胚胎干细胞培养标准化操作规程
胚胎干细胞和多能诱导干细胞培养方法
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人核移植胚胎干细胞流程
人核移植胚胎干细胞流程一、什么是核移植胚胎干细胞呀。
咱先得知道核移植胚胎干细胞是个啥。
简单来说呢，这就像是一场细胞界的“乾坤大挪移”。
就是把一个细胞的细胞核拿出来，放到另外一个细胞里面去，然后让这个新组合的细胞发育成胚胎干细胞。
这胚胎干细胞可不得了，就像是细胞里的超级种子，可以变成各种各样的细胞呢。
就好比是孙悟空的毫毛，想变啥变啥。
二、准备工作要做好。
1. 细胞的选择。
我们得找好要用的细胞呀。
就像去菜市场买菜一样，得挑挑拣拣。
供体细胞和受体细胞都得精心挑选。
供体细胞呢，一般会选择那些比较容易操作，而且遗传物质比较清楚的细胞。
比如说皮肤细胞就比较常用啦。
受体细胞呢，通常是卵细胞啦，因为卵细胞比较大，就像一个大房子，能容纳新的细胞核，而且它里面有很多营养物质和调控因子，就像房子里装满了各种生活必需品，可以帮助新组合的细胞好好发育。
2. 工具和环境。
这就和做菜得有锅碗瓢盆一样，我们也需要一些特殊的工具。
像显微操作仪这种高级的东西，就是我们在微观世界里操作细胞的“小镊子”和“小铲子”。
还有，这个操作得在一个非常干净、稳定的环境里进行，就像宝宝要在一个安静、舒适的房间里成长一样。
实验室的温度、湿度、空气质量都得严格控制，这样细胞才能舒舒服服地进行它们的“变身”之旅。
三、核移植的操作过程。
1. 去核。
先把受体卵细胞的核去掉。
这可不容易呢，就像从一个精美的小盒子里小心翼翼地取出一颗珍珠一样。
得用很细很细的针，在显微镜下一点一点地把核吸出来，这过程得超级小心，要是不小心把卵细胞弄坏了，那就前功尽弃啦。
2. 注核。
然后把供体细胞的核注入到去核的卵细胞里面。
这就像是给一个空房子请来了新的主人。
这个注入的过程也得很精准，要确保核能够在卵细胞里安家落户，并且能够开始发挥它的作用。
四、让细胞开始发育。
注入核之后呢，这个新组合的细胞就像是被注入了魔法一样，开始慢慢发育啦。
它会像正常的受精卵一样，开始分裂，从一个细胞变成两个，两个变成四个，四个变成八个……这个过程就像是看着一颗小种子慢慢发芽、长大一样，超级神奇。
胚胎干细胞体外培养.
胚胎干细胞体外培养.胚胎干细胞体外培养(一)胚胎干细胞的来源目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。
其中囊胚的ICM最为常用。
(二)胚胎干细胞的分离1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。
以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。
以PGCs取ES 细胞时：小鼠取12.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或13.5～14.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。
2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。
从囊胚分离ICM的方法主要有三种：(1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。
这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。
(2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。
利用培育技术进行胚胎干细胞培养的操作步骤
利用培育技术进行胚胎干细胞培养的操作步骤胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，简称ESCs）是一种具有无限分裂潜能的细胞，可以分化成人体中任何类型的细胞。
这使得胚胎干细胞培养成为研究和治疗许多疾病的潜在方法。
在利用培育技术进行胚胎干细胞培养的操作步骤中，有几个关键的步骤是必须仔细考虑和执行的。
首先，需要获取胚胎。
这个过程通常是通过体外受精(In Vitro Fertilization，简称IVF)完成的。
医生会收集女性的卵子和男性的精子，然后将它们结合在一起，在实验室环境中进行体外受精。
这一步骤要确保卵子和精子的质量，并控制好培养环境的温度和湿度。
接下来，受精后的卵子会不断分裂，形成胚胎。
为了获取胚胎干细胞，最常用的方法是在胚胎发育到八细胞阶段时，将其分离成单个细胞。
这个过程被称为细胞扩增(Cell Expansion)。
细胞扩增的关键是确保每个细胞的健康和稳定性。
细胞扩增过程中，常常需要添加培养基和生长因子，以促进细胞的分裂和生长。
当细胞扩增到一定数量时，就可以开始进行胚胎干细胞的分化。
分化过程通常涉及将胚胎干细胞移植到特定的培养基中，并加入适当的生长因子和细胞信号转导分子。
这些因子和分子可以模拟人体内特定发育时期的信号，从而促使胚胎干细胞向特定种类的细胞分化。
例如，通过添加一种叫作“Noggin” 的蛋白质，胚胎干细胞可以被诱导分化为神经细胞。
分化的结果取决于培养的时间和添加的生长因子，以及其他培育条件的调节。
通过对胚胎干细胞的培养和分化过程进行精确控制，研究人员可以获得一系列不同类型的细胞，包括心脏细胞、肝细胞、胰岛细胞等。
这些特定的细胞类型可以应用于研究、药物测试和再生医学等领域。
需要注意的是，胚胎干细胞培养涉及许多伦理和法律问题。
在进行胚胎干细胞研究和应用时，必须确保遵守伦理准则和法律规定，保护人类生命和尊严。
总结来说，利用培育技术进行胚胎干细胞培养涉及从胚胎获取细胞、进行细胞扩增和细胞分化的过程。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤小鼠胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）是一类在小鼠早期胚胎内分化产生的多能干细胞。
培养和研究ESC可以为了解细胞发育和分化提供重要的实验材料。
下面将为您介绍小鼠胚胎干细胞培养的一般步骤。
一、准备实验所需材料和器械：1.小鼠胚胎干细胞系（ES细胞系）。
2.ESC培养基：一般使用含有LIF（鼠胚性干细胞生长因子）的培养基，如DMEM/F12或DMEM培养基，添加血清、LIF等。
3.ESC传代培养基：与ESC培养基相同，但不含LIF。
4.ESC学习培养基：免LIF和血清的无血清培养基，可以用于学习ES细胞的分化能力。
5. ESC传递板（T25细胞培养板、10 cm细胞培养板等）。
6.培养皿：培养皿的选择可以根据不同的实验目的选用，如离体实验可以选择培养皿或培养碟等。
7.显微镜：用于观察和鉴定细胞形态。
8.细胞培养箱：用于多肽瓶、培养皿等细胞培养。
9.无菌注射器、移液器、离心管等常见实验器材，以及媒液和试剂。
二、实验步骤：1.将小鼠胚胎干细胞系解冻至细胞存储液解冻的方法，迅速转移到预先加热培养皿中。
添加完整的ESC培养基，将细胞孵育在37℃、5%CO2的培养箱中。
2.每两天更换一次ESC培养基，观察细胞的形态和生长情况。
当细胞接近80%的密度时，可以进行传代。
3.小鼠胚胎干细胞的传代通常采用机械法和酶解法两种方法。
机械法是直接使用离心管头吸吸细胞，然后用超声波吹散细胞，最后转入新的培养皿中。
酶解法则是先用胰酶等酶溶解细胞，形成单细胞悬液，然后接种入新的培养皿中。
4.传代完成后，继续在37℃、5%CO2的培养箱中培养细胞，并定期更换培养基。
5.ESC的分化实验通常采用去除LIF和血清的无血清培养基。
将小鼠胚胎干细胞移到含有学习培养基的培养皿中，观察和记录细胞的分化情况。
6.对于特定的实验要求，如体外器官培养、离体实验等，可以将小鼠胚胎干细胞移至特定的培养皿或装置中，进行相关实验。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤 一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化 ...
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态培养基细胞复苏冻存细胞明胶包被细胞传代体外分化培养基包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）体外分化方法注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。
不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol 和培养基。
一般培养--维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
如果在Feed 细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。
下文中暂不提及Feed细胞。
Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml 该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。
贮存于4℃，时间不要超过2周。
贮存液DMEM(高糖)马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
人胚胎干细胞标准
人胚胎干细胞标准1. 引言人胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESC）具有广泛的临床应用前景，对于生物医学研究、组织工程和再生医学等领域具有重要意义。
为保证研究和应用的安全性、合法性和可追溯性，制定人胚胎干细胞标准是必要的。
2. 定义人胚胎干细胞指从人类早期胚胎的内细胞团中获取的可自我更新和不同化为各种细胞类型的细胞。
这些细胞在培养条件下具有无限增殖的潜能，并具备形成各种组织和器官的能力。
3. 采集标准3.1. 采集人胚胎细胞应符合伦理和法律规定，确保以严格的合规性进行。
3.2. 采集应当基于捐赠者自愿的原则，并在获得充分知情同意后进行。
3.3. 采集过程应遵循标准化的操作规程和专业的技术操作。
4. 建库和保存标准4.1. 采集的胚胎细胞应尽快转入胚胎胚长纹理胚状态，并在体外培养过程中保持胚胎质量。
4.2. 对采集的胚胎细胞应进行认证和鉴定，确保其纯度和活力。
4.3. 采用低温条件，如液氮，进行长期保存，并实施严格的样品管理和质量控制。
5. 质量控制标准5.1. 胚胎干细胞应具备自我更新和不同化为各种功能细胞的能力，并能在培养条件下形成稳定的细胞系。
5.2. 细胞的纯度应满足特定的标准，以确保不同化程度的细胞比例符合要求。
5.3. 细胞应进行各项生物学和遗传学检测，以确保细胞质量及其来源的准确性。
6. 应用和传递标准6.1. 人胚胎干细胞的应用应遵循相关伦理和法律法规，并经过批准的临床试验验证其有效性和安全性。
6.2. 细胞的传递和共享应在合法的合作机构之间进行，并确保相关技术和标准的规范化。
7. 安全和伦理标准7.1. 任何与人胚胎干细胞相关的研究和使用应遵循伦理委员会或伦理审查机构的批准。
7.2. 关于人胚胎细胞的使用应确保保护捐赠者和使用者的隐私和权益。
7.3. 遵循相关的安全指导和标准，确保实验操作和应用过程中的安全性。
8. 结论人胚胎干细胞的标准制定是确保其安全、合法和可追溯应用的基础。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤以下是小鼠胚胎干细胞的培养实验步骤：1.准备培养基和细胞培养器材：-将培养基预热至37摄氏度。
-准备含有培养基的无菌试管、离心管和细胞培养板。
-洗手并戴上合适的培养操作手套。
2.预处理培养皿：-用无菌PBS（磷酸盐缓冲液）将细胞培养板彻底洗涤，去除残留的培养基和细胞残留物。
-用0.1%胰蛋白酶溶液或0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液将细胞培养板上的细胞进行脱落。
-将细胞均匀地分布在预处理的培养皿中，使其形成单层细胞。
3.检查细胞数目和品质：-用显微镜检查细胞的形态和活力。
-用细胞计数计算细胞的数目。
-计算细胞的分裂倍增时间。
4.细胞传代：-按照需要的细胞密度将细胞从一个培养皿转移到另一个培养皿。
-用0.05%胰蛋白酶-EDTA将细胞从培养皿上脱落。
-投入适当比例的培养基到新的培养皿中，使其形成单层细胞。
5.制备小鼠胚胎纤维母细胞：-从小鼠胚胎体内收集纤维母细胞。
- 将纤维母细胞转移到含有DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）和10%胎牛血清的细胞培养皿中。
-培养纤维母细胞在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中直至细胞接触起离皿表面。
6.制备和维持小鼠胚胎干细胞：-转接分裂期的小鼠胚胎干细胞到新的培养皿中。
-用无菌吸管或离心管的尖端轻轻挑取细胞克隆。
-将细胞克隆转移到含有mESC培养基（如DMEM、15%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺和1×LIF（小鼠白细胞介素-6）的细胞培养板中。
-在体外细胞培养中维持小鼠胚胎干细胞的自我更新和增殖。
7.细胞培养的常规维护：-定期更换新鲜的培养基。
-检查细胞的形态和活力。
-定期传代细胞，以保持其细胞数目和活力。
-控制培养基和细胞的污染。
以上是小鼠胚胎干细胞培养的一般步骤，实验过程可能因研究目的和实验室的要求而有所不同。
为了保证实验的准确性和可重复性，建议在实验过程中随时记录和保留实验数据，并使用正确的实验操作和生物安全规范。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
细胞的原代培养点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园一、原代细胞培养原理原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。
借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。
• 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养• 掌握无菌操作技术• 了解小鼠解剖操作技术• 了解原代细胞培养的一般方法与步骤•了解培养细胞的消化分散• 了解倒置显微镜的使用二、实验材料• 实验动物：孕鼠或新生小鼠• 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清）0.25%胰蛋白酶平衡盐溶液70%乙醇•器材：灭菌镊子、剪刀若干把灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个吸管若干支酒精灯原代细胞培养方法三、胰酶消化法（1）胰酶消化法操作步骤——取材a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。
c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。
d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。
e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。
f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。
继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。
（2）胰酶消化法操作步骤——切割a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。
b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。
c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
（3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
小鼠胚胎干细胞培养实验具体步骤及方法
小鼠胚胎干细胞培养实验具体步骤及方法胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。
我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。
细胞全程培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。
一般体外诱导向神经细胞方向分化，也可以采用低浓度的RA进行诱导。
具体步骤一、ES培养基在LIF存在的条件下维持细胞培养。
二、EB培养基使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。
1. 分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分）。
2. 纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50 ml Falcon管中，计数细胞取适量体积放入15 ml管中离心3分钟。
3. 用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液4. 一个15 cm的细菌培养皿接种4～5x106个细胞（1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。
5. 2天后更换培养基，将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。
弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。
6. 用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）。
1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。
7. 形成胚状体需要4天时间。
在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。
这一天被认为是第2步和第3步的分界。
三、ITSFn培养基在最少量培养基中选择神经前体细胞1. 胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基。
2. 并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
3. 保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基--大约每隔一天。
4. 观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。
当神经样细胞能够被鉴别时，转入到第4步。
细胞培养标准操作程序（SOP）.docx
细胞培养标准操作程序（SOP）.docx细胞培养标准操作程序（SoP1.目的：为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养操作流程。
2 .适用范围：适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。
3 ?操作规程：3.1培养液、PBS、胰蛋白酶的配制3.1.1 100Oml培养液的配制1、准备用品：培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2?3天内的新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）、NaHCo3粉、1000ml无菌玻璃瓶（100ml× 10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2?3个过滤器、注射器。
紫外线照台30min。
2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）溶解，并冲洗袋内残留粉末。
3、充分搅拌,按说明添加成分（如InVitrogen公司的RPMl-1640配制1000ml需加NaHCO3粉2.0g , InVitrogen公司的DMEM需加NaHCo3粉3.7g等），再充分搅拌。
无需加谷氨酰胺，因该培养基里已含有。
4、用1M （1mol∕L ）HCl调PH至7.0左右（细胞适宜在PH7.2?7.4生长，配制好后PH值会升高0.2?0.3 ,故配时调PH至7.0左右）。
5、用新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）定容到1000ml。
6、配青霉素80万/瓶+ 4ml蒸馏水溶解配链霉素100万/瓶+ 4ml蒸馏水溶解取0.5ml青霉素和0.4ml链霉素加入到1000ml培养液中，使其终浓度均为100U/ml ,充分搅拌混匀。
7、在无菌操作台里用0.22Um的除菌滤膜过滤配制好的培养液，并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口，盖上橡皮塞，放-20 C保存备用。
注意：（1 ）配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl和（或）NaOH均需新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）配制。
一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量。
（2）准备的100ml× 10个玻璃瓶必须事先高压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。
人胚胎干细胞分离培养与纯化
人胚胎干细胞
1.原代培养及纯化
复苏冷冻的胚胎，用G1.3、G2.3序贯培养法培养至囊胚。
将扩张囊胚移入链霉蛋白酶中，在光镜下观察，在透明带即将完全消化溶解之前移出，用DPBS或DMEM-F12液充分洗涤后种植到灭活的鼠胚胎成纤维细胞上。
种植后每隔12 h观察孵出囊胚的贴壁、增殖情况和分化倾向，种植后约36～48 h后换液，随后每天半量换液或根据培养孔内细胞代谢情况予以换液。
原代克隆生长10～14 d时进行初次传代，前5 代细胞采用机械法，即用拉细的玻璃毛细管将细胞团块刮出，再用1 ml注射器针头在体式显微镜下将克隆分散成适当团
块，重新接种到预先种有饲养层的培养皿中，每日换液。
待hES细胞生长稳定后换用0．05％dispase消化细胞，37℃作用3～5 min，吸管轻轻吹打成约含30--50个细胞的小团块，传代培养，每日换液。
2.原代培养及纯化
将hES细胞培养于60mm组织器官培养皿中。
培养皿事先用含有0.1％白明胶包被及加入1 x 106个经放射性照射的MF1鼠胚胎成纤维细胞。
hES细胞用Thomson细胞培养液于37℃、5％二氧化碳培养箱内进行培养至细胞克隆增大，未分化的干细胞克隆在7-10 d左右被轻轻切割成6-8小块，转移到三个培养皿中再进行培养。
胚胎干细胞培养标准化操作规程(SOP)
一、细胞多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。
由Dr. Nagy的实验室制备。
2．D3-ATCC; CRL-1934. 我们得到时大约传了17代。
3．J1-由Dr. Jaenish的实验室友情提供。
我们得到时大约传了7－9代。
4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr. Jaenish的实验室友情提供。
5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr. Nagy的实验室提供。
二、一般培养——维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
培养基ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。
分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml该溶液，HS 和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。
贮存于4℃。
注：一瓶DMEM 是500ml。
贮存液DMEM(高糖)马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTESGRO复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。
胚胎干细胞培养操作规程
胚胎干细胞培养操作规程胚胎干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，具有无限的增殖能力和多能性分化潜能，对于组织再生和疾病治疗具有重要的应用价值。
为了进行胚胎干细胞的培养和扩增，下面给出一份胚胎干细胞培养操作规程。
1. 实验前准备：a. 清洗培养器具：用无菌水洗净培养皿、玻璃器皿和刷子。
b. 预热培养液：根据实验需要预热胚胎干细胞培养基和所需的其他培养液，以确保适宜的温度。
2. 细胞除菌：a. 必要时，用无菌棉签将细胞悬液接种到新的培养皿中。
b. 将枪头含有70％乙醇的吸管对准培养皿，喷洒乙醇并晾干。
c. 将培养皿放置在超净工作台内，进行进一步的消毒和清洁操作。
3. 细胞接种：a. 取出细胞悬液，并与培养基按照比例混合。
b. 将胚胎干细胞悬液均匀地接种到预先涂覆有明胶或者植物凝胶的培养皿上。
c. 确保培养皿中的细胞接种均匀且不过于密集，以便细胞能够自由生长。
4. 细胞培养：a. 将被接种的培养皿置于培养箱中，在37℃和5% CO2的条件下培养。
b. 每天检查和观察细胞的状态和生长情况，观察细胞的形态和数量。
c. 根据需要，定期更换新鲜的培养基。
5. 细胞分离：a. 当细胞达到足够密度时，可使用胰蛋白酶等酶来进行细胞的分离。
b. 向培养皿中加入足够的酶液，并将其均匀地涂抹在细胞上。
c. 在温度适宜的条件下，观察细胞的分离情况，并在适当的时间停止酶的作用。
6. 细胞传代：a. 轻轻将细胞悬液转移到新的培养皿中，避免细胞团的形成。
b. 加入新的培养基，使细胞能够继续生长和分化。
c. 定期观察和记录细胞的生长情况，监测细胞的纯度和分化状态。
7. 储存和保存：a. 使用液氮分装装置将细胞悬液分装到液氮管中。
b. 储存液氮管在液氮罐中，确保细胞的存活和完整性。
c. 定期检查和更新细胞的库存记录，确保细胞的有效使用和管理。
通过以上的操作规程，可以进行有效的胚胎干细胞的培养和扩增工作，为进一步的研究和应用奠定基础。
小鼠胚胎干细胞mES小鼠iPS培养Protocol
4.将冻存管内细胞悬液转移至含2 ml MEF完全培养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min，离心后将上清液吸除，另加入新鲜的MEF完全培养液1 ml，重悬后按照一个T25培养瓶铺1106的MEF细胞，平均加入到T25培养瓶中，轻轻摇匀后置于37℃细胞培养箱。24 h以后可以传入小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞。
冻存液配方：
小鼠胚胎干细胞完全培养液或小鼠iPS完全培养液60，ES级FBS30，DMSO 10
附：小鼠胚胎干细胞与MEF细胞分离的简易方法（差速贴壁法）：
1.培养中的小鼠胚胎干细胞，按传代的操作方法将细胞用胰酶消化并吹打成单细胞悬液后，加入适量的提前温育好的小鼠胚胎干细胞完全培养液重悬细胞，吹打混匀，细胞悬液分装到无MEF细胞的培养皿或培养瓶（一般地，一个T25培养瓶中培养的小鼠胚胎干细胞，在一个10cm培养皿中进行差速贴壁。不要事先铺明胶，如铺明胶则细胞贴壁速度过快无法有效分离小鼠胚胎干细胞与MEF细胞）中。
5.复苏或传代小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞前，将T25培养瓶中的MEF完全培养液吸除，加入2 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液轻轻冲洗一遍后吸除，加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液待用。
复苏：
1.将小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
6.每天更换小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液。
胚胎干细胞培养流程
胚胎干细胞培养流程
胚胎干细胞培养流程主要分为以下几个步骤：
1. 胚胎获取：从受精卵或早期胚胎中获取胚胎干细胞。
这一过程通常在体外受精（IVF）过程中进行，通过收集多余的受精卵或选择性将早期胚胎分离出来。
2. 胚胎培养：将获取的胚胎放置在含有营养物质和适当环境条件的培养皿中，以促进其细胞分裂和生长。
培养基通常包括必需的营养物质、生长因子和激素等。
通过优化培养条件，可以促进胚胎细胞的增殖。
3. 胚胎分离：在细胞分裂的早期阶段，胚胎细胞开始形成不同的细胞群，包括内胚层、外胚层和滋养层。
通过机械或酶法等方法，将这些不同细胞群分离开来。
其中，内胚层细胞具有胚胎干细胞的潜能。
4. 胚胎干细胞扩增：将分离得到的内胚层细胞培养在含有适当营养物质和生长因子的培养基中，促进其进一步增殖。
这个过程可以通过细胞培养技术，如经典的细胞培养方法或新兴的三维培养技术（如胶体微珠培养）来实现。
5. 胚胎干细胞鉴定：通过特定标记和检测方法，确认扩增的细胞群中是否存在胚胎干细胞。
常用的鉴定标志包括OCT4、SOX2和NANOG等胚胎干细胞特异性标记物。
6. 胚胎干细胞应用：胚胎干细胞可用于医学研究，如疾病机制研究、药物筛选和组织工程等领域。
此外，它们还
可以用于再生医学的临床应用，如组织修复和再生等。
需要注意的是，胚胎干细胞的研究和应用涉及伦理和法律等多个方面的问题，在进行相关研究和应用时应遵守相关规定和伦理原则。
小鼠esc培养方案
小鼠esc培养方案一、细胞来源与获取小鼠胚胎干细胞（ESC）可来源于受精后3.5\~5.5天的胚胎，这些胚胎可通过显微操作技术从囊胚中剥离。
剥离的胚胎干细胞需要在含有血清和饲养层细胞的培养基中进行培养。
二、培养基选择与配制培养基是小鼠胚胎干细胞（ESC）生长的必要条件，常用的培养基包括Glasgow MEM、Ham F12、ES Cell Medium等。
在配制培养基时，需要添加适量的血清（一般为胎牛血清）和抗生素等成分，以维持细胞的生长和繁殖。
三、饲养层细胞准备饲养层细胞可以为胚胎干细胞提供必要的生长因子和细胞因子，常用的饲养层细胞包括STO、STO-derived fibroblasts等。
在准备饲养层细胞时，需要将细胞接种在消毒后的培养皿或培养瓶中，待细胞生长至适宜密度后，再进行后续操作。
四、细胞接种与培养将剥离的胚胎干细胞接种在饲养层细胞上，通常情况下，接种密度为1\~5万个/cm²。
在培养过程中，需要保持适宜的温度和湿度，并定期更换培养基，以维持细胞的生长状态。
一般情况下，小鼠胚胎干细胞（ESC）会在接种后2\~3天开始贴壁生长。
五、细胞传代与扩增当小鼠胚胎干细胞（ESC）生长至适宜密度时，需要进行传代和扩增。
通常情况下，传代时的细胞密度为1\~2万个/cm²。
在传代过程中，需要将细胞从培养皿或培养瓶中吹散，并接种到新的培养皿或培养瓶中。
扩增过程需要定期更换培养基，并保持适宜的温度和湿度。
六、细胞冻存与复苏为了长期保存小鼠胚胎干细胞（ESC），需要进行细胞冻存。
将处于对数生长期的细胞进行离心和清洗后，加入适量的冷冻保护剂（一般为二甲基亚砜），然后放入液氮中进行保存。
在需要使用时，将冻存的细胞取出，进行复苏。
人胚胎干细胞培养手册
操作指南运输和保存：人胚胎干细胞（hESCs）和PMEFi被装在含90％FCS和10％二甲基亚砜的冻存管中，hESCs 4×105/管，可接种一个3.5cm培养皿（或六孔板的一个孔），PMEFi 4×106/管，可接种一块六孔板。
冻存管用干冰运输，收到后，hESCs投入液氮，PMEFi放入－80℃保存。
培养条件：温度：37±0.5℃CO2浓度：5.1±0.6％相对湿度：85-100%主要技术：1．细胞培养：当进行hESC培养时，总的培养原则必需遵守，所有的操作都应该在相应的细胞培养间和超净台内按无菌技术进行。
此外，通过安装空气处理和过滤设备减少空气颗粒制造一个相对洁净的空间。
当接触和细胞有关的一切试剂和材料时，应该带手套（包括开冰箱门）。
工作间在使用前后要用70％的异丙醇彻底消毒。
2．培养液和材料所有的培养液和试剂在使用前都要用0.2µm的滤膜过滤；培养瓶和TC材料在拿进培养间之前都应该用70％异丙醇消毒。
3．细胞处理为了便于操作，最好不要同时处理两个以上的标本。
操作时，在室温和低CO2的时间不要太长。
所有的细胞离心：室温，500－600g，5分钟。
培养液准备：MEF和hESCs培养液在无菌条件下进行，完成后用0.2µm的滤膜过滤。
当准备hESCs培养液时，保持一致性很重要。
如有可能，尽量使用相同的试剂。
使用满足于附录提供的血清替代品尤为重要。
生长因子应该最后添加，需要强调的是bFGF进行重悬时需要蛋白载体，在少量培养液中不要试图重悬它。
MEF培养液：hESCs培养液：冷冻培养液：90％FCS+10%二甲基亚砜, 0.2µm的滤膜过滤,4℃保存。
明胶准备：用超纯水配制0.1％明胶溶液，加热确保明胶完全溶解，使用前高压或0.2µm 的滤膜过滤。
明胶包被：接种细胞前，用0.1％明胶溶液包被培养皿，37℃至少30分钟，分别用1.5或4ml包被35mm或10cm培养皿。
胚胎干细胞中饲养层细胞的原代培养实验材料和步骤
胚胎干细胞中饲养层细胞的原代培养实验材料和步骤
实验材料
12.5d孕鼠、PBS、DMEM、血清、酒精、双抗、解剖器、培养箱、超净
台
实验步骤
1.性成熟小鼠合笼（♀∶♂=2∶1）
2.每天观察小鼠，见阴道栓后确定为怀孕0.5d。
3.取12.5d孕鼠，断颈处死，在酒精中泡数秒消毒。
控干酒精后置于一
个无菌的培养皿中。
4.无菌条件下暴露子宫。
每打开一层要换一套解剖器材（皮肤&腹膜）。
5.提起双角子宫，再用一套新的解剖器剪去多余的子宫膜，剥离出胚胎，PBS洗三次。
剪去胚胎头部、四肢和腹部以及发育的内脏，只留下
背部的中胚层（以成纤维细胞为主）。
6.将剩余胚胎尽量剪碎，小于1mm3，再用PBS洗三次，尽量弃去红细胞。
7.在组织块中加入血清（含双抗），然后转移到方瓶中。
8.在方瓶底部将大约25个组织块铺在瓶底，将方瓶倒置放入培养箱中，让组织块靠血清的作用粘附于瓶底，3h后，将方瓶正常放置，并加入D MEM培养。
9.3天后，观察结果。
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包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）
包被液的准备 多聚-L-鸟氨酸，15μg/ml 把75ml多聚-L-鸟氨酸和425ml 1×PBS混合。贮存在4℃。 纤维结合蛋白，1μg/ml 把0.5ml纤维结合蛋白和500ml 1×PBS混合。
包被过程： 1．加入多聚-L-鸟氨酸，至少2－3小时（过夜也行） 2．吸出多聚-L-鸟氨酸 3．加入纤维结合蛋白，大约1－2小时 4．吸出纤维结合蛋白，放置30分钟晾干 5．贮存在4℃ 24孔板用200μl，6孔板用500μl。震荡培养板确保溶液能够覆盖盖玻 片或培养孔。有时需要剧烈震荡培养板。
ITSFn and N3培养基贮存液的准备 使用无菌的溶剂和稀释液，在分装之前要对溶液进行过滤，如果因为某 些原因溶液在分装之前没有进行过滤，需要在管子上标明以便别人在使 用时知道该溶液不能直接用于细胞培养。 贮存液 溶剂，贮存液，稀释剂和储存 转铁蛋白50mg/ml 胰岛素5mg/ml 亚硒酸钠300μM 黄体酮（20μM） 腐胺（100μM） PEST（P104U/ml S104μg/ml） 层粘连蛋白（100μg/ml） 纤维连接蛋白（250μg/ml ） 碱性rhFGF, （10μg/ml）
移植 1．将胚状体转移至一15ml 圆锥形管中放置3～5分钟使胚状体沉降下 来。 细胞被离心3分钟会更好。放置使之沉降将会去除更多的单个细胞（包 括死细胞）而这些细胞可以被离心下来。 2．去除上清将胚状体重悬于无钙镁离子的1×PBS中 3．离心3分钟 4．去除上清加入1×胰酶（10cm的培养皿加1ml） 5．37℃水浴5分钟 6．加入5mlEB培养基小心吹打约10次 小心处理细胞很重要，进行细胞传代分散细胞时不可剧烈吹打。 7．离心2分钟 8．吸出上清将细胞重悬于500μl EB培养基 9．用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次 10．离心2次 11．吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基
附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2， 100％湿度条件下培养。
培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基-见下文）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存 在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养 基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。
一般培养--维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞 的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建 议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次， 细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预 先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘
胚胎干细胞培养标准化操作规程
目录
一、细胞
二、一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态 培养基 细胞复苏 冻存细胞 明胶包被 细胞传代
三、体外分化 培养基 包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片） 体外分化方法
四、移植细胞的准备
细胞
多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡 1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。由Dr. Nagy的实验室制 备。 2．D3-ATCC; CRL-1934. 我们得到时大约传了17代。 3．J1-由Dr. Jaenish的实验室友情提供。我们得到时大约传了7－9 代。 4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr. Jaenish的实验室友情提供。 5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr. Nagy的实验室提供。
冻存细胞
冻存液 90％HS和10％二甲基亚砜
步骤： 1．1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内； 2．用细胞刮刀收集细胞； 3．将细胞转入15ml Falcon管内并离心3分钟； 4．弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10cm的培养皿用2ml，15cm 的培养皿用6－7ml。） 5．分装于冻存管内，每管1ml； 6．置－80℃过夜，第二天移入液氮。
贮存液 DMEM(高糖) 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST ESGRO
复苏细胞 细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成 会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是 很重要的。
细胞传代 建议每2－3天传代细胞一次，过度生长的细胞会降低细胞的自然分化 率，我们建立了一种纯化方法来去除分化细胞，在将细胞接种在明胶包 被的培养板上之前，通过将分化细胞黏附在没有包被的组织培养板上去 除分化细胞。纯化步骤包含在下面的方法中。
1．去除培养液； 2．1×无钙镁PBS洗涤； 3．加入1×胰酶EDTA(10×胰酶EDTA用PBS稀释。)37℃孵育5分钟。 4．加入ES培养基使胰酶失活； 5．将细胞转入15ml离心管中离心3min； 6．去除上ห้องสมุดไป่ตู้，将细胞重悬于2mlES培养基，至少吹打10－20次。
第5步－N3培养基 通过撤除bFGF使神经前体细胞分化 1．细胞被接种在盖玻片上4天后将培养基换成不含bFGF的N3培养基 2．根据需要换液（大约每隔一天） 3．分化10～15天后固定细胞 移除培养基 PBS洗涤 加入4%福尔马林 室温放置30分钟 PBS洗涤2次 储存于PBS。长期储存使用含0.01％叠氮化纳的PBS 移植细胞的准备 细胞在胚状体形成4天以后被移植（相应于体外分化过程中的第2步末细 胞被转种到组织培养板）。正如在前文体外分化中所描述的在移植之前 4天开始形成胚状体。通常再需要一天时间以便将胚状体移植入一10cm 的培养皿。
明胶包被 准备500ml 0.1％明胶溶液 1．将0.5g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分 钟）。 2．最好在溶液没有冷却的情况下通过0.2μm滤膜过滤，贮存在4℃。 包被培养板或培养皿 1．加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15cm培养皿加2ml，10cm培养皿 加0.5～1ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行 了。）； 2．置室温30分钟； 3．去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平 方，以免明胶污染盖子和流出培养板。
ITSFn and N3： 配制一20×不含DMEM/F12的溶液。分装在15ml FALCON管中，（稀释为
1×，ITSFn 7.05ml，N3 12.55ml），0.2μm滤膜过滤，贮存在-20℃。 将该溶液加入DMEM/F12中制备培养基，贮存于4℃。 贮存液 DMEM(高糖) 转铁蛋白50mg/ml 胰岛素5mg/ml 亚硒酸钠300μM 黄体酮（20μM） 腐胺（100μM） PEST（P104U/ml S104μg/ml） 层粘连蛋白100μg/ml 纤维连接蛋白250μg/ml 碱性rhFGF, 10μg/ml *在第4步将bFGF加入N3培养基使终浓度为10ng/ml。
体外分化 多能胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。我们的体外分化 方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在 有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。细胞全程培养 在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。 时间线（总时间为27～34天） 第2步；4＋1天 第3步；4－10天 第4步；4天 第5步；10－15天 培养基 EB 配制一20×不含DMEM，FBS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于ES培养基-见前述）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存 在-20℃。将21ml该溶液和50ml FBS加入450mlDMEM中制备培养基， 0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。 贮存液 DMEM(高糖) 胎牛血清 L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST（P104U/mlS104μg/ml
第3步--ITSFn培养基 在最少量培养基中选择神经前体细胞 1．在胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基 2．并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时 要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
3．保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基--大约每隔 一天。 观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。当神经样细胞能够 被鉴别时，转入到第4步。步骤的转换应该在神经前体细胞出现第一个 清晰的标志几天以后，通常是在第3步的第6到第10天。
体外分化方法
第1步：ES培养基 在LIF（ESGRO）存在的条件下维持细胞培养
第2步：EB培养基 使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。 1．分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分） 2．纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50ml Falcon管中，计数细 胞取适量体积放入15ml管中离心3分钟。 3．用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液 4．一个15cm的细菌培养皿接种4～5×106个细胞（1个完全融合的组织 培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。 5．2天后更换培养基 将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。弃去上清，将细胞重 悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。 6．用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即 是细胞的移植步骤）。1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行 第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。 形成胚状体需要4天时间。在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织 培养皿的表面。这一天被认为是第2步和第3步的分界。