浅析基于微流控技术的外泌体分离方法
外泌体的提取方法及其在药物递送系统中的应用
外泌体的提取方法及其在药物递送系统中的应用王飘飘;王会会;王雷;姚亮;彭代银;陈卫东【摘要】外泌体是一种活细胞产生的直径为40～150 nm微小囊泡,通过携带的蛋白质、脂类、RNA等参与细胞间的信息交流和物质交换.因不同生理状态下产生的外泌体作用不同,现其被广泛应用于临床肿瘤的诊断和治疗.另外,外泌体作为内源性的天然纳米材料,在药物的递送中也有着独特的优势.外泌体能更好地应用于各领域的前提是产量和纯度有所保证.因此,该文就外泌体的提取方法及其在药物递送系统中的应用做一介绍.【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2019(035)003【总页数】6页(P309-314)【关键词】外泌体;提取分离;药物递送系统;靶向给药;肿瘤;抗肿瘤药物【作者】王飘飘;王会会;王雷;姚亮;彭代银;陈卫东【作者单位】安徽中医药大学药学院,安徽合肥 230011;安徽中医药大学药学院,安徽合肥 230011;安徽中医药大学药学院,安徽合肥 230011;安徽中医药大学药学院,安徽合肥 230011;安徽中医药大学药学院,安徽合肥 230011;安徽省中药研究与开发重点实验室,安徽合肥 230031;安徽中医药大学药学院,安徽合肥 230011【正文语种】中文【中图分类】R-05;R329.24;R341;R34-33;R730.5;R943;R979.1外泌体(exosomes，Exos)是细胞分泌的一种膜囊泡，因其可以将供体细胞的信息通过其携带的蛋白质、mRNA、miRNA等传递到受体细胞，实现细胞之间的信息交流及物质交换，并且可以作为药物载体转运药物而引起科学家的广泛关注[1](Fig 1)。
外泌体作为内源性的天然药物载体有着独特的优势，表面由脂质和蛋白质组成，使其可以穿透许多生物膜，提高药物的运输效率和靶向性，可以稳定存在于血液中，纳米级尺寸明显增强药物在肿瘤部位的渗透滞留效应(permeability and retention effect, EPR)[2]。
外泌体的研究进展
外泌体的研究进展一、本文概述随着生物医学研究的深入，细胞间的信息交流机制逐渐成为研究的热点。
作为细胞间交流的重要载体，外泌体（Exosomes）的研究在近年来取得了显著的进展。
本文旨在综述外泌体的基本特征、生物学功能及其在疾病诊断和治疗中的应用，同时探讨当前面临的挑战和未来的发展趋势。
我们将简要介绍外泌体的定义、结构特点以及产生机制，帮助读者理解其作为细胞间信息传递的重要角色。
接着，我们将重点讨论外泌体在肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病等医学领域的研究进展，包括外泌体在疾病发生发展中的作用机制，以及作为疾病标志物的潜力。
我们还将关注外泌体在疾病诊断和治疗中的应用前景，如作为药物递送载体、肿瘤疫苗以及生物标志物等方面的研究。
我们将对当前外泌体研究面临的挑战和未来的发展方向进行深入探讨，以期为推动外泌体在生物医学领域的应用提供有益的参考。
二、外泌体的结构与功能外泌体是一种由细胞主动分泌的，直径约为30-150纳米的膜性囊泡，普遍存在于各种体液中，包括血液、尿液、乳汁、脑脊液和细胞培养基等。
这些囊泡在细胞间的物质传递、信息交流以及免疫反应等方面发挥着重要作用。
近年来，随着外泌体研究的深入，其独特的结构和功能逐渐被人们所揭示。
结构上，外泌体由磷脂双分子层膜包裹着内部的水溶液组成，其膜上嵌有多种蛋白质，包括四跨膜蛋白、热休克蛋白、整合素等。
这些蛋白质不仅参与外泌体的形成和分泌过程，还负责将外泌体与靶细胞进行特异性结合，实现精准的物质传递。
外泌体的膜上还含有丰富的糖类和脂质，这些成分对于外泌体的稳定性和功能也至关重要。
功能上，外泌体具有多种生物学活性。
外泌体可以传递信息分子，如mRNA、miRNA、蛋白质等，这些分子在细胞间的信息交流过程中发挥着关键作用。
外泌体可以参与免疫反应，通过传递抗原或免疫调节分子，影响免疫细胞的活性和功能。
外泌体还具有促进血管生成、抑制肿瘤生长等多种生物学活性。
值得一提的是，外泌体的功能与其来源细胞密切相关。
一种用于外泌体分离富集和检测的微流控芯片
一种用于外泌体分离富集和检测的微流控芯片
肿瘤来源的外泌体（exosomes）在肿瘤微环境的胞间通讯中发挥着特殊作用，它们在体液中含量稳定且能够灵敏地反映出肿瘤的实际状态，被认为是“液体活检”技术中一种极具潜力的肿瘤标志物。
外泌体研究中面临的首要困难是如何从复杂的生物样品中分离出这些微小囊泡，超速离心法是外泌体浓缩的经典方法，但步骤冗杂、仪器昂贵，且回收率较低。
对外泌体进行定量的标准方法，例如ELISA和western blot，在需要较大样品量的同时，其灵敏度较低。
此外，分步对外泌体进行处理和分析的过程不仅耗时耗力，样品也极易受到外界的污染。
近日，华东理工大学的叶邦策教授团队报道了一种集分离、富集和检测为一体的肝癌相关外泌体分析平台（ExoPCD-chip）。
该微流控芯片由一个Y型微柱阵列组成的捕获区域和级联的ITO电极组成。
预先修饰有Tim4蛋白的磁珠可以特异结合外泌体表面暴露出的磷酯酰丝氨酸，而芯片中的PDMS微柱则进一步增强磁珠对外泌体的捕获效率。
富集到的外泌体随后被磁力固定在ITO电极的表面，通过一条包含CD63识别序列和模拟DNA酶序列的核酸适配体来实现电化学信号转换的过程，在快速、高特异性外泌体识别的基础上实现了高灵敏的电化学传感分析。
图1.（A）ExoPCD-chip示意图；（B）ITO表面电传感示意图。
基于MEMS技术的外泌体磁分离微流控芯片
第58卷第6期 2021年6月微M 电子技术Micronanoelectronic TechnologyVol. 58 No. 6June 2021DOI ： 10. 13250/j. cnki. wndz. 2021. 06. 006基于MEMS 技术的外泌体磁分离微流控芯片吁子贤，林树靖，王菲，张笛，陈迪(上海交通大学电子信息与电气工程学院，上海 200240)摘要：胃癌细胞源外泌体作为生物标志物在胃癌早期检测中有着极大的应用潜力。
但外泌体分离 难度大，这一问题极大地限制了外泌体的临床应用。
为应对这一挑战，设计并制备了一款外泌体 磁分离微流控芯片。
通过有限元仿真设计合理高效的微流控芯片结构，仿真结果证明设计的微过 滤器能改善微流控芯片内流体分布，从而有利于外泌体分离。
通过微电子机械系统（MEMS) 工艺制备微流控芯片，利用扫描电子显微镜（S E M )表征芯片关键尺寸，证明制备的微流控芯 片尺寸精度可达1.5 M m 。
通过免疫磁珠（I M N P )捕获外泌体，捕获效率可达60.2%，在微流 控芯片中完成外泌体的磁分离，实验结果证明微流控芯片外泌体分离纯度为76. 8%。
关键词：微电子机械系统（M E M S );微流控芯片；微过滤器；免疫磁珠（I M N P );外泌体分离 中图分类号：035; TH703文献标识码：A 文章编号：1671-4776 (2021) ()6-〇496-()5Abstract ： Exosomes derived from gastric cancer cells have great application potential as biomarkers for early detection of gastric cancer. However, it is difficult to separate exosomes ， and this limitation blocks the clinical application of exosomes. To meet this challenge, a microfluidic chip for magnetic separation of exosomes was designed and fabricated. A reasonable and efficient microfluidic chip structure was designed through finite element simulation. The simulation results prove that the designed microfilter can improve the fluid distribution in the microfluidic chip, which is good for separating exosomes. The microfluidic chip was fabricated by micro-electromechanical system (MEMS) process, and the key dimensions of the microfluidic chip were characterized by the scanning electron microscopy (SEM). The results show that the size accuracy of the microfluidic chip can reach 1. 5 jim. The exosomes can be captured by immu- nomagnetic nano particles (IMNPs) , and the capture efficiency can reach 60. 2%. The magnetic separation of exosomes was completed in the microfluidic chip. The experimental results prove that the purity of the exosomes separated by microfluidic chips is 76. 8%.收稿日期：2020-12-18基金项目：国家然科学基金青年科学基金资助项目（82003274)通信作者：陈迪，E-mail: **************.cnExosomes M agnetic Separation M icrofluidic ChipBased on MEMS TechnologyYu Zixian, Lin Shujing, Wang Fei, Zhang Di, Chen Di(School o f E lectronic In fo rm a tio n arid E lectrica l E n g in e e r in g ，S h a n g h a i J ia o T o n g U niversity j S h a n g h a i 200240, C h ina )4%吁子贤等：基于MEMS技术的外泌体磁分离微流控芯片Keywords：micro-electromechanical system (M EM S)；microfluidic chip；microfilter；nomagnetic nano particle (IM NP)；exosome separationPACC：0340G；07IOC〇引言早期诊断和及时治疗对于治疗胃癌具有重要意 义。
血清外泌体提取方法
血清外泌体提取方法血清外泌体（extracellular vesicles, EVs）是细胞释放的一类小型膜囊泡，内含丰富的蛋白质、核酸和代谢产物，具有重要的生物学功能和临床应用价值。
为了从血清中提取血清外泌体，以下是十种常用的方法，并对每种方法进行详细描述：1. 超速离心法：将血清进行低速离心，去除细胞碎片和大的膜囊泡，然后再将上清液进行高速离心，获得血清外泌体。
2. 密度梯度离心法：将血清样品与密度梯度溶液混合，进行离心，血清外泌体会分布在不同密度的梯度区域，然后可以分层收集血清外泌体。
3. 尺寸排除色谱法：使用尺寸排除色谱柱来分离血清外泌体，根据外泌体的大小，使得外泌体能够通过或滞留在柱上，然后收集滞留在柱上的外泌体。
4. 抗体磁珠法：使用特定外泌体表面标记的抗体磁珠，在血清中捕获外泌体，并通过磁力分离的方法将外泌体与其他成分分离。
5. 商业试剂盒法：市面上有很多专门用于提取血清外泌体的商业试剂盒，这些试剂盒通常包含了提取和富集外泌体的试剂和相关操作步骤。
6. 过滤法：使用不同孔径的滤膜，将血清进行过滤，外泌体会在滤膜上滞留，然后收集滞留的外泌体。
7. 微流控芯片法：使用微流控芯片，通过微流体的操控来分离和富集外泌体。
8. 电泳法：将血清样品进行电泳，根据外泌体的电荷和尺寸差异，使其在电泳过程中迁移，并在特定位置收集外泌体。
9. 裂解法：以裂解细胞膜的方法来释放细胞内外泌体，然后通过离心等方法来获得纯净的血清外泌体。
10. 光学方法：利用光学原理和技术，如光操控、光拉曼等，来分离和富集外泌体。
这些方法各有优劣，选择哪种方法取决于实验室的具体需求和仪器设备的可用性。
提取血清外泌体的方法也是一个不断发展和改进的领域，未来可能会出现更多的提取方法和技术。
外泌体分离鉴定实验技术介绍及选用策略
如果使用国产的生工出品PEG6000，生 工官网报价 500g 不足百元。
外泌体的不同分离方法对比
免疫沉淀
抗体或适配体
囊泡表面CD63、PS、 其他特殊蛋白等
外泌体下游研究技术 高通量分析——RNA高通量分析、蛋白质谱分析 过表达或敲低外泌体中的RNA或蛋白 靶细胞对外泌体的摄取 抑制外泌体的释放或摄取
外泌体研究——论文的套路
外泌体的不同分离方法对比
超速离心 起始量要大！一般 40~100mL培液起
水平转最好！ 不要倒！ 不要倒！ 不要倒！
外泌体miRNA测序案例
Li L, Li C, Wang S, et al. Exosomes Derived from Hypoxic Oral Squamous Cell Carcinoma Cells Deliver miR-21 to Normoxic Cells to Elicit a Prometastatic Phenotype. Cancer Res. 2016;76(7):1770-80
电镜检测外泌体形态
制样： • 40ml 培液超速离心分离得到的外泌体，重悬于20-30ul PBS中。 • 吸取样品10ul 滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液。 • 吸取2%的醋酸双氧铀10ul滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液。 • 常温干燥十五分钟。上机。 80kv-120kv 成像
Tip：如果使用聚合物沉淀分离的样品打电镜。在电镜 实验前可以使用100KD的超滤管反复洗涤样品数次。去 除杂蛋白后再进行电镜检测，会得到意想不到的效果哦。
外泌体提取方法
外泌体提取方法外泌体是一种细胞外囊泡，其在细胞间传递信号、调节免疫应答、参与细胞间通讯等方面发挥着重要作用。
因此，外泌体的提取方法对于研究细胞间通讯、疾病诊断和治疗等具有重要意义。
本文将介绍几种常用的外泌体提取方法，希望能够对相关研究工作提供一定的参考价值。
1. 超速离心法。
超速离心法是目前常用的外泌体提取方法之一。
首先，将细胞培养上清液收集起来，并经过一系列离心步骤，逐渐提取出外泌体。
这种方法操作简单，提取效率较高，适用于大量样本的处理。
但是，超速离心法需要专业的离心设备，并且在操作过程中需要严格控制离心参数，以确保外泌体的完整性和纯度。
2. 超滤法。
超滤法是利用超滤膜的选择性透过性，将外泌体从细胞培养上清液中分离出来的方法。
这种方法操作简便，无需离心设备，适用于小样本的处理。
但是，超滤法对超滤膜的选择和使用要求较高，需要根据外泌体的大小和特性选择合适的超滤膜，以确保提取的外泌体具有较高的纯度和完整性。
3. 免疫磁珠法。
免疫磁珠法是利用特定抗体与外泌体表面标记物的结合，通过磁珠的作用将外泌体从细胞培养上清液中提取出来的方法。
这种方法操作简便，提取效率高，适用于特定标记物的外泌体的提取。
但是，免疫磁珠法需要具有高特异性和亲和性的抗体，且对于不同类型的外泌体需要选择不同的抗体，因此在实际操作中需要进行充分的前期筛选和验证工作。
4. 超声法。
超声法是利用超声波对细胞培养上清液进行处理，破碎细胞膜，将外泌体释放出来的方法。
这种方法操作简便，无需昂贵的设备，适用于小样本的处理。
但是，超声法对超声处理的参数和时间需要进行严格控制，以避免外泌体的损伤和降解。
综上所述，外泌体提取方法各有特点，选择合适的方法需要根据具体实验要求和条件来确定。
在实际操作中，需要根据样本的特性和实验的目的，选择合适的外泌体提取方法，并进行充分的验证和优化工作，以确保提取的外泌体具有较高的纯度和完整性。
希望本文介绍的外泌体提取方法能够对相关研究工作提供一定的帮助和参考价值。
外泌体的分离鉴定
外泌体的分离鉴定［摘要］外泌体，细胞间物质信息的传递者，在细胞生物学以及分子生物学领域中，扮演着越来越重要的角色。
然而目前对于外泌体的分离鉴定还存在一定的困难，因此本文对外泌体的分离鉴定方法进行综述，为外泌体的进一步研究提供更有效的方法。
近年来，越来越多的证据表明外泌体对于细胞生物学以及医学研究方面具有重要的价值，而由于外泌体的体积结构方面的因素，其分离纯化还存在很大的困难，目前比较常用的分离方法有差速离心法、密度梯度离心法、超滤离心法、免疫磁珠法、多聚物沉降法等。
1. 差速离心法陈绍倩［1］等人以白血病细胞系K562细胞为材料，采用多步离心的方法成功地提取到了的外泌体。
此种实验方法操作不是很复杂，实验设备要求相对简单，拥有超速离心机和细胞培养设备即可，是一种比较简便的提取外泌体的方法，基本可以满足实验研究的要求。
但分离纯度不是很高，并且经过多次离心对外泌体的理化性质造成一定的影响。
2. 密度梯度离心法像所有的脂质小囊泡一样，外泌体悬浮于特定密度梯度的蔗糖中，其密度范围从 1.13g/ml 到1.210g/ml ，将细胞混悬液或匀浆置于蔗糖介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离，从而将外泌体从混杂的物质如蛋白聚集物或细胞凋亡的核小体碎片等中分离出来[2] 。
崔焱[3] 等人根据其这一特性，从大量培养的肿瘤细胞上清中分离纯化外泌体，并对此进行了电镜鉴定; 在得到大量较高纯度的外泌体的基础上，将其加入含有白细胞介素-2（1L-2 ）的淋巴细胞培养体系中，观察其对淋巴细胞增殖的影响。
3. 超滤离心法王伟[4] 等人以树突状细胞为实验材料，基于对外泌体物理特性，大小以及密度的了解，将超滤离心分离外泌体的方法与传统的分级离心法进行了比较，通过实验证明超滤离心法耗时少，产量和纯度都得到了很大程度的提高，是一种比较高效的制备外泌体的方法。
4. 免疫磁珠法将具有磁性的磁珠表面包被特殊的抗体，细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性抗体结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与磁珠结合而不能在磁场中停留，从而使细胞得以分离。
基于微流控技术的外泌体分离方法的研究进展
基于微流控技术的外泌体分离方法的研究进展刘娜;杜盼盼;杨扬;李小毛【摘要】外泌体是一种由细胞分泌的,直径一般为30-150 nm的囊泡.外泌体携带有多种蛋白质、mRNA及miRNA等生物标记物,并直接参与细胞间的信息传递、抗原传递、蛋白转运以及RNA转录等重要的生命活动过程,与癌症等多种疾病的发生密切相关,因此在疾病的发生机制探索和相关疾病的检测中具有重大的应用价值.然而,外泌体通常以游离的形式存在于体液中,对外泌体的分离和纯化是实现基于外泌体的疾病发生机制及疾病检测应用研究的基础.近年来,研究人员利用外泌体的生物物理和生物化学性质研发了多种分离和纯化外泌体的方法技术,主要有超速离心法、聚合物沉淀法、免疫分离法以及基于微流控的分离法等.综述了近年来外泌体分离和纯化方法的研究进展,简要论述了传统的外泌体分离方法,重点介绍了基于微流控技术的外泌体分离方法,并比较了这些方法的分离机制、优缺点以及应用前景.通过对近年来外泌体分离和纯化方法的研究现状进行归纳和比较,旨为相关研究人员开展外泌体研究工作提供参考,从而进一步推进外泌体在疾病检测及其他生物医学应用的研究进展.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2019(035)001【总页数】7页(P207-213)【关键词】外泌体;细胞外囊泡;分离纯化;微流控技术【作者】刘娜;杜盼盼;杨扬;李小毛【作者单位】上海大学机电工程与自动化学院,上海 200072;上海大学机电工程与自动化学院,上海 200072;上海大学机电工程与自动化学院,上海 200072;上海大学机电工程与自动化学院,上海 200072【正文语种】中文外泌体是一种细胞内多泡小体与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外的一种囊泡，具有脂质双分子层结构，直径一般为30-150 nm，与其他微泡共同组成细胞外囊泡［1］。
近几年来的研究表明外泌体具有功能活性并可进行细胞间的信息传递，并且在抗原传递、蛋白及RNA转运、血管介导新生、肿瘤细胞发生发展等过程中发挥着重要作用［2-4］。
外泌体提取方法总结
外泌体提取方法总结外泌体（extracellular vesicles，EVs）是一种存在于细胞外环境中的脂质包裹的小泡，具有重要的生物学功能，参与了细胞间的信息传递、信号调节以及疾病发生发展等过程。
因此，外泌体的提取方法对于研究其功能和应用具有重要意义。
本文将总结目前常用的外泌体提取方法，并探讨其优缺点及适用范围。
1.超速离心法优点：简便快捷，适用于大样本体积。
缺点：提取物质多样性，包含有细胞碎片和蛋白质、RNA等其他成分，纯度较低。
适用范围：适用于初步提取外泌体，如外泌体的形态学研究等。
2.渗透梯度离心法渗透梯度离心法是在超速离心的基础上进一步提高外泌体纯度的方法。
该方法利用碘化金为基础的木糖密度梯度离心，根据外泌体与碘化金的密度差异，将外泌体进一步分离纯化。
优点：能够获得相对纯净的外泌体制备物。
缺点：操作复杂、耗时，不适用于大样本体积。
适用范围：适用于实验室规模的外泌体研究，如RNA测序、质谱分析等。
3.尺寸筛选法尺寸筛选法是通过纳滤膜或超滤膜的孔径来筛选外泌体。
通常使用孔径为0.1-0.22μm的滤膜将细胞碎片和大颗粒物质滤除，获得富含外泌体的滤液。
优点：操作简单方便、适用于大样本体积。
缺点：滤膜的孔径选择对于获得纯净的外泌体制备物有一定的影响。
适用范围：适用于外泌体的初步筛选和快速提取，如外泌体的蛋白质组学研究等。
4.免疫磁珠法免疫磁珠法是利用磁珠表面特异性抗体与外泌体上特定标志物结合，然后通过磁场将目标物质与杂质分离。
该方法可以选择性地提取特定表面标记的外泌体亚群。
优点：高选择性、高灵敏度，适用于特定外泌体的纯化。
缺点：操作相对复杂，适用于实验室规模的外泌体研究。
适用范围：适用于特定外泌体亚群的纯化和研究，如肿瘤相关外泌体的分离等。
总结起来，外泌体的提取方法各有优缺点，在选择时需要根据实验目的和样本特点进行综合考虑。
超速离心法和渗透梯度离心法适合初步提取外泌体，尺寸筛选法适合快速提取外泌体，免疫磁珠法适合提取特定亚群的外泌体。
【CN110152747A】微流控芯片以及外泌体的分离方法【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910388269.4(22)申请日 2019.05.10(71)申请人 清华大学地址 100084 北京市海淀区清华园1号(72)发明人 陈军歌 邢婉丽 (74)专利代理机构 北京华进京联知识产权代理有限公司 11606代理人 王赛 哈达(51)Int.Cl.B01L 3/00(2006.01)C12N 5/078(2010.01)(54)发明名称微流控芯片以及外泌体的分离方法(57)摘要本发明公开了一种碟式的微流控芯片，包括芯片基体，所述芯片基体开设有旋转中心孔，所述芯片基体上设置集成反应单元；所述集成反应单元包括开设在所述芯片基体的同一表面的中央池、多个旁侧池以及连通所述中央池与所述旁侧池之间的通道；至少一个所述通道包括多个液体截留腔，所述液体截留腔将所述通道分隔为多段子通道，不同的所述通道包括不同数量的所述液体截留腔，通过对所述碟式的微流控芯片进行交替的高速离心和低速离心，能够使所述集成反应单元中的液体按照预定顺序在所述旁侧池和所述中央池之间流通。
本发明还公开了一种外泌体的分离方法。
权利要求书3页 说明书12页 附图3页CN 110152747 A 2019.08.23C N 110152747A权 利 要 求 书1/3页CN 110152747 A1.一种碟式的微流控芯片，其特征在于，包括芯片基体，所述芯片基体开设有旋转中心孔，所述芯片基体上设置集成反应单元；所述集成反应单元包括开设在所述芯片基体的同一表面的中央池、多个旁侧池以及连通所述中央池与所述旁侧池之间的通道；至少一个所述通道包括多个液体截留腔，所述液体截留腔将所述通道分隔为多段子通道，不同的所述通道包括不同数量的所述液体截留腔，通过对所述碟式的微流控芯片进行交替的高速离心和低速离心，能够使所述集成反应单元中的液体按照预定顺序在所述旁侧池和所述中央池之间流通。
基于微流控芯片技术的细胞分选和分离研究
基于微流控芯片技术的细胞分选和分离研究近年来，基于微流控芯片技术的细胞分选和分离领域迅速发展。
微流控芯片，也称为实验芯片，是一种微型化实验平台，其特点在于能够对微观流体进行高精度的控制和操作，从而实现对细胞、蛋白质等微小分子的分析和研究。
在生物医学领域，微流控芯片已经广泛应用于细胞分选和分离方面。
传统的细胞分离技术如离心、过滤等存在着细胞损伤、低分离效率等问题，而微流控芯片技术在细胞分选和分离方面具有不可替代的优势。
微流控芯片技术的细胞分选和分离原理主要基于两种机制：一是细胞特异性分选，即通过细胞表面特异分子的亲和作用实现分离；二是物理学分选，即通过细胞的形态和大小等物理特征来进行分离。
细胞特异性分选主要利用细胞表面分子的抗体、配体等来实现。
具体分为两种：一种是细胞正选择，即通过特定抗体与细胞表面特定分子的亲和性从细胞混合物中选择出目标细胞；另一种是细胞负选择，指通过特定抗体或配体剔除指定的非目标细胞，从而分离出目标细胞。
物理学分选则是以细胞的大小、形态等物理性质为基础，将细胞从混合物中分离出来。
这种方法比较简单和有效，但由于不同细胞种类的物理特征有所不同，因此选择性不如特异性分选高。
微流控芯片技术的细胞分选和分离还可以通过三种基本结构来实现：一是双层流芯片，二是单层流芯片，三是三维流体芯片。
双层流芯片的操作方式相对简单，常用于大规模的操作。
但也存在着细胞受损、易堵塞等问题。
单层流芯片则比双层流芯片更加适用于复杂的操作和操作细胞较少的场合。
它的操作流道更加简单，细胞的损伤率也相对较低。
但这种芯片也存在易漏样、细胞沉降缓慢等问题。
三维流体芯片则通过将细胞悬浮液置于三维流体网络中进行分离，其具有更高的分离效率和纯度。
但制备难度和成本也相对较高。
细胞分选和分离的成功与否不仅仅取决于芯片的结构和性质，更重要的是在操作过程中各种细节的处理和控制。
比如，芯片表面需要进行化学修饰以提高特异性；细胞操作时的流速和压力要掌握好，以保证细胞的完整性。
外泌体分离方法
外泌体分离方法
外泌体是一种细胞外释放的小型膜泡，它们携带着细胞内部的蛋白质、核酸和脂质等生物分子，具有多种生物学功能。
在外泌体的研究中，分离和纯化外泌体是一个至关重要的步骤。
以下是一些常见的外泌体分离方法：
1.超速离心法：超速离心是最常用的外泌体分离方法之一。
在离心过程中，通
过多轮逐渐增加转速来沉淀外泌体，接着可以通过洗涤、纯化、再超速离心等步骤来进一步处理并纯化外泌体。
2.密度梯度离心法：密度梯度离心是另一种常用的外泌体分离方法。
通过制备
密度梯度离心液，将外泌体样品加入后进行离心操作，外泌体会随着密度梯度上浮在不同密度的离心液层中，根据分层可以得到纯化的外泌体。
3.尺寸排除色谱法：尺寸排除色谱是基于外泌体尺寸不同于其他细胞外囊泡的
原理而设计的纯化方法。
样品通过尺寸排除柱时，大于一定尺寸的细胞外突起和小于该范围的游离蛋白等被裂解产生的物质会顺着柱体流出，而外泌体则会通过柱子被保留。
该方法具有分离高效、可以同时分离不同种类的外泌体等优点。
4.免疫亲和法：利用特异性抗体驯化对外泌体的靶腐运动来分离纯化外泌体。
一般来说，在研究特定蛋白的外泌泡时使用较为常见。
各种分离方法之间有其各自的优点和限制，不同研究对需要的外泌体纯度、样品量、分析方法等可能都会有所不同，因此需要根据具体研究需求选择适合的外泌体分离方法。
一种基于微流控和ELISA分析的外泌体分离检测系统[发明专利]
![一种基于微流控和ELISA分析的外泌体分离检测系统[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/bd700f22f08583d049649b6648d7c1c708a10b2a.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010103287.6(22)申请日 2020.02.19(71)申请人 南京启医科技有限公司地址 210000 江苏省南京市鼓楼区幕府西路116号401室-176(72)发明人 何慧琼 董鸣 吴婷婷 (51)Int.Cl.G01N 27/327(2006.01)G01N 27/48(2006.01)G01N 33/53(2006.01)B01L 3/00(2006.01)(54)发明名称一种基于微流控和ELISA分析的外泌体分离检测系统(57)摘要本发明提供一种基于微流控和ELISA分析的外泌体分离检测系统，包括微流控芯片，所述的微流控芯片包括顶部聚二甲基硅氧烷层和底部聚二甲基硅氧烷层，所述的底部聚二甲基硅氧烷层和顶部聚二甲基硅氧烷层之间粘合形成封闭的微通道；所述的底部聚二甲基硅氧烷层具有微流控图案，所述的微流控图案包括上样区、样品通道、分隔式微室和出样区，在所述的顶部聚二甲基硅氧烷层上安装有三个电极传感器：工作电极、计数电极和参比电极。
本发明所述的外泌体分离检测系统，在大浓度范围内连续分离并检测含特定抗原的外泌体，具有良好的准确性，不需要外源试剂，可在室温下工作，有效地提高了微剂量样品中外泌体的结合能力，操作便捷。
权利要求书2页 说明书10页序列表1页 附图3页CN 112557475 A 2021.03.26C N 112557475A1.一种基于微流控和ELISA分析的外泌体分离检测系统，其特征在于，所述的外泌体分离检测系统包括微流控装置，所述的微流控装置包括微流控芯片，所述的微流控芯片包括顶部聚二甲基硅氧烷层和底部聚二甲基硅氧烷层，所述的底部聚二甲基硅氧烷层和顶部聚二甲基硅氧烷层之间粘合形成封闭的微通道；所述的底部聚二甲基硅氧烷层具有微流控图案，所述的微流控图案包括上样区、样品通道、分隔式微室和出样区，在所述的顶部聚二甲基硅氧烷层上安装有三个电极传感器：工作电极、计数电极和参比电极。
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浅析基于微流控技术的外泌体分离方法
外泌体是多数细胞都会分泌的胞外小囊泡（Extracellular vesicles或EV），直径为20-140 nm。
它含有来源细胞丰富的核酸和蛋白质，并广泛存在于各种体液之中（在血液中的浓度大于109/mL）。
它们是来源癌细胞遗传物质和蛋白质的稳定载体，能够实时地反映癌症肿瘤的发展状况，在早期癌症诊断方面具有巨大的潜力。
同时外泌体在很多病理生理过程中也发挥着重要作用，如免疫应答中的抗原呈递、肿瘤细胞的生长与迁移、组织损伤修复等。
另外外泌体的脂质双层膜结构不仅能很好的保护其包被物质，而且能靶向特定细胞或组织，有潜力成为新的高效靶向给药载体。
然而，目前已有的外泌体分离方法，例如超速离心和免疫磁珠法等仍存在着如耗费时间长、操作步骤繁琐复杂、设备昂贵和分离纯度低等局限性，尚无法完全满足科研及临床对高纯度外泌体的需求。
所以对快速，高纯度外泌体分离的研究已经成为目前世界上相关领域的研究热点和当务之急。
微流控指的是使用微管道（尺寸为数微米到数百微米）处理或操纵微小流体（体积为纳升到阿升）的系统所涉及的科学和技术，是一门涉及化学、流体物理、微电子、新材料、生物学和生物医学工程的新兴交叉学科。
微流控系统具有分离生物颗粒速度快，分离样本纯度高，节省样本，集成度高等独特优势。
因此，虽然微流控技术在外泌体分离方面的应用仍处于起步阶段，却已经成为了当前研究的热点。
新的基于微流控的外泌体分离技术也于近些年来不断涌现。