分子生物学---10蛋白质科学进展与展望

蛋白质科学进展与展望——

1.结构生物学定义

以生物大分子三维结构测定为主要手段、以生物大分子结构与功能研究为内容、以探讨和阐明生物学各前沿领域中分子作用机制和原理为目的一门的学科。

2.结构生物学中常用的技术

X射线衍射、核磁共振、（冷冻）电镜、理论建模、电子衍射、光线衍射、中子衍射等，各种技术互相补充互相促进，目前 X射线衍射技术仍是最常用的解析生物大分子三维结构的技术。以下总结一下前三种技术的优缺点：

⑴X射线衍射技术

优点：所能测定的生物大分子分子量范围较宽，可以从1k D a以下到400k D a甚至更大，而且技术的成熟度比较高、应用成本较低廉。

缺点：需要制备出适合于X射线衍射的蛋白晶体。

⑵溶液核磁共振技术

优点：不需要预先制备晶体，动态的溶液结构，更接近于生理状态。

缺点：N M R技术只适用于分子量<30k D a的可溶性蛋白，且需同位素标记，成本较高；数据收集和处理需要几个星期，需要样品在采集数据期间能够保持足够的稳定性。

⑶冷冻电镜技术

优点：适合测定分子量较大的生物大分子的复合体，例如病毒、膜蛋白的复合体等。缺点：分辨率较低，方法还有待发展，不过近年来发展迅速（原始数据质量提高，可直接检测电子信号而减少光电转化导致的数据分辨率降低）。

3.利用X射线衍射技术解析蛋白三维结构的一般流程。

⑴制备蛋白样品

选择合适的载体与表达系统，优化纯化步骤得到高纯度的蛋白，再浓缩至足够的浓度得到待结晶的蛋白样品。

⑵制备蛋白结晶（详见补充材料）

通过不断优化结晶条件直至生长出质量较高的蛋白晶体（从盐种类及浓度、p H值、P E G 种类及浓度等方面进行优化，目前还有商业化的k i t可以辅助结晶）

⑶数据采集及分析

利用X射线进行晶体衍射，得到一系列衍射图谱，经特殊软件处理后获得丢失的相位信息，最终得到电子密度图而获得目的蛋白的初始三维结构模型，再经过多轮修正和

检验后得到目的蛋白的三维结构。

⑷功能性实验验证

通常在得到某一蛋白的三维结构后还需完成其下游的功能性实验，以验证在结晶过程中对蛋白的修饰（突变、截短等）不影响蛋白的正常功能。

4.常用的结晶方法：主要有悬滴法、坐滴法（均属于气相扩散法，详见补充材料）

5.确定相位的方法

⑴多重同晶置换（M I R）

把对X射线散射能力大的重金属原子作为标识原子。这种置换入重原子的大分子应与无重原子时的原晶体有相同的晶胞参数和空间群，且绝大多数原子的位置相同，故称同晶置换。从这些含重原子晶体的衍射数据，利用基于派特逊法的方法可解出重原子的位置，据此算出其结构因子和相角，进而利用相角关系计算出没有重原子的原晶体的相角，解出结构。经常使用不只一种重原子进行置换，以得几种同晶置换衍生物，称多对同晶置换法。

⑵多波长反常散射（M A D）

晶体衍射中有一条弗里德耳定律，就是说不论晶体中是否存在对称中心，在晶体衍射中总存在着对称中心，也即有F H K L=F H K L。但是当使用的X射线波长与待测样品中某一元素的吸收边靠近时，就不遵从上述定律，也即F H K L≠F H K L。这是由电子的反常散射造成的，利用这一现象可以解决待测物的相角问题。一般，这一方法常与重原子同晶置换法结合使用。在收得同晶置换物的衍射数据后，改变入射线波长至靠近重原子的吸收边处，再次收集数据，这套数据是存在反常散射的，可利用这两套数据来求位相。有如多同晶置换法，如采用几个不同波长的X射线，对所含不同元素收集几套反常散射数据，则可得更正确、更完整的相位信息，是为多波长反常衍射法(M A D)。

相同点：都是利用重原子的特性来解决相角问题。

不同点：M A D是基于M I R的基础之上的，采用多种波长完备所需的信息。

6.同步辐射光源

⑴定义：接近光速运动的电子或正电子在改变运动方向时放出的电磁辐射，由于是在同步加速器上发现的，所以称为同步辐射。

⑵特性：高亮度、宽波段、窄脉冲、高准直、高偏振、高纯净、可精确预知

7.X射线小角散射（S A X S）

定义：一种区别于X射线大角（2θ从5～165）衍射的结构分析方法。利用X射线照

射样品，相应的散射角2θ小（5～7），即为X射线小角散射。小角X-射线散射（S A X S）

不仅可提供蛋白质低分辨率的三维结构，而且可用于蛋白质折叠和构象变化等动态学方面的研究。通常会与晶体学和N M R合用，可提供高分辨有价值信息的方法，具有互补作用。与晶体学相比，S A X S可以获得溶液中蛋白质的三维结构和蛋白质的聚集情况，这对更好的理解蛋白质的生物功能是必需的。如果已经得到蛋白质不完整的高分辨率三维结构模型，可以用S A X S来分析缺失片段的近似结构。对于大的蛋白质或蛋白质复合物来说，当蛋白质各结构域或亚基的结构已知时，S A X S最大的用途在于可以用刚体建模的方式来构建蛋白质或蛋白质复合物的整体结构。

8.同步辐射与自由电子激光（X-F E L）的比较

同步辐射自由电子激光

三代光源四代光源

不相干光相干光

需要相对较大的结晶样品（30μm以上）N a n o-c r y s t a l（5-10μm）亮度不如自由电子激光亮度比同步辐射更亮，号称史上最亮激

光

一定范围内波长和脉冲频率可调大范围内波长和脉冲频率可调

9.冷冻电镜技术（C r y o-E M）

优点：溶液状态下，无需结晶；允许在自然环境下观察，无需固定或染色，可以保证样本不受物理环境影响而造成构象的变化；能解析大的复合物，如半径~1000Å，分子量~22M D a的病毒；无需很高浓度；无需很大体积

缺点：目前只能研究>100k D a的蛋白；对异质性系统的分辨率较低

C r y o-E M单颗粒成像技术流程

生物样品的准备→c r y o-E M样品的准备→成像→数据收集→图像处理→重构→结构分析→建模，确定大分子复合物的结构；

重构流程：单颗粒成像→图像归类→2D图像a l i g n m e n t→基于模型的修正→3D重构

单颗粒成像：蛋白分子随机定位；多个2D图像生成3D模型。

图像归类：根据欧拉角归类；低信噪比使得每组平均后的信号增强；归类方法分为“s u p e r v i s e d”（即根据与模板或参考的相似性分类，适用于处理均匀的数据）和

“u n s u p e r v i s e d”（即根据内在特性分类，适用于处理不均匀数据）。

2D图像a l i g n m e n t：决定2个2D图的3个转化参数（1r o t a t i o n a l a n d2t r a n s l a t i o n a l