植物叶绿素类胡萝卜素测定方法
植物叶绿素类胡萝卜素测定方法
叶绿素、类胡萝卜素含量的测定一、原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收,利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度,即可用公式计算出提取液中各色素的含量;根据朗伯—比尔定律,某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C 和液层厚度L成正比,即A＝αCL式中：α比例常数;当溶液浓度以百分浓度为单位,液层厚度为1cm 时,α为该物质的吸光系数;各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得;如果溶液中有数种吸光物质,则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和;这就是吸光度的加和性;今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量,只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A,并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度;在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰,所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰;二、材料、仪器设备及试剂一材料：新鲜或烘干的植物叶片;二仪器设备：1分光光度计；2电子顶载天平感量；3研钵；4棕色容量瓶； 5小漏斗；6定量滤纸；7吸水纸； 8擦境纸；9滴管;三试剂：195%乙醇或80%丙酮v丙酮：v乙醇=2：1的95%水溶液；2石英砂；3碳酸钙粉; 暗中2h,,25ml三、实验步骤1取新鲜植物叶片或其它绿色组织或干材料,擦净组织表面污物,剪碎去掉中脉,混匀;2将取好的样品放入25ml容量瓶中,加混合浸提液无水乙醇:丙酮=5:520ml,放在黑暗条件下,浸泡至叶片发白,用浸提试剂定容至25ml,摇匀备用;3把叶绿体色素提取液倒入1cm光径的比色皿内,以浸提试剂为空白测定吸光度;选择波长663 646 和470nm;四、实验结果计算叶绿素a 的浓度 = OD 633 – OD 646叶绿素b 的浓度 = OD 646– OD 663类胡萝卜素浓度=÷229 单位 mg/L Cmg/L 提取液总量ml叶绿体色素含量mg/g= ____________________________ 烟叶重量g1000注意事项：操作避光研磨时间短些。
叶绿体色素的提取与分离、理化性质及含量测定 3
叶绿体色素提取分离与理化性质及含量测定▪（一）实验目的及意义▪（二）实验原理▪（三）实验步骤▪（四）实验报告实验目的和意义▪绿色植物的光合作用是在叶绿体中的叶绿体色素中进行的，了解叶绿体色素的组成、性质及测定对于理解光合作用的本质很有帮助。
▪因此，测定叶绿素含量便成为研究光合作用与氮代谢必不可少的手段，在作物育种、科学施肥、看叶诊断中有着广泛的应用叶绿体在细胞中运动视频叶绿体在细胞中的分布与结构类囊体膜的结构及功能实验原理植物叶绿体色素是吸收太阳光能，进行光合作用的重要物质。
它一般由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。
这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。
实验原理▪色素分离的方法有多种，纸层析是最简便的一种。
当溶剂（有机推动剂）不断从纸上流过时，由于混合物（叶绿素提取液）中各种成分在固定相（滤纸纤维素所吸附的水分）和流动相（有机推动剂）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。
▪叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。
实验原理▪叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。
叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。
叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。
▪叶绿素中的镁可以被氢离子所取代而成褐色的去镁叶绿素。
去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。
实验步骤(1)▪根据朗伯一比尔定律，某有色溶液的吸光度D与其中溶液浓度C和液层厚度L成正比，即：▪D＝KCL▪D：吸光度，即吸收光的量，C：溶液浓度, K：为比吸收系数（吸光系数），L：液层厚度，通常为1cm.▪如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。
植物生理学实验-叶绿体色素的定量测定
植物生理学实验
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2、测定光密度
以96%乙醇为空白，比色测定3份样品的光密度；
波长665nm、649nm和470nm
B126室：分光光度计 型号：22PC
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分光光度计的使用：？
功能键
显示屏
样品室
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波长调节旋钮
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测定溶液加到 比色杯的2/3初
空白对准光路
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植物生理学实验
叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光 谱有差异。在使用不同溶剂提取色素时， 计算公式有所不同。
本实验以 96％乙醇为例。
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96％乙醇提取
已知叶绿素a、b的96%乙醇提取液在红光 区的最大吸收峰：a＝665nm；b＝649nm
根据有色物质的加和性，建立方程组： D665=Kaλ665 Ca+ Kbλ665 Cb D649=Kaλ649 Ca+ Kbλ649 Cb
Ka645＝ 16.75 Kb645＝ 45.60
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植物生理学实验
根据加和性原则列出以下关系式： D663 = 82.04Ca+9.27Cb D645 = 16.75Ca+45.60Cb
解方程组得：
Ca (mg/L)= 12.72D663 – 2.59D645 Cb (mg/L)= 22.88D645 – 4.67D663 Ca与Cb相加即得叶绿素总量（CT）： CT (mg/L)= Ca + C整b理课=件20.29D645 + 8.05D663
Enter 输入键，接受当前的状 态或进行测定；
Mode 功能键，按该键显示不 同的功能菜单；
2、测定
实验三十四植物叶绿体色素的提取、分离、表征及含量测定
实验三十四植物叶绿体色素的提取、分离、表征及含量测定摘自王尊本主编,综合化学实验(第二版),第226-244页,北京:科学出版社,2007年9月。
实验三十四植物叶绿体色素的提取、分离、表征及含量测定[1-27]一、叶绿体色素的提取(一) 实验目的1)掌握有机溶剂提取叶绿体色素等天然化合物的原理和实验方法。
2)了解皂化-萃取提取胡萝卜素的原理。
3)了解1,4-二氧六环沉淀法提取叶绿素的原理。
(二) 实验原理植物光合作用是自然界最重要的现象,它是人类所利用能量的主要来源。
在把光能转化为化学能的光合作用过程中,叶绿体色素起着重要的作用。
高等植物体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类,主要包括叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素四种。
它们所呈现的颜色和在叶绿体中含量大约比例见表34.1。
表34.1 高等植物体内叶绿体色素的种类、颜色及含量项目叶绿素类胡萝卜素叶绿素a 叶绿素b 胡萝卜素叶黄素颜色蓝绿色黄绿色橙黄色黄色在叶绿体内各色素含量比例 3 1 2 13 1 叶绿素chlorophylls是叶绿酸的酯,它在植物进行光合作用中吸收可见光,并将光能转变为化学能。
叶绿素是植物进行光合作用所必需的催化剂。
在绿色植物中叶绿素主要以叶绿素a(C55H72O5N4Mg)和叶绿素b(C55H70O6N4Mg)两种结构相似的形式存在,其差别仅是叶绿素a中一个甲基被叶绿素b中的甲酰基所取代。
叶绿素的基本结构见图34.1。
在叶绿素分子结构中含有四个吡咯环,它们由四个甲烯基联结成卟啉环,在卟啉环中央有一个镁原子,它以两个共价键和两个配位键与4个吡咯环的氮原子结合成内配盐,形成镁卟啉。
在叶绿素分子中还有两个羧基,其中一个与甲醇酯化成COOCH3,另一个与叶绿醇酯化成COOC20H39长链。
类胡萝卜素carotenoids是一类不饱和的四萜类碳氢化合物(例如胡萝卜素,carotenes,或它们的氧化衍生物(例如叶黄素类,xanthophylls。
植物体叶绿素含量的测定实验报告
实验报告植物体叶绿素含量的测定摘要：本实验采用分光光度法，利用95%乙醇提取菠菜叶片中和番茄叶片中叶绿体色素，叶绿素a ，叶绿素b 和类胡萝卜素最大吸收峰的波长分别是665nm 、649nm 和470nm 。
根据分光光度计测定的吸光度值，从而计算出乙醇提取液中叶绿体色素含量。
实验原理：利用95%乙醇提取叶绿体色素，叶绿素a ，叶绿素b 和类胡萝卜素最大吸收峰的波长分别是665nm 、649nm 和470nm 。
根据分光光度计测定的吸光度值，可以计算出乙醇提取液中叶绿体色素含量。
实验目的：掌握分光光度计法对叶绿素a 、叶绿素b 、叶绿素总浓度和类胡萝卜素总浓度测定和计算的方法。
实验材料：生物材料：菠菜叶片0.25g ，自己培养的全素番茄苗叶片0.2g ，缺磷番茄苗叶片0.2g ；试剂：95%乙醇、石英砂、碳酸钙；仪器：分光光度计、电子天平、研钵、漏斗、玻璃棒、小烧杯、10ml量筒、50ml 容量瓶、剪刀、滤纸、滴管。
实验步骤：1.叶绿体色素的提取取新鲜菠菜叶片0.25g ，擦干，去中脉，剪碎放入研钵，加入少许石英砂和CaCO 3，再加入95%乙醇3ml,研磨成匀浆，再加95%乙醇10ml ，静置10min ，用漏斗滤去残渣，用乙醇反复冲洗研钵、残渣至无色；用容量瓶定容至50ml 。
2.吸光度的测定取光径1cm 比色杯，注入上述叶绿素提取液，以95%乙醇注入另一同样的比色杯内作为空白对照，在波长665、649、和470nm 下测定吸光度。
3.结果计算依据下列计算公式，分别计算出叶绿素a 、B 的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的浓度。
C a （叶绿素a ）=13.95A 665 – 6.8A 649C b （叶绿素b ）=24.96A 649 – 7.32A 665C T （叶绿素）=C a +C b =18.16A 649 + 6.63A 665C x.c （类胡萝卜素）=(1000A 470 – 2.05C a -114.8C b )/248叶绿体色素含量 = ）样品鲜重（稀释倍数）提取液体积（）色素浓度（g /mg ⨯⨯L L实验结果：菠菜叶片提取液吸光值：1、测定叶绿素ab为什么选用红光波长？叶绿素吸收红光和蓝紫光，故有两个吸收峰，光合色素还有类胡萝卜素，只吸收蓝紫光，所以不能选蓝紫光区测定，否则被类胡萝卜素干扰，只能用红光。
叶绿体色素定量测定及性质实验报告-叶绿素的定量测定
.取两支试管，向一支试管中加入 5mL 叶绿体色素提取液，然后将其 存在的问题，改进栽培方式，提高产量，这对于农业生产有很大的现实意
一部分倒入另一支试管中，作为对比。向试管里加入 1~2 滴 0.5mol/L HCl 义；在水体治理中，通过测定叶绿素含量，了解水中植物的光合能力，借
后摇匀。
此查找治理方案。总之，测定植物叶片叶绿素含量对于我们生产实践具有
光物质〔稀溶液〕时，其吸光值与吸光物质的浓度 C 及汲取层厚度 d 成正
式中，C、Cb 和 Cx·c 分别为叶绿素、b 和类胡萝卜素的浓度。
比，及=KCd。
2、叶绿素理化性质鉴定
假如溶液中含有数种吸光物质，则混合液在某一波长下的总吸光值等
叶绿素是一种双羧酸，其中一个羧基被甲醇所酯化，另一个被叶醇所
于各组分在此波长下吸光值的总和。如欲测定叶绿素混合提取液中叶绿素、 酯化。故可与碱起皂化反应而生成醇〔甲醇和叶绿醇〕和叶绿素的盐。皂
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叶绿体色素定量测定及性质实验报告:叶绿素的定量 测定
应选择叶绿素在红光区的最大汲取峰。 已知叶绿素、b 分别 663nm 和 645nm〔80％丙酮提取〕有最大汲取值；
同时已知在波长 663nm 下，叶绿素、b 汲取系数分别为 82.04 和 9.27；在
4、在分管光度计上，分别测定 663nm，645nm 和 470nm 处的吸光值，
夹，酒精灯。
以 80％丙酮为空白对比。
2、试验试剂：80％丙酮，纯丙酮，碳酸钙，20％KOH 甲醇溶液，苯，
5、结果计算
0.5molmol/L?HCl，醋酸铜粉末。
按原理中的公式分别计算叶绿素、b 和类胡萝卜素的浓度〔mg/L〕，
叶绿素测定分光光度法
叶绿体色素含量的测定——分光光度法叶绿体色素含量的测定——分光光度法叶绿体色素溶液各组成成分在可见光谱中具有不同的特征吸收峰。
因此，应用分光光度计在某一特定波长下所测定的吸光度，根据经验公式即可计算出色素溶液中各色素浓度，不同溶剂所提取的色素吸收光谱有差异，因此，应使用不同的计算公式。
叶绿体色素的提取常用丙酮和乙醇有机溶剂。
叶绿体色素80 ％丙酮提取液中叶绿素a 和 b 及类胡萝卜素分别在663nm 、646nm 和470nm 波长下有最大吸收峰，而95 ％乙醇提取液中它们则在665nm 石49nm 和470nm 波长下具有最大吸收峰，据此所测得的吸光度值代人不同的经验公式（见结果计算），计算出叶绿体色素丙酮（或乙醇）提取液中叶绿素 a 和 b 的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的总浓度，并依据所使用的单位植物组织（鲜重、干重或面积），求算出色素的含量。
[ 实验目的]掌握分光光度法对植物叶绿体色素提取液中叶绿素 a 和 b 的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的总浓度测定与计算方法，以及植物材料中各种色素含量的求算方法。
[ 器材和试剂]1 ．植物材料新鲜（或烘干）植物叶片，如菠菜叶片等。
2 ．实验器材分光光度计、天平、研钵、剪刀、漏斗、滤纸、棕色容量瓶、吸水纸、擦镜纸和滴管。
3 ．实验试剂80 ％丙酮（或95 ％乙醇）、石英砂和碳酸钙粉。
[ 操作步骤］1 ．色素的提取①称取新鲜（或干材料）的洗净擦于的植物叶片0.5g （或一定面积），去中脉、剪碎后放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2~3ml80 ％丙酮（或95 ％乙醇），冰浴中研磨至组织变白，再加丙酮10ml ，研成匀浆，暗处静置约10m in 。
②将提取液过滤到50 ml 棕色容量瓶中，用丙酮反复冲洗研体与研棒数次并用少量丙酮反复冲洗滤纸和残渣，直至无绿色为止，以使色素全部转移入容量瓶。
最后用丙酮定容至50 ml ，摇匀，并保存于暗处备用待测。
生理指标的测定2
1 色素含量的测定（叶绿素、类胡萝卜素）采用95%乙醇浸泡法（李合生，2000），称取剪碎的新鲜样品0.1g放入试管中，取95%乙醇15ml，在黑暗条件下浸泡24h，期间摇晃2-3次，至叶片表面变白，取上清液，在波长665nm、649nm、470nm下测定吸光度。
计算公式：叶绿素a（mg/L）=13.95*OD665－6.88*OD649叶绿素b（mg/L）=24.96*OD649－7.32*OD665总叶绿素=（6.63* OD665+18.08* OD649）*15/100类胡萝卜素（mg/L）=（1000OD470－2.05C a－114.8C b）/245色素含量（mg/g）=（色素浓度×提取液体积×稀释倍数）/样品鲜重2 细胞膜透性的测定取新鲜样品1g放入试管中，取25ml蒸馏水，浸泡1h，测得此时电导率值a，再至于沸水浴中处理15min，冷却至室温，测得电导率值b，细胞膜透性=a/b。
注意：煮后一定要冷却到室温才测，可以用冰，煮过后值大致相同。
3 组织含水量的测定4 类黄酮及总酚含量的测定取1g样品（一般用粉末），加入1%的盐酸甲醇溶液（量取27ml分析纯盐酸用分析纯甲醇定容到1000ml）25ml，浸提2h，过滤到50ml容量瓶中，用盐酸甲醇溶液定容到刻度，在325nm和280nm进行比色，分别测定类黄酮和总酚的含量。
4.1.4.8多酚氧化酶(PPO)的测定方法粗酶液的制备:称取西兰花花蕾部分1.0g，加入磷酸缓冲液印pH6.8,0.05m。
比,含l%聚乙烯毗咯烷酮)20mL,冰浴匀浆,离心Zomin(r0000Xg,4oC),上清液即为粗酶液。
酶活性测定:磷酸缓冲液印H6.8,0.05m川几)1.5mL,加入0.1mo比儿茶酚底物2.0mL,35℃保温巧min;再加入0.5mL酶液后迅速混匀,每隔105记录吸光度值灿2。
的变化,共记录3min,试验重复3次。
酶活性以U德.min表示,以翰。
烟叶中叶绿素和类胡萝卜素的测定
存在特点和测定意义一 、叶绿素种类：比例种类颜色丙酮溶液中长波吸收峰叶绿素a蓝绿色663nm3黄绿色645nm1叶绿素b二、类胡萝卜素种类： 类胡萝卜素包括：胡萝卜素和叶黄素，二者之比是2：1。
（ß-胡萝卜素的乙醚溶液在451处有吸收峰）三、测定意义： 1、高水分，叶绿素含量高，愈近成熟，叶绿素降低。
2、低生物碱品系，叶绿素含量高，不易烤 高生物碱品系，叶绿素含量低，易烤 3、叶绿素含量影响烟叶成熟落黄河烘烤特性叶绿素和类胡萝卜素测定一、叶绿素测定 1、原理：用有机溶剂将叶绿素提取出来，制成待测液，根据提取液对某一波长的光有选择吸收，吸光度符合朗莫-比尔定律，计算出待测液中叶绿素含量： E＝lgI0/I＝KCL 如果比色皿厚度一定，则上式简化为： E＝KC K：吸光系数 C：浓度 如果待测液中含有2种以上有色物质，其吸光度也符合朗莫-比尔定律 溶液中含有2种有色物质时，有下式成立： Eλ1=Ka1 Ca+Kb1 Cb (1) Eλ2=Ka2 Ca+Kb2 Cb (2) 在叶绿素的待测液中含叶绿素a和b ，则有： E663＝82.04Ca＋9.27Cb (1)E645＝16.75Ca＋45.6Cb (2) E663＝82.04Ca＋9.27Cb (1)E645＝16.75Ca＋45.6Cb (2) 解联立方程式（1）和（2）得到： Ca=0.0127 E663-0.00259 E645 Cb=0.0229 E645-0.00467 E663 Ca+b=0.00805E663+0.0203E6452、测定步骤 ①待测液制备：0.5-2g样品于乳钵（研钵）内，加4倍体积的丙酮和约10mL 80%的丙酮，乳棒研磨。
用吸管仔细吸取抽出液转移到50mL容量瓶内，重向乳钵内加入10mL 80%的丙酮，继续研磨，合并抽出液，如此反复，直至研磨看不出有色素浸出为止，最后用80%丙酮定容到50mL，充分混匀，放冷暗处，使瓶内溶液澄清。
丙酮和二甲基亚砜法测定植物叶绿素和类胡萝卜素的方法学比较
Abstract Chlorophyll and carotenoids m easurement by dim ethyl sulfoxide (DM SO ) and acetone extractions are two typ ical and popular methods used in p lant ecophysiological research. However, few studies on the compara2 bility between these two methods have been carried out. To answer this question, the contents of p igments in leaves and young branches of 19 woody species were measured in this study and we found the follow ing conclu2 sions. Firstly, chlorophyll a (Chla) , Chlb and total chlorophyll contents measured by the DM SO method were much higher than those measured by the acetone m ethod, however, the result of Chla / b ratio was slightly affect2 ed. Contrarily, carotenoids contents m easured by the acetone method were m uch higher than those m easured by DM SO m ethod. D irect comparison of these data w ill make serious bias; Secondly, both chlorophyll data and ca2 rotenoids data measured by these two methods were significantly linearly correlated. Thus, it is possible to use these linear relations to make data correction in comparative studies; Thirdly, unit differences also affect the data correlations of these two methods. W hen using the unit of fresh mass, the correlation was much higher than that unit of surface area; Fourthly, the influences of these two methods on the data p recision differed between leaves and branches. In the case of branches ( low chlorophylls) , two m ethods give slightly difference. However, the
实验七叶绿素ab含量的测定及植物光合强度的测定
3. 溶解 应在烧杯中溶解，不能在容量瓶中溶解。
思考：若量取的是浓硫酸需要稀释，应如何操作才 是正确的？
4. 转移 由于容量瓶瓶颈较细，为避免液体洒在外面，应用玻璃棒引流。
提问：将烧杯中的氯化钠溶液转移到容量瓶中，此时溶质是否完 全被转移到容量瓶中？应如何处理？
CT=Ca+Cb=20.2A645+8.02A663 (mg / L)
叶绿素a、b含量：
C×提取液体积（20ml）×稀释倍数（10） (mg / g)
样品的重量（1g）
二、 植物光合强度的测定
光能
CO2+ H2O 叶绿体 (CH2O)+O2
测定干物质的积累 测定CO2的吸收 测定O2的释放
半叶法 红外气体分析仪法
演示LCPRO+光合作用仪
实验操作 分光光度法测叶绿素a、b含量
实验基本技能（二）
试剂的配制及化学试剂的规格
溶液配制的一般步骤：
计 称 溶 转洗定摇 装
算 量解
移涤容匀
瓶 贴
签
1. 计算
如：配制500mL 0.4mol/L NaCl溶液
需要称量的氯化钠的质量： n = cV = 0.4mol/L × 0.5L = 0.2mol m = nM = 0.2mol ×58.5g/mol = 11.7g
进气 泵
IARGA
Ce
参比室 排气
叶室
Co
光合速率：f （Ce –Co）/S
20世纪50年代国外设计制造出红外线C02气体分析仪
20世纪70年代我国制造出了红外线C02气体分析仪
美国LI-COR生产的LI-6400便携式光合作用仪 英国ADC公司生产LCPRO+ 便携式光合作用仪
实验4 叶绿体色素的吸收光谱曲线及含量的测定
实验二叶绿体色素吸收光谱曲线及含量的测定一、实验目的掌握分光光度计的使用方法，学会绘制叶绿体色素的吸收光谱曲线。
了解叶绿体色素含量测定的原理，掌握叶绿体色素含量测定的方法。
二、实验原理叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。
叶绿素吸收光谱最强的吸收区有两个：一个在波长640~660nm的红光部分，另一个在波长430~450nm的蓝紫光部分。
在光谱的橙光、黄光和绿光部分只有不明显的吸收带，其中尤以对绿光的吸收最少。
胡萝卜素和叶黄素的最大吸收带在蓝紫光部分，不吸收红光等长波的光。
根据朗伯一比尔定律，某有色溶液的吸光度D与其中溶液浓度C和液层厚度L成正比，即：D＝KCLD：吸光度，即吸收光的量，C：溶液浓度,K：为比吸收系数（吸光系数），L：液层厚度，通常为1cm。
95 ％乙醇提取液中叶绿素a 和b 及类胡萝卜素分别在在665nm 、649nm 和470nm 波长下具有最大吸收峰，据此所测得的吸光度值代人不同的经验公式（见结果计算），计算出叶绿体色素乙醇提取液中叶绿素 a 和 b 的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的总浓度，并依据所使用的单位植物组织（鲜重、干重或面积），求算出色素的含量。
三、实验材料及器材仪器及试剂：研钵、量筒、滴定管、烧杯、比色杯、滤纸、脱脂棉、分光光度计、95%乙醇材料：菠菜叶片四、实验步骤1、提取称取1g菠菜叶片，加入少许95%乙醇，研磨，用量筒定容至25ml。
2、吸收光谱去1ml提取液，加3ml95%乙醇，置于比色杯中，用95%乙醇作为对照，在400~700nm 之间每隔20nm测一次光，记录波长和吸光度D于下表中，并在标准绘图纸上绘出叶绿体色素的吸收光谱曲线。
λ（nm）400 420 440 460 480 500 …... 600 620 640 660 680 700 A3、将色素提取液充分混匀后，取光径1cm 的比色杯，注入提取液，以95%乙醇作为空白对照，在波长665nm 、649nm 和470nm 下测定吸光度（、和）。
烟叶中的色素测定及进展
测定方法：
1.方法：分光光度法
2.原理： 将叶绿素a和b分离出去，剩下的类胡萝卜素溶于乙醚中， 测定这个有色溶液在451nm处的吸光值，计算出类胡萝卜素 的含量。
三、黑色素（多酚类等）的测定
测定意义：
1.酚类物质与酶促棕色化反应关系密切，影响烟叶颜色。
2.多酚类在烟草燃吸时产生酸性反应，可有效中和部分 烟气碱性，醇和烟气。多酚不但本身具有令人愉快的香 气，而且常在燃吸时通过干馏、裂解等作用，产生多种 芳香成分，改善香吃味。 3.多酚类物质含量与烤烟等级存在一致性关系，高等级 烤烟多酚含量较高，低等级烟叶的多酚含量较低。 4.多酚过量氧化常引起烟叶颜色加深，甚至出现挂灰烟 和棕色烟，严重影响烟叶的内在品质。
谢谢！
测定方法：
1.方法一：酒石酸比色法
2.原理： 酚类物质的羟基与酒石酸铁中的 铁离子生成蓝色络合物，根据络合 物溶液颜色深浅，在540nm处比色， 可测出烟叶中酚类物质含量。
1.方法二：福林法
2.原理： 在碱性条件下利用多酚的还原性，多酚可以将磷 钨钼酸还原成蓝色，蓝色深浅与多酚含量城正相关， 可以用分光广度计进行测定。
测定方法：
1.方法：分光光度法
2.原理：用有机溶剂将叶绿素提取出来，制 成待测液，根据提取液对某一波长的光有选 择吸收，吸光度符合朗莫-比尔定律，计算出 待测液中叶绿素含量：
E＝lgI0/I＝KCL
（K：吸光系数 C：浓度 L：比色皿厚度）
Байду номын сангаас
二、类胡萝卜素的测定
测定意义：
类胡萝卜素是影响烟叶品质的主要成分之一，它不仅决 定了调制后烟叶的颜色，而且在烟叶在调制、陈化过程 中，类胡萝卜素部分分解转化，形成一系列降解产物， 这些产物与烟草香味成分有正相关关系。
植物叶绿体色素含量的测定
实验四植物叶绿体色素含量的测定高等植物光合作用过程中利用的光能是通过叶绿体色素吸收的。
叶绿体色素含量与光合作用密切相关，是反应叶片生理状态的重要指标。
在植物光和生理、发育生理和抗性生理研究中经常需要测定叶绿素含量。
叶绿素含量也是知道作物栽培生产和选育作物品种的重要指标。
一、原理：根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公事计算出提取液中个色素的含量。
根据朗博—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A=aCL。
式中：a为比例常数。
当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，a为该物质的吸光系数。
各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合溶液在某一波长下的吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。
这就是吸光度的加和性。
今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿体a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。
在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
二、植物材料、仪器设备及试剂配制：（一）植物材料：完全液和缺素溶液培养的烟草苗叶片（二）仪器设备：分光光度计、电子天平、剪刀1把、镊子一把、玻璃研钵2个、4个25mL具塞棕色容量瓶、漏斗2个、移液管若干只、吸球、洗瓶、玻璃棒、吸水纸、保鲜膜等。
（三）试剂配制：95%乙醇（分析纯）、石英砂和碳酸钙三、实验步骤：1.称取新鲜植物叶片，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。
2.称取剪碎的新鲜叶片0.2g，共4份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙及2mL95%乙醇，研成匀浆，在加入乙醇10mL，继续研磨至组织变白。
静置3~5min。
3.取滤纸1张，置漏斗中，用95%乙醇湿润，沿玻璃棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25mL棕色容量瓶中，用少量95%乙醇冲洗钵体、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。
叶绿素含量的测定
植物叶绿体色素的提取、分离、及含量测定（一）叶绿体色素的提取一、实验目的1．掌握有机溶剂提取叶绿体色素等天然化合物的原理和实验方法。
2．了解皂化-萃取提取β−胡萝卜素原理。
3. 了解1,4-二氧六环沉淀法提取叶绿素原理。
二、实验原理植物光合作用是自然界最重要的现象，它是人类所利用能量的主要来源。
在把光能转化为化学能的光合作用过程中，叶绿体色素起着重要的作用。
高等植物体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类，主要包括叶绿素a、叶绿素b、β−胡萝卜素和叶黄素四种。
它们所呈现的颜色和在叶绿体中含量大约比例见表12.1。
叶绿素(chlorophylls)是叶绿酸的酯，它在植物进行光合作用中吸收可见光，并将光能转变为化学能。
叶绿素是植物进行光合作用所必需的催化剂。
在绿色植物中叶绿素主要以叶绿素a（C55H72O5N4Mg）和叶绿素b（C55H70O6N4Mg）两种结构相似的形式存在，其差别仅是叶绿素a中一个甲基被叶绿素b中的甲酰基所取代。
叶绿素的基本结构见图47.1。
在叶绿素分子结构中含有四个吡咯环，它们由四个甲烯基联结成卟啉环，在卟啉环中央有一个镁原子，它以两个共价键和两个配位键与四个吡咯环的氮原子结合成内配盐，形成镁卟啉。
在叶绿素分子中还有两个羧基，其中一个与甲醇酯化成COOCH3，另一个与叶绿醇酯化成COOC20H39长链。
类胡萝卜素(carotenoids)是一类不饱和的四萜类碳氢化合物（例如胡萝卜素，carotenes)，或它们的氧化衍生物（例如叶黄素类，xanthophylls)。
所有的类胡萝卜素均源于非环状的C40H56结构。
类胡萝卜素在强光下可防止叶绿素的光氧化；在弱光下，可作为辅助色素吸收光能并传递给叶绿素分子。
胡萝卜素有三种异构体，即α−、β−和γ−胡萝卜素，其中β−胡萝卜素含量最多，也最为重要。
β−胡萝卜素还具有维生素A的生理活性，其结构是由两分子维生素A 在端链失去两分子水结合而成。
叶绿素等的测定方法
叶绿素等的测定方法叶绿素是存在于植物和藻类细胞中的一种绿色色素，它在光合作用中起着关键作用。
因此，测定叶绿素及其相关的测定方法对于研究植物生理学、光合作用机理以及环境生态学等方面具有重要意义。
下面将介绍几种常用的叶绿素测定方法。
1.全光谱扫描法全光谱扫描法可以用于测定叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素的含量。
该方法基于不同波长下叶绿素和类胡萝卜素的吸光度差异，通过测量样品在300-800nm范围内的吸光度来确定其含量。
全光谱扫描法准确度较高，但需要较贵的设备。
2.分光光度法分光光度法是一种常用的测定叶绿素含量的方法。
该方法基于叶绿素和类胡萝卜素在不同波长下的吸光度差异，通过选择波长进行测定。
常用的波长包括470nm、645nm和663nm等。
该方法简单、快速，并且可以用于高通量样品测定。
3.乙醇提取法乙醇提取法是一种常用的叶绿素提取和测定方法。
该方法将叶样品放入乙醇等有机溶剂中，通过溶剂提取叶绿素并使其溶于溶剂中，然后使用分光光度法或高效液相色谱法等测定溶液中叶绿素的含量。
乙醇提取法可以快速提取样品中的叶绿素，适用于大量样品的测定。
4.高效液相色谱法高效液相色谱法是一种高精度的叶绿素测定方法。
该方法基于叶绿素在特定条件下在高效液相色谱柱中的分离和检测，通过测定样品中叶绿素的峰面积或峰高来确定其含量。
高效液相色谱法准确度高，但需要较为复杂的仪器和操作技术。
除了以上介绍的常用方法外，还有一些新兴的测定方法不断涌现，例如荧光光谱法、激光诱导荧光法、红外反射法等。
这些新方法在提高测定精度、扩展测定范围和降低测定成本方面具有优势，正在逐渐得到广泛应用。
综上所述，叶绿素测定方法多种多样，每一种方法都有其特点和适用范围。
在选择合适的测定方法时，需要考虑实验目的、样品种类、所需精度、设备条件和实验操作难易程度等因素，以确定最适合的测定方法。
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叶绿素、类胡萝卜素含量的测定
??? 一、原理
??? 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A 与其中溶质浓度C 和液层厚度L 成正比，即A ＝αCL 式中：α比例常数。
当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm 时，α为该物质的吸光系数。
各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。
这就是吸光度的加和性。
今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a 、b 和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A ，并根据叶绿素a 、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。
在测定叶绿素a 、b 时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
???? 二、材料、仪器设备及试剂
??? （一）材料：新鲜（或烘干）的植物叶片。
??? （二）仪器设备：1）分光光度计；2）电子顶载天平（感量0.01g ）；3）研钵；4）棕色容量瓶；? 5）小漏斗；6）定量滤纸；7）吸水纸； 8）擦境纸；9）滴管。
??? （三）试剂：1）95%乙醇（或80%丙酮）（v 丙酮：v 乙醇=2：1的95%水溶液）；2）石英砂；3）碳酸钙粉。
暗中2h ，0.5g ，25ml
??? 三、实验步骤
??1）取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。
??2)将取好的样品放入25ml 容量瓶中，加混合浸提液（无水乙醇:丙酮=5:5）20ml ，放在黑暗条件下，浸泡至叶片发白，用浸提试剂定容至25ml ，摇匀备用。
3）把叶绿体色素提取液倒入1cm 光径的比色皿内，以浸提试剂为空白测定吸光度。
选择波长663 646 和470nm 。
??? 四、实验结果计算
叶绿素a 的浓度 = 12.21 ? OD 633 – 2.81 ? OD 646
叶绿素b的浓度 = 20.13 ? OD
646– 5.03? OD
663
类胡萝卜素浓度=（1000A470-3.27C a-104C b）÷229 单位mg/L
C(mg/L)*提取液总量（ml）
叶绿体色素含量（mg/g）= ____________________________
烟叶重量（g）*1000
注意事项：操作避光研磨时间短些。