蛋白质纯化整理

名词解释
1. 截留分子量(molecular weight cut-off, MWCO)：不能通过膜的最小分子量
2. 超滤：选择合适孔径的超滤膜，在离心力或较高压力下，使水分子和其他小分子物质通过超滤膜，而目标蛋白样品分子被截留不能通过超滤膜，从而增加蛋白样品浓度，达到浓缩效果的方法
3、陶南效应：离子交换剂表面pH与溶液pH是不一致的。

在阳IE表面的微环境中，H＋被吸引而OH－被排斥，交换剂表面pH比周围低1个pH单位；而阴IE表面的微环境中，H＋被排斥，交换剂表面pH比周围高1个pH单位
4、离子交换剂的有效（实际）交换容量：指在一定的实验条件下，每克干介质或每毫升湿胶吸附蛋白质的实际容量
5. 聚沉（coagulation）是指在聚沉剂的作用下，溶液中的蛋白质相互聚集为较大聚沉物（＞1mm）的过程
• 常见的聚沉剂：无机盐类（如氯化锌、氯化铁、氯化铝、硫酸
锌、硫酸铝），聚合无机盐（聚合铝、聚合铁等）
• 聚沉条件：-20℃以下，pH3~6，较高离子强度，高多价金属离子（Fe3+、Al3+）
6. 絮凝（flocculation）是指在絮凝剂的作用下，通过吸附、交联、网捕，把蛋白质聚结为大絮体沉降的过程
• 常见的絮凝剂：淀粉、树脂、单宁、离子交换树脂及纤维素衍生
物
• 絮凝作用一般在聚沉作用之后使用；絮凝剂的选择应根据成本、
毒性等具体情况考虑；应通过试验筛选获得最适合的絮凝剂类
型、用量及作用条件
7、盐溶：蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随着盐浓度的增高而上升
8、盐析：但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出
9、透析：利用小分子能通过，而大分子不能透过半透膜的原理，把不同性质的物质彼此分开的一种方法。

对于蛋白质样品，透析过程中因蛋白质分子体积很大，不能透过半透膜，而溶液中的无机盐小分子则能透过半透膜进入水中，因此不断更换透析用水即可将蛋白质与无机盐小分子物质完全分开。

蛋白的分离纯化过程中常用此法脱去无机盐（如硫酸铵）
10、排阻极限：指不能进入凝胶颗粒内部网孔的最小蛋白的分子量
11、凝胶颗粒的分级范围：指能进入凝胶颗粒内部网孔的最大分子
和最小分子的分子量范围
12、过滤：利用多孔介质（滤纸、滤膜等）阻截大的颗粒物质，而使小于孔隙的物质通过的一种的分离方法。

主要用于悬浮液的分离，最简单、最常用
13、离子交换剂的电荷密度：指IE介质颗粒单位表面积的功能基团数量，它决定着离子交换剂的总交换容量
14、离子交换剂膨胀度（吸水值）：指干态的离子交换剂在水溶液中吸水后造成的体积膨胀程度。

用每克干离子交换剂吸水膨胀后的体积表示（ml/g）
15、梯度洗脱：进行梯度洗脱时，洗脱缓冲液的pH或离子强度是连续发生变化的，洗脱剂的洗脱能力也是连续增加的
16、阶段洗脱：指在一个时间段内用一固定pH或I的条件进行洗脱，而在下一个时间段内用另一固定pH或I的条件进行洗脱的分段式洗脱方式
也分为pH阶段洗脱和I阶段洗脱
17、亲和层析：利用蛋白质与其专一性配体之间的特异性生物学亲和力作用，对蛋白质进行分离纯化的层析技术。

18、等电聚焦电泳：利用不同蛋白质的等电点的不同而使其在pH梯度中相互分离的一种电泳技术。

等电聚焦过程中，蛋白质分子在一个连续而稳定的线性pH梯度中电泳，结果导致每种蛋白质分子迁移到等于其pI的pH处（此时蛋白质分子的净电荷为零），最终聚集形成一个很窄的蛋白区带。

19、双向电泳（2-dimension Electrophoresis，2-DE）是样品经第一向电泳后，再在垂直方向上进行第二向其他类型电泳的电泳方式。

目前的双向电泳一般是：第一向为等电聚焦（IEF），第二向为SDS-PAGE
20、蛋白质印迹（Western Blotting）是指把从电泳或层析分离得到的蛋白质转移到固定介质上后，再利用特异性“探针”（抗体）检测固定介质上的特定蛋白质的方法。

它能更有效地分析电泳结果
21、免疫电泳（immune electrophoresis）是基于抗原的电泳迁移以及抗原与抗体的特异性免疫沉淀反应而应用的一项电泳技术
22、毛细管电泳（CE）：是以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的一类新型液相分离技术
简答
1. 超滤法浓缩蛋白样品的基本原理？优点？局限性？
基本原理：选择合适孔径的超滤膜，在离心力或较高压力下，使水分子和其他小分子物质通过超滤膜，而目标蛋白样品分子被截留不能通过超滤膜，从而增加蛋白样品浓度，达到浓缩效果的方法
优点：超滤浓缩技术的优点是操作简便，不需添加任何化学试剂，实验条件温和，而且不引起温度、pH的变化，因而可以防止蛋白质分子的变性、失活。

在蛋白质分子的制备技术中，超滤除用于浓缩外，还可用于蛋白样品的脱盐和脱水
局限性：不能直接得到蛋白干粉制剂。

对于蛋白质溶液，一般最终只能浓缩到10~50％的浓度
2. 判断已知等电点的蛋白质，在不同PH值溶液中的带电性
3. 手动加样法的具体操作
填装好的凝胶柱经平衡后，用胶头滴管吸取柱床上层部分多余洗脱液，待洗脱液下降至近床表面2-3mm时，关闭柱出口（注意不能使洗脱液全部流干）；用胶头滴管吸取一定体积的样品液后，贴柱内壁旋转缓缓加入，以防加样过快导致凝胶床面表面受损；加样完毕后，打开柱出口，让样品液缓慢渗入凝胶床内；当样品液面恰与凝胶床表面持平时，贴内壁小心加入几毫升洗脱液冲洗内部，并使洗脱液高出凝胶床表面2-
3cm，即可进行恒流洗脱。

4. 手动装柱，如何检测装柱质量
a、对光检查。

对光肉眼观察装填平衡好的凝胶柱，柱内凝胶应均匀、无纹路、无气泡
b、可通过加样易于观测的有色物质进行洗脱（如蓝色葡聚糖-2000、血红蛋白等），来观察洗脱过程中中色带下降均匀与否，判断装柱质量。

如果色带歪曲弥散，则需重新装柱。

5、离子交换剂按功能基团类型不同可分为？
强阳离子交换剂（强酸型）弱阳离子交换剂（弱酸型）强阴离子交换剂（强碱型）弱阴离子交换剂（弱碱型）
6、疏水作用层析分离蛋白质混合物的基本原理？
疏水作用层析（HIC）是利用不同蛋白质分子表面疏水性的差别，来分离蛋白质混合物的一种层析技术
蛋白质分子表面常常暴露着一些疏水性基团，这些疏水性基团可以与疏水层析的固定相发生疏水性相互作用（疏水作用力）而结合
7、共价层析分离含半胱氨酸的蛋白或多态混合物的基本原理？
共价层析是利用固定相与目标蛋白分子之间共价键的先形成、后断裂过程来实现目标蛋白从混合样品中分离的层析方法。

要求在温和的条件下，既能与固定相形成稳定的共价键，又能在释放蛋白时不破坏蛋白的活性，蛋白质分子中通常只有巯基基团能满足这一要求
因此，共价层析主要用于分离和纯化含巯基（即含半胱氨酸）的蛋白质或多肽
8、离子交换层析分离效果用分辨率（RS）来描述，分辨率的定义？决定因素？
RS定义为两个洗脱峰峰顶对应的洗脱体积（VR或Ve）之差比上两峰在基线上峰宽之和的平均值。

一个IEC系统能够达到的RS取决于该系统的三个层析参数：容量因子、柱效率和选择性。

k′——　容量因子（保留因子）
N　——　柱效率（即理论塔板数）
α——　选择性
9、凝胶过滤层析特点？用途？
特点：
（1）介质不带电荷，不溶于水，亲水性好，具化学惰性，不与被分离蛋白发生化学反应，分离条件温和，不会使蛋白变性失
活
（2）分离效率高，回收率较高
（3）广泛应用于蛋白质混合物的分离纯化，脱盐等
（4）一般采用细长柱
（5）经过凝胶过滤层析分离后样品将被稀释，因此上样前需对样品进行浓缩
用途：
（1）蛋白质样品的脱盐及缓冲液更换
蛋白质与盐的分子量差异较大，选用交联度高的介质（如Sephadex G-25），使蛋白质不能进入凝胶颗粒内部网孔，先流出层析柱，而盐分子能进入，后流出层析柱
层析过程的洗脱中可使用需更换的缓冲液，从而在脱盐的同时达到将样品的缓冲液也进行更换的目的
（2）蛋白质的分级分离
应用不同蛋白分子量的差异进行分离，凝胶介质和蛋白质之间不发生任何作用，所以层析过程能不改变蛋白的生物学活性。

凝胶过滤层析通常用在离子交换层析或亲和层析之后，用以进一步分离纯化目的蛋白
（3）蛋白质分子量的测定
10、描述聚丙烯酰胺的电泳（PAGE）中考马斯亮蓝染色法以及银染法原理？
考马斯亮蓝染色法原理：在酸性条件下，蛋白质与考马斯亮兰R-250结合形成蓝色复合物（595nm处最大吸收峰），蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比关系
银染法原理：银染时蛋白条带上的AgNO3被还原成金属Ag，沉积在蛋白条带上而显色
显色方法分为化学显色和光显色
11、常规PAGE和SDS-PAGE使用试剂最主要的差别是？
后者加入去垢剂SDS烷基硫酸钠和强还原剂β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）
12、SDS-PAGE分离蛋白质混合物的原理？
去垢剂SDS十二烷基硫酸钠， CH3(CH2)11OSO3Na，破坏蛋白质分子的氢键和疏水键，并与之结合形成SDS-蛋白质复合物；强还原剂β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT），破坏蛋白分子二硫键
结果导致：SDS-蛋白复合物带上大量负电荷，且不同蛋白质有着相同的荷质比（SDS与多数蛋白质的结合比为1.4g SDS/1g 蛋白质）蛋白分子变成椭圆棒状，不同的蛋白分子无形状差别，棒的长度与其分子量成正比
因此，对于SDS-PAGE，蛋白质的迁移率仅与分子量有关。

电泳过程中蛋白质天然构象被破坏，生物学活性丧失
问答题
1、蛋白质的沉淀法：优点？局限性？常用的沉淀法有哪几种？
优点：
所需设备简单，操作方便，在蛋白质纯化的初期，可以加速减少样品体积，起到浓缩的作用，便于后续的纯化降低纯化成本；还可以尽快将目的蛋白与杂质分开提高目的蛋白的稳定性；通过该方法，目的蛋白的回收率
局限性：
由于沉淀法对提高蛋白质纯度的幅度比较有限，该法常只用于蛋白质的初步纯化
常用方法：
有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、聚乙二醇沉淀法
选择沉淀方法时，需要考虑沉淀剂对目的蛋白质的蛋白质稳定性的影响，沉淀剂的成本及操作的难易程度、沉淀剂的去除及残留、目的蛋白的纯度要求及收率。

2、蛋白质样品的浓缩方法？基本原理分别是？
• 沉淀：
蛋白质在水中的溶解度受蛋白质分子表面疏水性和亲水性带电基团分布的影响，这些基团与水溶液的离子相互作用，通过改变pH和离子强度，加入有机溶剂或多聚物，可以促进蛋白质分子聚集，形成蛋白质沉淀，通过离心或过滤可以获得沉淀物，然后利用合适的缓冲液清洗，溶解沉淀物，在经过透析或凝胶过滤，除去残留溶剂成分
• 吸附：
吸收水和小分子，当凝胶完全膨胀后，用过滤或离心方法除去凝胶，分离出蛋白质样品，适用于稳定性较差的蛋白质。

• 超过滤：
在离心力和较高压力下，选择适应孔径的半透膜，从而使水和其他小分子透过半透膜，而所需的蛋白质不能透过膜。

• 双水相分离法：
利用两种多聚物或多聚物与盐在水中的不相容性，可以从细胞破碎后的细胞碎片中直接分离纯化蛋白质，同时起到浓缩作用。

• 透析：
把盛抽提液的透析袋（由半透膜制成）埋在吸水力强的聚乙二醇或甘油中，袋内的水分等小分子物质可透过半透膜逐渐移至袋外，有效成分则留在袋内。

• 冷冻干燥：
在真空状态下，置于冻干机的冰冻抽提液可以由固体直接变为气体。

用此原理进行浓缩，有效成分几乎不被破坏。

3、良好的凝胶过滤介质应满足？要求；常用介质？（英文名）
（1）葡聚糖凝胶Sephadex G-数字
（数字越小，表示介质交联度越大，分级范围越小）
（2）琼脂糖凝胶
①Sepharose（2B, 4B, 6B）
②Sepharose CL（2B, 4B, 6B）
③Superose（6, 12）
（数字表示琼脂糖含量，数字越大，琼脂糖含量越大，分级范围越
小）
（3）复合结构凝胶
①Sephacryl HR（S-数字 HR）
②Superdex（peptide, 30, 75, 200）
（数字越小，表示介质交联度越大，分级范围越小）
4、影响蛋白质电泳速度的内在因素、外在因素有？常用的电泳技术？常规PAGE有哪三大分离效应？
内在因素：蛋白质分子所带电荷的电性和电量：电性决定电泳方向；电量越大，迁移速度越快。

蛋白质分子的大小和形状：分子质量越小、形状越接近球形，在电场中迁移速度越快
外在因素：溶液pH（决定蛋白质所带电荷的电性和电量）、溶液的离子强度（越低，迁移越快；一般应在0.01~0.2 mol/L之间）、电场强度、电渗现象、电泳支持介质、温度
常用电泳技术
①常规聚丙烯酰胺凝胶电泳（常规PAGE）
②十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
③等电聚焦（isoelectrofocusing，IEF）
④双向电泳（2-D electrophoresis，2-DE）
⑤转移电泳（westerning blotting，Wb）
⑥免疫电泳（immunoelectrophoresis，IE）
⑦毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）
常规PAGE的三大分离效应
①浓缩效应：蛋白质样品在浓缩胶中被高度浓缩，最终集聚成一条狭窄的高浓度蛋白质区
②电荷效应：不同蛋白质所带电荷的数量不同，因此迁移率不相同
③分子筛效应：凝胶对不同分子量的蛋白分子具有的筛分效应。

分子质量越小，迁移率越大
5、双向电泳定义？相对其他电泳的优势？用途？
双向电泳（2-dimension Electrophoresis，2-DE）是样品经第一向电泳后，再在垂直方向上进行第二向其他类型电泳的电泳方式。

目前的双向电泳一般是：第一向为等电聚焦（IEF），第二向为SDS-PAGE
优势：2-DE使得分离分辨率大大提高，获得的信息也明显增多，是目前电泳技术中分辨率最高、信息获得最多的技术，常用于分析复杂样品及绘制蛋白质组图谱，是蛋白质组学研究的核心技术
用途：利用双向电泳技术不仅能了解样品中各蛋白的等电点、分子量、
丰度等信息，更重要的是还可利用比较双向电泳的方法用于了解样品中各蛋白的动态变化情况。

进一步，还可利用质谱技术结合数据库检索对感兴趣的蛋白点进行种类鉴定，因此目前是蛋白质组学研究中的核心技术
6、离子交换层析，如何根据目标蛋白与杂蛋白的pI确定起始条件？离子交换层析分离蛋白质的大致过程？
起始条件：
(1) 起始pH
依据：目标蛋白的pI及其稳定的pH范围
①已了解目标蛋白和主要杂蛋白的pI
举例：目标蛋白pI=7.0，杂蛋白pI=8.2；那么，起始pH=8.0~8.5比较合适，由此确定选择阴离子交换剂
②只了解目标蛋白的pI和pH稳定性范围
举例：目标蛋白pI=4.0，在pH=3.6~8.0范围内保持稳定，那么应当选择起始pH=5.0~6.0，故应选择阴离子交换剂；
举例：目标蛋白pI=8.0，在pH=5.5~8.5范围内保持稳定，那么应当选择起始pH=6.0~7.0，故应选择阳离子交换剂
③对目标蛋白和主要杂蛋白的pI、pH稳定性范围一无所知
鉴于大多数天然的蛋白质pI＜7，可以优先考虑选用阴离子交换剂，起始pH可通过试管小样法确定
(2) 缓冲物质的选择
进行阳IEC时，应选用缓冲离子为阴离子的缓冲物质；进行阴IEC时，应选用缓冲离子为阳离子的缓冲物质
如果已确定起始pH，应根据缓冲物质的pKa值，选用pKa与起始pH很接近的物质作为缓冲成分。

例如：确定起始pH为8.0，则应选择Tris碱作为缓冲物质（pKa＝8.06）
(3) 起始缓冲液浓度(离子强度)的选择
为保证目的蛋白能吸附于IE，起始缓冲液的离子浓度一般比较低，多介于0.01~0.05mol/L；
洗脱缓冲液的离子浓度应逐渐升高；实际操作中往往通过向起始缓冲液中添加中性盐提高盐浓度（添加NaCl、乙酸铵）的方法制备获得
大致过程：
①平衡阶段：此时离子交换剂与平衡离子结合
②上样、吸附阶段：混合蛋白质分子与离子交换剂发生吸附结合
③开始解吸阶段：由于杂蛋白与离子交换剂之间结合较弱而先被洗脱，目标蛋白仍处于吸附状态
④完全解吸阶段：目标蛋白被洗脱
⑤再生阶段：用起始缓冲液重新平衡层析柱，以方便下次使用
7、举例5种离子交换剂？各自的特点？
（1）离子交换树脂
树脂是通过化学方法合成的具有特殊网状结构的不溶性高分子化合物。

通过化学方法往树脂骨架上引入功能基团就得到离子交换树脂。

常见的有：聚苯乙烯树脂、聚异丁烯酸树脂、聚丙烯酸树脂等
缺点：骨架疏水、介质孔径太小、电荷密度太大，通常不用于蛋白质的层析分离
（2）离子交换纤维素
纤维素分子是由葡萄糖通过β(1→4)糖苷键连接形成的大分子。

离子交换纤维素是以纤维素凝胶为介质，连接功能基团形成
离子交换纤维素存在着纤维状和微粒状两种不同的物理形态，前者是将纤维素直接连接功能基团，后者是除去了大部分非晶型区域后再连接功能基团
离子交换纤维素优点：亲水性强、表面积大、孔径大、对蛋白质分子的交换容量大
DEAE-纤维素和CM-纤维素是进行离子交换层析时最常使用的离子交换剂类型
（3）离子交换葡聚糖
以葡聚糖凝胶为介质，连接功能基团形成
优点：亲水性强，大孔结构，交换容量大，同时具有离子交换作用和分子筛效应
（4）离子交换琼脂糖
是以琼脂糖凝胶作为介质，连上功能基团形成的离子交换剂
琼脂糖（agarose）是由β-D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖两种单糖，通过β(1→4)和α(1→3)糖苷键交替连接而形成的中性链状多糖分子
优点：亲水性强、孔径大、对106 Da以内的蛋白质有很好的交换容量；结构牢固、膨胀度随I和pH的变化改变很小
（5）高效离子交换剂
特点：粒度小，硬度高，分辨率高，交换容量相对较小，操作压力较高，成本较高，大多制成预装柱形式出售
填空题
1.亲和吸附剂是由介质、（连接臂）、配体组成的。

它的配体能与待分离的蛋白质可逆结合，连接
臂的作用是消除因介质表面的邻近效应而导致的配体与蛋白质的结合阻力
2.蛋白质电泳的分类。

按分离原理的不同：
①移界电泳。

在自由溶液中迁移，引起界面移动。

最早，已被取代
②区带电泳。

在介质中迁移，分离成独立区带。

目前最常用
③稳态电泳。

迁移到一定时间后达到稳态。

如等电聚焦电泳
按有无固体支持物
1 自由电泳。

无支持物，如移界电泳、某些等速
电泳、柱电泳
2 支持物电泳。

有支持物，如聚丙烯酰胺凝胶电
泳、琼脂糖凝胶电泳、等电聚焦电泳等
3.聚丙烯酰胺凝胶是一种以丙烯酰胺单体为材料，甲叉双丙烯酰胺为交联剂，在催化剂作用下，把丙烯酰胺单体聚合成三维网孔结构的高分子聚合物
4.常规PAGE
原料：丙烯酰胺（Acr）。

交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）
化学催化聚合法
催化剂：过硫酸铵（AP）
加速剂：N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)。