胚胎干细胞培养标准化操作规程
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ITSFn and N3： 配制一20×不含DMEM/F12的溶液。分装在15ml FALCON管中，（稀释为
1×，ITSFn 7.05ml，N3 12.55ml），0.2μm滤膜过滤，贮存在-20℃。 将该溶液加入DMEM/F12中制备培养基，贮存于4℃。 贮存液 DMEM(高糖) 转铁蛋白50mg/ml 胰岛素5mg/ml 亚硒酸钠300μM 黄体酮（20μM） 腐胺（100μM） PEST（P104U/ml S104μg/ml） 层粘连蛋白100μg/ml 纤维连接蛋白250μg/ml 碱性rhFGF, 10μg/ml *在第4步将bFGF加入N3培养基使终浓度为10ng/ml。
体外分化方法
第1步：ES培养基 在LIF（ESGRO）存在的条件下维持细胞培养
第2步：EB培养基 使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。 1．分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分） 2．纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50ml Falcon管中，计数细 胞取适量体积放入15ml管中离心3分钟。 3．用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液 4．一个15cm的细菌培养皿接种4～5×106个细胞（1个完全融合的组织 培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。 5．2天后更换培养基 将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。弃去上清，将细胞重 悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。 6．用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即 是细胞的移植步骤）。1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行 第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。 形成胚状体需要4天时间。在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织 培养皿的表面。这一天被认为是第2步和第3步的分界。
附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2， 100％湿度条件下培养。
培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基-见下文）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存 在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养 基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。
包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）
包被液的准备 多聚-L-鸟氨酸，15μg/ml 把75ml多聚-L-鸟氨酸和425ml 1×PBS混合。贮存在4℃。 纤维结合蛋白，1μg/ml 把0.5ml纤维结合蛋白和500ml 1×PBS混合。
包被过程： 1．加入多聚-L-鸟氨酸，至少2－3小时（过夜也行） 2．吸出多聚-L-鸟氨酸 3．加入纤维结合蛋白，大约1－2小时 4．吸出纤维结合蛋白，放置30分钟晾干 5．贮存在4℃ 24孔板用200μl，6孔板用500μl。震荡培养板确保溶液能够覆盖盖玻 片或培养孔。有时需要剧烈震荡培养板。
移植 1．将胚状体转移至一15ml 圆锥形管中放置3～5分钟使胚状体沉降下 来。 细胞被离心3分钟会更好。放置使之沉降将会去除更多的单个细胞（包 括死细胞）而这些细胞可以被离心下来。 2．去除上清将胚状体重悬于无钙镁离子的1×PBS中 3．离心3分钟 4．去除上清加入1×胰酶（10cm的培养皿加1ml） 5．37℃水浴5分钟 6．加入5mlEB培养基小心吹打约10次 小心处理细胞很重要，进行细胞传代分散细胞时不可剧烈吹打。 7．离心2分钟 8．吸出上清将细胞重悬于500μl EB培养基 9．用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次 10．离心2次 11．吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基
第3步--ITSFn培养基 在最少量培养基中选择神经前体细胞 1．在胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基 2．并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时 要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
3．保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基--大约每隔 一天。 观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。当神经样细胞能够 被鉴别时，转入到第4步。步骤的转换应该在神经前体细胞出现第一个 清晰的标志几天以后，通常是在第3步的第6到第10天。
细胞传代 建议每2－3天传代细胞一次，过度生长的细胞会降低细胞的自然分化 率，我们建立了一种纯化方法来去除分化细胞，在将细胞接种在明胶包 被的培养板上之前，通过将分化细胞黏附在没有包被的组织培养板上去 除分化细胞。纯化步骤包含在下面的方法中。
1．去除培养液； 2．1×无钙镁PBS洗涤； 3．加入1×胰酶EDTA(10×胰酶EDTA用PBS稀释。)37℃孵育5分钟。 4．加入ES培养基使胰酶失活； 5．将细胞转入15ml离心管中离心3min； 6．去除上清，将细胞重悬于2mlES培养基，至少吹打10－20次。
胚胎干细胞培养标准化操作规程
目录
一、细胞
二、一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态 培养基 细胞复苏 冻存细胞 明胶包被 细胞传代
三、体外分化 培养基 包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片） 体外分化方法
四、移植细胞的准备
细胞
多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡 1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。由Dr. Nagy的实验室制 备。 2．D3-ATCC; CRL-1934. 我们得到时大约传了17代。 3．J1-由Dr. Jaenish的实验室友情提供。我们得到时大约传了7－9 代。 4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr. Jaenish的实验室友情提供。 5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr. Nagy的实验室提供。
烟酸己可碱标记ES细胞进行移植 1．准备一10μg/ml的烟酸已可碱染液（双苯酰亚胺，在冷冻室118） 2．加入1mg（你能称到的最小量）到5ml EB培养基（制成200μg/ml） 3．将溶液稀释成10μg/ml （100μl 200μg/ml 溶液和1.9ml EB培养 基） 4．如前所述将细胞重悬于2ml烟酸已可碱染液而不是EB培养基中制备ES 细胞悬液， 5．将悬液置于室温（或冰上）30分钟 6．离心2分钟 7．吸出上清将细胞重悬于2ml EB培养基 8．重复一次 9．离心2分钟 10．吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基并置于冰上。
第4步－N3培养基＋bFGF 通过将神经前体细胞培养在含有10ng/ml bFGF的培养基中进行扩增。 1.PBS洗涤，加入2ml 1×胰酶（1个15cm的培养皿所需胰酶的量根据前 文表中的体积）（10×胰酶EDTA用PBS稀释） 2．37℃孵育5分钟 3．用4mlEB培养基终止胰酶活性，将细胞转入锥形管中放置3～5分钟移 出细胞团，将上清移入一新的离心管离心。 4．将细胞重悬于含有bFGF的N3培养基。 5．将细胞接种在包被多聚-L-鸟氨酸/纤维连接蛋白的盖玻片上（最好 将盖玻片放于24孔培养板或6孔培养板，6孔培养板中每孔放置5个盖玻 片如果是塑料的放置4个，以使最大可能的获得样品数量）。24孔板接 种3.5×105/孔或6孔板1.7×106/孔。 6．2天后更换培养基
第5步－N3培养基 通过撤除bFGF使神经前体细胞分化 1．细胞被接种在盖玻片上4天后将培养基换成不含bFGF的N3培养基 2．根据需要换液（大约每隔一天） 3．分化10～15天后固定细胞 移除培养基 PBS洗涤 加入4%福尔马林 室温放置30分钟 PBS洗涤2次 储存于PBS。长期储存使用含0.01％叠氮化纳的PBS 移植细胞的准备 细胞在胚状体形成4天以后被移植（相应于体外分化过程中的第2步末细 胞被转种到组织培养板）。正如在前文体外分化中所描述的在移植之前 4天开始形成胚状体。通常再需要一天时间以便将胚状体移植入一10cm 的培养皿。
步骤： 1．从液氮中取出一管细胞； 2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）； 3．将细胞转移到一15ml Falcon管中； 4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）； 5．离心3分钟； 6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次； 7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿； 8．孵育。
ITSFn and N3培养基贮存液的准备 使用无菌的溶剂和稀释液，在分装之前要对溶液进行过滤，如果因为某 些原因溶液在分装之前没有进行过滤，需要在管子上标明以便别人在使 用时知道该溶液不能直接用于细胞培养。 贮存液 溶剂，贮存液，稀释剂和储存 转铁蛋白50mg/ml 胰岛素5mg/ml 亚硒酸钠300μM 黄体酮（20μM） 腐胺（100μM） PEST（P104U/ml S104μg/ml） 层粘连蛋白（100μg/ml） 纤维连接蛋白（250μg/ml ） 碱性rhFGF, （10μg/ml）
贮存液 DMEM(高糖) 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST ESGHale Waihona Puke BaiduO
复苏细胞 细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成 会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是 很重要的。
冻存细胞
冻存液 90％HS和10％二甲基亚砜
步骤： 1．1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内； 2．用细胞刮刀收集细胞； 3．将细胞转入15ml Falcon管内并离心3分钟； 4．弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10cm的培养皿用2ml，15cm 的培养皿用6－7ml。） 5．分装于冻存管内，每管1ml； 6．置－80℃过夜，第二天移入液氮。
一般培养--维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞 的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建 议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次， 细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预 先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘
明胶包被 准备500ml 0.1％明胶溶液 1．将0.5g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分 钟）。 2．最好在溶液没有冷却的情况下通过0.2μm滤膜过滤，贮存在4℃。 包被培养板或培养皿 1．加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15cm培养皿加2ml，10cm培养皿 加0.5～1ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行 了。）； 2．置室温30分钟； 3．去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平 方，以免明胶污染盖子和流出培养板。
如果加入培养基的量较少会比较容易将细胞团弄散分开。ES细胞有聚集 成团的倾向，传代过程中仔细将细胞弄散分开很重要。这样可能会减少 细胞的自然分化。 7．将细胞接种在没有包被的组织培养皿中（使用和一开始同样规格的 培养皿）放入温箱2小时（分化细胞在该时间内将黏附，而ES细胞仍将 保持悬浮）； 8．将含有细胞的培养基转入明胶包被（见下文）的组织培养皿。吹打 以确保细胞被分散开（前面已经提到--ES细胞有聚集成团的倾向） 9．建议按1：4－1：10的比率传代(ATCC) 保持细胞的传代比率很重要，以我们的经验，1：8的比率是好的，可以 使细胞的自然分化降到最低。当你使用不同规格的培养板进行细胞传代 可以使用表1来计算传代比率。
体外分化 多能胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。我们的体外分化 方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在 有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。细胞全程培养 在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。 时间线（总时间为27～34天） 第2步；4＋1天 第3步；4－10天 第4步；4天 第5步；10－15天 培养基 EB 配制一20×不含DMEM，FBS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于ES培养基-见前述）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存 在-20℃。将21ml该溶液和50ml FBS加入450mlDMEM中制备培养基， 0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。 贮存液 DMEM(高糖) 胎牛血清 L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST（P104U/mlS104μg/ml
1×，ITSFn 7.05ml，N3 12.55ml），0.2μm滤膜过滤，贮存在-20℃。 将该溶液加入DMEM/F12中制备培养基，贮存于4℃。 贮存液 DMEM(高糖) 转铁蛋白50mg/ml 胰岛素5mg/ml 亚硒酸钠300μM 黄体酮（20μM） 腐胺（100μM） PEST（P104U/ml S104μg/ml） 层粘连蛋白100μg/ml 纤维连接蛋白250μg/ml 碱性rhFGF, 10μg/ml *在第4步将bFGF加入N3培养基使终浓度为10ng/ml。
体外分化方法
第1步：ES培养基 在LIF（ESGRO）存在的条件下维持细胞培养
第2步：EB培养基 使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。 1．分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分） 2．纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50ml Falcon管中，计数细 胞取适量体积放入15ml管中离心3分钟。 3．用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液 4．一个15cm的细菌培养皿接种4～5×106个细胞（1个完全融合的组织 培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。 5．2天后更换培养基 将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。弃去上清，将细胞重 悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。 6．用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即 是细胞的移植步骤）。1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行 第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。 形成胚状体需要4天时间。在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织 培养皿的表面。这一天被认为是第2步和第3步的分界。
附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2， 100％湿度条件下培养。
培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基-见下文）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存 在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养 基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。
包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）
包被液的准备 多聚-L-鸟氨酸，15μg/ml 把75ml多聚-L-鸟氨酸和425ml 1×PBS混合。贮存在4℃。 纤维结合蛋白，1μg/ml 把0.5ml纤维结合蛋白和500ml 1×PBS混合。
包被过程： 1．加入多聚-L-鸟氨酸，至少2－3小时（过夜也行） 2．吸出多聚-L-鸟氨酸 3．加入纤维结合蛋白，大约1－2小时 4．吸出纤维结合蛋白，放置30分钟晾干 5．贮存在4℃ 24孔板用200μl，6孔板用500μl。震荡培养板确保溶液能够覆盖盖玻 片或培养孔。有时需要剧烈震荡培养板。
移植 1．将胚状体转移至一15ml 圆锥形管中放置3～5分钟使胚状体沉降下 来。 细胞被离心3分钟会更好。放置使之沉降将会去除更多的单个细胞（包 括死细胞）而这些细胞可以被离心下来。 2．去除上清将胚状体重悬于无钙镁离子的1×PBS中 3．离心3分钟 4．去除上清加入1×胰酶（10cm的培养皿加1ml） 5．37℃水浴5分钟 6．加入5mlEB培养基小心吹打约10次 小心处理细胞很重要，进行细胞传代分散细胞时不可剧烈吹打。 7．离心2分钟 8．吸出上清将细胞重悬于500μl EB培养基 9．用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次 10．离心2次 11．吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基
第3步--ITSFn培养基 在最少量培养基中选择神经前体细胞 1．在胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基 2．并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时 要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
3．保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基--大约每隔 一天。 观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。当神经样细胞能够 被鉴别时，转入到第4步。步骤的转换应该在神经前体细胞出现第一个 清晰的标志几天以后，通常是在第3步的第6到第10天。
细胞传代 建议每2－3天传代细胞一次，过度生长的细胞会降低细胞的自然分化 率，我们建立了一种纯化方法来去除分化细胞，在将细胞接种在明胶包 被的培养板上之前，通过将分化细胞黏附在没有包被的组织培养板上去 除分化细胞。纯化步骤包含在下面的方法中。
1．去除培养液； 2．1×无钙镁PBS洗涤； 3．加入1×胰酶EDTA(10×胰酶EDTA用PBS稀释。)37℃孵育5分钟。 4．加入ES培养基使胰酶失活； 5．将细胞转入15ml离心管中离心3min； 6．去除上清，将细胞重悬于2mlES培养基，至少吹打10－20次。
胚胎干细胞培养标准化操作规程
目录
一、细胞
二、一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态 培养基 细胞复苏 冻存细胞 明胶包被 细胞传代
三、体外分化 培养基 包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片） 体外分化方法
四、移植细胞的准备
细胞
多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡 1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。由Dr. Nagy的实验室制 备。 2．D3-ATCC; CRL-1934. 我们得到时大约传了17代。 3．J1-由Dr. Jaenish的实验室友情提供。我们得到时大约传了7－9 代。 4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr. Jaenish的实验室友情提供。 5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr. Nagy的实验室提供。
烟酸己可碱标记ES细胞进行移植 1．准备一10μg/ml的烟酸已可碱染液（双苯酰亚胺，在冷冻室118） 2．加入1mg（你能称到的最小量）到5ml EB培养基（制成200μg/ml） 3．将溶液稀释成10μg/ml （100μl 200μg/ml 溶液和1.9ml EB培养 基） 4．如前所述将细胞重悬于2ml烟酸已可碱染液而不是EB培养基中制备ES 细胞悬液， 5．将悬液置于室温（或冰上）30分钟 6．离心2分钟 7．吸出上清将细胞重悬于2ml EB培养基 8．重复一次 9．离心2分钟 10．吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基并置于冰上。
第4步－N3培养基＋bFGF 通过将神经前体细胞培养在含有10ng/ml bFGF的培养基中进行扩增。 1.PBS洗涤，加入2ml 1×胰酶（1个15cm的培养皿所需胰酶的量根据前 文表中的体积）（10×胰酶EDTA用PBS稀释） 2．37℃孵育5分钟 3．用4mlEB培养基终止胰酶活性，将细胞转入锥形管中放置3～5分钟移 出细胞团，将上清移入一新的离心管离心。 4．将细胞重悬于含有bFGF的N3培养基。 5．将细胞接种在包被多聚-L-鸟氨酸/纤维连接蛋白的盖玻片上（最好 将盖玻片放于24孔培养板或6孔培养板，6孔培养板中每孔放置5个盖玻 片如果是塑料的放置4个，以使最大可能的获得样品数量）。24孔板接 种3.5×105/孔或6孔板1.7×106/孔。 6．2天后更换培养基
第5步－N3培养基 通过撤除bFGF使神经前体细胞分化 1．细胞被接种在盖玻片上4天后将培养基换成不含bFGF的N3培养基 2．根据需要换液（大约每隔一天） 3．分化10～15天后固定细胞 移除培养基 PBS洗涤 加入4%福尔马林 室温放置30分钟 PBS洗涤2次 储存于PBS。长期储存使用含0.01％叠氮化纳的PBS 移植细胞的准备 细胞在胚状体形成4天以后被移植（相应于体外分化过程中的第2步末细 胞被转种到组织培养板）。正如在前文体外分化中所描述的在移植之前 4天开始形成胚状体。通常再需要一天时间以便将胚状体移植入一10cm 的培养皿。
步骤： 1．从液氮中取出一管细胞； 2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）； 3．将细胞转移到一15ml Falcon管中； 4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）； 5．离心3分钟； 6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次； 7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿； 8．孵育。
ITSFn and N3培养基贮存液的准备 使用无菌的溶剂和稀释液，在分装之前要对溶液进行过滤，如果因为某 些原因溶液在分装之前没有进行过滤，需要在管子上标明以便别人在使 用时知道该溶液不能直接用于细胞培养。 贮存液 溶剂，贮存液，稀释剂和储存 转铁蛋白50mg/ml 胰岛素5mg/ml 亚硒酸钠300μM 黄体酮（20μM） 腐胺（100μM） PEST（P104U/ml S104μg/ml） 层粘连蛋白（100μg/ml） 纤维连接蛋白（250μg/ml ） 碱性rhFGF, （10μg/ml）
贮存液 DMEM(高糖) 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST ESGHale Waihona Puke BaiduO
复苏细胞 细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成 会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是 很重要的。
冻存细胞
冻存液 90％HS和10％二甲基亚砜
步骤： 1．1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内； 2．用细胞刮刀收集细胞； 3．将细胞转入15ml Falcon管内并离心3分钟； 4．弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10cm的培养皿用2ml，15cm 的培养皿用6－7ml。） 5．分装于冻存管内，每管1ml； 6．置－80℃过夜，第二天移入液氮。
一般培养--维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞 的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建 议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次， 细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预 先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘
明胶包被 准备500ml 0.1％明胶溶液 1．将0.5g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分 钟）。 2．最好在溶液没有冷却的情况下通过0.2μm滤膜过滤，贮存在4℃。 包被培养板或培养皿 1．加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15cm培养皿加2ml，10cm培养皿 加0.5～1ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行 了。）； 2．置室温30分钟； 3．去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平 方，以免明胶污染盖子和流出培养板。
如果加入培养基的量较少会比较容易将细胞团弄散分开。ES细胞有聚集 成团的倾向，传代过程中仔细将细胞弄散分开很重要。这样可能会减少 细胞的自然分化。 7．将细胞接种在没有包被的组织培养皿中（使用和一开始同样规格的 培养皿）放入温箱2小时（分化细胞在该时间内将黏附，而ES细胞仍将 保持悬浮）； 8．将含有细胞的培养基转入明胶包被（见下文）的组织培养皿。吹打 以确保细胞被分散开（前面已经提到--ES细胞有聚集成团的倾向） 9．建议按1：4－1：10的比率传代(ATCC) 保持细胞的传代比率很重要，以我们的经验，1：8的比率是好的，可以 使细胞的自然分化降到最低。当你使用不同规格的培养板进行细胞传代 可以使用表1来计算传代比率。
体外分化 多能胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。我们的体外分化 方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在 有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。细胞全程培养 在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。 时间线（总时间为27～34天） 第2步；4＋1天 第3步；4－10天 第4步；4天 第5步；10－15天 培养基 EB 配制一20×不含DMEM，FBS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于ES培养基-见前述）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存 在-20℃。将21ml该溶液和50ml FBS加入450mlDMEM中制备培养基， 0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。 贮存液 DMEM(高糖) 胎牛血清 L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST（P104U/mlS104μg/ml