小胶质细胞原代培养

小胶质细胞原代培养

时间：15天

试剂：

出生后1-2天的新生C57BL/6小鼠（斯莱克）9只

DF12培养基（GIBCO，C11330）90ml

胎牛血清（FBS）(10%) （GIBCO，10099）5ml

解剖液50ml

1 x胰蛋白酶(0.25%)（Gibco，25200-072）10ml

10mg/ml DNA酶70ul

75%酒精200ml

器材：

酒精棉球1杯（20个）

装有75%酒精的敞口容器1个

原代解剖器械盒（2把中号镊子，1把中号剪刀，1把眼科弯镊，1把眼科直镊，1把眼科剪，2把显微镊，1把显微剪）

洗净消毒后小瓶3个（带盖子）

小平皿4个（带盖子）

解剖镜+冷光源

消毒后卫生纸12张

1ml移液器1把+枪头1盒

10ml玻璃离心管3个

T75大培养瓶3个

消毒后吸管3根

紫外消毒白大褂1件

试剂配制：

中和胰蛋白酶用的完全培养基：DF12 45ml和FBS 5ml混合而成。

步骤：

1、取出生后1-2天的新生C57BL/6小鼠9只，泡在酒精中消毒后取出大脑，置于放有解剖液的小平皿中，在解剖镜下剥离血管膜

关键：注意无菌操作；剥离血管膜要完全

2、将剥离完血管膜的大脑放入预置有1ml解剖液的青霉素小瓶中，用显微剪剪碎（<1mm3）关键：剪碎效果较用枪头吹吸好，要剪得尽量碎

3、加入两滴DNA酶和1ml胰酶（胰酶终浓度为0.125%），于37℃孵箱中孵育15分钟

关键：每5分钟可略微晃动一下以助于消化

4、取出小瓶，将液体倒入离心管中，加5ml完全培养基，离心（1000rpm*5分钟），取出离心管，吸出上清，再加入5ml无血清培养基，吹打后静置沉降20分钟，将上清用吸管吸出，加入T 75大培养瓶中，放入孵箱中培养，3小时后换液。

关键：静置沉降后吸取上清液时吸取中层（最上层和最下层均不要），避免杂质吸入培养瓶中

5、每7天换一次液，培养14天后取出，在摇床中培养6小时（200rpm ，37o C），取上清加入离心管中离心（400g*8分钟），弃上清，加入4ml无血清培养基轻轻吹打重悬，均匀滴加于24孔培养板的中央4个孔中，于孵箱中培养半小时使小胶质细胞贴壁，取出，吸出上清，再每个孔加1ml培养基，即得较纯净的小胶质细胞。

关键：小胶质细胞贴壁后吸取上清当轻微吹打，以使杂细胞悬浮吸去