柠檬酸合酶： 抑制：ATP 琥珀酰CoA NADH 柠檬酸 激活：ADP 异柠檬酸脱氢酶： 抑制：ATP，NADH 激活：ADP Ca2+ α-酮戊二酸脱氢酶复合体： 抑制： 琥珀酰CoA NADH，ATP 激活： ADP Ca2+
+
3. 在E2上的乙酰基在E2 催化下转移到CoASH 上形成游离的乙酰CoA. 从而形成了一个高能硫 酯键。
5. E3上的还原型的 FADH将 H交给 NAD+形成 NADH， E3辅基 又形成氧化型的 FAD
4. 还原型的E2将二个SH基H 转移到E3的辅酶FAD上形 成还原型FADH
（二）丙酮酸脱氢酶复合体催化反应的简单图解
这类砷化物同样表现在对酮戌二酸脱氢酶系的 抑制上。
R-As=O + HS HS R
S R’-As S R + H 2O
（四）丙酮酸脱氢酶复合体的调控
1、 产物的调控： NADH和乙酰CoA和酶的作用底物NAD 和CoA-SH竞争酶的活性部位 ，它们是竞 争性抑制 乙酰CoA抑制E2(二氢硫辛酸转乙酰基酶) NADH抑制E3（二氢硫辛酸脱氢酶） 抑制效应可被相应的反应物CoA和NAD+ 所逆转。
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二 三羧酸循环概述
* 反应部位
所有的反应均在真 核生物线粒体基质 中进行。
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三 柠檬酸循环的反应机制
（1）草酰乙酸与乙酰CoA缩合形成柠檬酸
CH3COSCoA
CoA
柠檬酸合酶
柠檬酸合酶
催化此反应的酶为柠檬酸合酶； —反应的中间产物为柠檬酰辅酶A； —柠檬酸合酶属于调控酶，其活性受ATP、 NADH、琥珀酰CoA、酯酰CoA等的抑制；另 一种抑制剂是丙酮酰CoA。 —不可逆的反应，是TCA循环的限速酶
4、在循环中虽然没有氧分子直接参加反应，但是TCA循 环只能在有氧条件下进行，反应产生的NADH和FADH2 只能通过电子传递链和氧分子才能够被氧化 5、有一次底物水平磷酸化 琥珀酰CoA →琥珀酸 6、有二次脱羧反应： 异柠檬酸→ α-酮戊二酸 α-酮戊二酸→ 琥珀酰CoA
7、有四次脱H反应 异柠檬酸→ α-酮戊二酸 α-酮戊二酸→ 琥珀酰CoA 琥珀酸→ 延胡索酸 苹果酸→ 草酰乙酸 NADH NADH FAD NADH