分子生物学新技术及应用
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分子生物学检验技术· 第十章
分子生物学新技术及其应用
温州医学院检验医学院
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
• • • • • • • 什么是代谢组学？ 代谢组学研究方法 代谢组学分析技术 气相色谱-质谱联用技术（GC-MS） 液相色谱-质谱联用技术（LC-MS） 毛细管电泳-质谱联用技术（CE-MS） 核磁共振技术（NMR）
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
研究方法
• 研究步骤：
多个方法联用
样品采集和制备
生物组织，体液经 灭活预处理
数据采集： GC/MS, GC-GC/TOFMS, LC-MS, UPLC-Q-TOF, LC-LC-MS,FT-ICR-MS, NMR, FTIR
第一节 代谢组学及其研究进展
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
北京大学实验室800兆核磁共振波谱仪
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
机体有精细的调节 机制，调节代谢的 强度、方向和速度
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
普遍定义
• 代谢组学：通过考察生物体系（细胞、组 织或生物体）受刺激或扰动后（如将某个 特定的基因变异或环境变化后），其代谢 产物的变化或其随时间的变化，来研究生 物体系的一门科学。 • 研究对象：相对分子质量小于1000的内源 性小分子。 • 代谢物小分子类别：多肽、氨基酸及其衍 生物、胺、脂类、金属离子。
章文军等通过运用小波变换去除噪声、校正基线后，再进行Fisher 判别分析，得到了比传统分析更为清晰的代谢标识物。（Chinese Journal of analytical Chemistry, 2008, 10, 1338-1342.）
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
分析技术
1.气相色谱-质谱联用技术（GC-MS） 工作原理：
离子源 接口 常压 高真空
气相色谱仪
质谱仪
质量分析器
检测器
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
生物代谢分析
第一节 代谢组学及其研究进展
应用：
• • • • • 药物研发 疾病研究 植物代谢组学 微生物代谢组学 中药现代化
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
一些有用的数据库：
连接图数据库 Connections Map DB 京都基因与基因组百科全书 KEGG (http://www.genome.jp/kegg/ligand.html) 生物化学途径 ExPASy 互联网主要代谢途径 main metabolic pathways on Internert, MMP Duke 博士植物化学和民族植物学数据库 Arizona 大学天然数据库 Wiley_handbook of gc-ms 新药及其代谢产物质谱库 http://www.ualberta.ca/_gjones/mslib.htm “肿瘤”代谢组数据库 http://www.metabolic-database.com Pubmed 化合物数据库 http://www.pubmed.gov NIST质谱数据库 http://www.nist.gov/srd/nistl.htm
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
毛细管电泳-质谱联用分析仪（兰州理工大学） 型号： P/ACE MDQ-Deca XP plus 厂家：美国 Beckan Coulter-Finnigan
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
毛细管电泳-质谱联用技术（CE-MS）
• 代谢组学研究的生物样品中包含多种离子性代谢物（糖酵 解代谢产物、三羧酸循环代谢物、如羧酸、磷酸化糖；以 及核苷酸、氨基酸、辅酶等代谢物。） • 毛细管电泳以毛细管为分离通道、采用高压直流电场为驱 动力的的新型液相分离技术，通过离子化合物的质荷比 （m/z）不同造成迁移速率不同来实现分离。 • 适用于普通反相色谱柱不易保留的离子性代谢物的分离分 析。
水 无机盐
消化吸收
中间代谢
蛋白质
维生素
废物排泄
各种物质代谢之间互有联系，相互依存。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
机体物质代谢不断受到精细调节
内外环境 的变化 对机体代谢造成 影响
精细的调 节控制
适应环境 的变化
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
一、代谢组学的概念
• 组学时代
基因表达
基因组
转录组
蛋白质组
代谢组学
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
第一节 代谢组学及其研究进展
核磁共振技术（NMR）
• 基本原理是：在排除杂质及水峰的干扰下，1HNMR的谱峰与样品中的化合物的氢原子是一一对应 的。所测的样品中的每一个氢在谱图中都有唯一 的谱峰与之相对应。图谱中信号的强弱则反映出 样品中各组分相对含量的关系，适用于研究代谢 产物。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
几种新的GC-MS技术
• 全二维气相色谱质谱技术（GC×GCTOFMS） • 全二维气相色谱：
调制器
气化室
色谱柱1
色谱柱2
检测器
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
柠檬水中柠檬烯的手性化合物分析
只能看到一个峰
切换到第二根色谱柱
色谱图_柱2 (检测器: MS)
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 色谱图_柱1 (检测器: FID)
第一节 代谢组学及其研究进展
研究实例：
用Leco ChromaTOF soft ware得到的质荷比为73（m/z） 的离子碎片典型GC×GC-TOFMS二维血浆色谱图 （Analytica Chimica Acta，2009，633，257-262）
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
2.液相色谱-质谱联用技术（GC-MS） 工作原理：
离子源
液相色谱仪
接口
常压
高真空
质谱仪
质量分析器
检测器
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
UPLC色谱柱填料颗粒：1.7μm 分离能力得到空前提高
新型超高液相色谱仪
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
比较（a）HPLC和（b）UPLC用于美沙芬的代谢物TOP质谱全扫描 （Rapid Commun Mass Spectrom, 2005, 19, 843）
第一节 代谢组学及其研究进展
液相色谱-质谱联用的新技术
• 4000Q Trap LC/MS/MS
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
Yang Jun 等运用安捷伦公司的高效液相色谱系统配合API公司的Q-TRAPLC 液相质谱系统。研究50个健康人和慢性乙肝病人的血清样本，经过脱蛋白处 理。经过去噪音，峰型尖锐化等处理。使用PLS-DA处理代谢数据，研究确 定了代谢物标记分子。（Journal of Proteome Research, 2006, 5, 554-561） 下图为分析结果：
数据处理和分析（峰检测，去噪音，峰匹配，统计分析 与识别），主要用到软件：PCA， PLS-DA，ANN
靶标识别：运用TOFMS， FT-ICR-MS, MS/MS, NMR
数据库检索，标准物对照。可用数据库： KEGG，Human Cyc，ARM，METLIN
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
使用PLS-DA处理代谢数据正常组和慢性乙肝组对照（Journal of Proteome Research, 2006, 5, 554-561）
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第一节 代谢组学及其研究进展
新型液相色谱技术UPLC
HPLC色谱柱填料颗粒：3、5μm
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第一节 代谢组学及其研究进展
UPLC在代谢组学中的研究优势：
• UPLC相对于传统的HPLC有更好的分离效 率、峰容量、及灵敏度，提供更适合与质 谱联用的接口，有助于检出更多的代谢物。 • 提高方法通量、灵敏度，改善与质谱联用 的定性定量结果。 • UPLC与质谱联用为代谢组学研究提供更加 高效、灵敏的研究平台。
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第一节 代谢组学及其研究进展
特点
1.关注于内源性小分子化合物。 2.对生物体系中的小分子化合物进行定性定量研究 3.内源性小分子化合物的上调和小调指示了与疾病、 毒性、基因修饰或环境因子的影响。 4.内源性化合物的特点用来表征疾病和药物筛选。
代谢组学研究什么？？
生物体系（细胞、组织或生物体）
环境变化 特定基因突变
代谢产物发生变化（种类，随时间变化）
代谢组学研究对象 生物体系
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
第一节 代谢组学及其研究进展
体内各种物质代谢过程互相联系形成一个整体
脂类 糖类
分子生物学新技术及其应用
温州医学院检验医学院
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第一节 代谢组学及其研究进展
• • • • • • • 什么是代谢组学？ 代谢组学研究方法 代谢组学分析技术 气相色谱-质谱联用技术（GC-MS） 液相色谱-质谱联用技术（LC-MS） 毛细管电泳-质谱联用技术（CE-MS） 核磁共振技术（NMR）
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
研究方法
• 研究步骤：
多个方法联用
样品采集和制备
生物组织，体液经 灭活预处理
数据采集： GC/MS, GC-GC/TOFMS, LC-MS, UPLC-Q-TOF, LC-LC-MS,FT-ICR-MS, NMR, FTIR
第一节 代谢组学及其研究进展
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
北京大学实验室800兆核磁共振波谱仪
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
机体有精细的调节 机制，调节代谢的 强度、方向和速度
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
普遍定义
• 代谢组学：通过考察生物体系（细胞、组 织或生物体）受刺激或扰动后（如将某个 特定的基因变异或环境变化后），其代谢 产物的变化或其随时间的变化，来研究生 物体系的一门科学。 • 研究对象：相对分子质量小于1000的内源 性小分子。 • 代谢物小分子类别：多肽、氨基酸及其衍 生物、胺、脂类、金属离子。
章文军等通过运用小波变换去除噪声、校正基线后，再进行Fisher 判别分析，得到了比传统分析更为清晰的代谢标识物。（Chinese Journal of analytical Chemistry, 2008, 10, 1338-1342.）
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
分析技术
1.气相色谱-质谱联用技术（GC-MS） 工作原理：
离子源 接口 常压 高真空
气相色谱仪
质谱仪
质量分析器
检测器
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
生物代谢分析
第一节 代谢组学及其研究进展
应用：
• • • • • 药物研发 疾病研究 植物代谢组学 微生物代谢组学 中药现代化
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
一些有用的数据库：
连接图数据库 Connections Map DB 京都基因与基因组百科全书 KEGG (http://www.genome.jp/kegg/ligand.html) 生物化学途径 ExPASy 互联网主要代谢途径 main metabolic pathways on Internert, MMP Duke 博士植物化学和民族植物学数据库 Arizona 大学天然数据库 Wiley_handbook of gc-ms 新药及其代谢产物质谱库 http://www.ualberta.ca/_gjones/mslib.htm “肿瘤”代谢组数据库 http://www.metabolic-database.com Pubmed 化合物数据库 http://www.pubmed.gov NIST质谱数据库 http://www.nist.gov/srd/nistl.htm
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
毛细管电泳-质谱联用分析仪（兰州理工大学） 型号： P/ACE MDQ-Deca XP plus 厂家：美国 Beckan Coulter-Finnigan
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
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第一节 代谢组学及其研究进展
毛细管电泳-质谱联用技术（CE-MS）
• 代谢组学研究的生物样品中包含多种离子性代谢物（糖酵 解代谢产物、三羧酸循环代谢物、如羧酸、磷酸化糖；以 及核苷酸、氨基酸、辅酶等代谢物。） • 毛细管电泳以毛细管为分离通道、采用高压直流电场为驱 动力的的新型液相分离技术，通过离子化合物的质荷比 （m/z）不同造成迁移速率不同来实现分离。 • 适用于普通反相色谱柱不易保留的离子性代谢物的分离分 析。
水 无机盐
消化吸收
中间代谢
蛋白质
维生素
废物排泄
各种物质代谢之间互有联系，相互依存。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
机体物质代谢不断受到精细调节
内外环境 的变化 对机体代谢造成 影响
精细的调 节控制
适应环境 的变化
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第一节 代谢组学及其研究进展
一、代谢组学的概念
• 组学时代
基因表达
基因组
转录组
蛋白质组
代谢组学
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
第一节 代谢组学及其研究进展
核磁共振技术（NMR）
• 基本原理是：在排除杂质及水峰的干扰下，1HNMR的谱峰与样品中的化合物的氢原子是一一对应 的。所测的样品中的每一个氢在谱图中都有唯一 的谱峰与之相对应。图谱中信号的强弱则反映出 样品中各组分相对含量的关系，适用于研究代谢 产物。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
几种新的GC-MS技术
• 全二维气相色谱质谱技术（GC×GCTOFMS） • 全二维气相色谱：
调制器
气化室
色谱柱1
色谱柱2
检测器
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
柠檬水中柠檬烯的手性化合物分析
只能看到一个峰
切换到第二根色谱柱
色谱图_柱2 (检测器: MS)
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 色谱图_柱1 (检测器: FID)
第一节 代谢组学及其研究进展
研究实例：
用Leco ChromaTOF soft ware得到的质荷比为73（m/z） 的离子碎片典型GC×GC-TOFMS二维血浆色谱图 （Analytica Chimica Acta，2009，633，257-262）
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
2.液相色谱-质谱联用技术（GC-MS） 工作原理：
离子源
液相色谱仪
接口
常压
高真空
质谱仪
质量分析器
检测器
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
UPLC色谱柱填料颗粒：1.7μm 分离能力得到空前提高
新型超高液相色谱仪
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
比较（a）HPLC和（b）UPLC用于美沙芬的代谢物TOP质谱全扫描 （Rapid Commun Mass Spectrom, 2005, 19, 843）
第一节 代谢组学及其研究进展
液相色谱-质谱联用的新技术
• 4000Q Trap LC/MS/MS
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
Yang Jun 等运用安捷伦公司的高效液相色谱系统配合API公司的Q-TRAPLC 液相质谱系统。研究50个健康人和慢性乙肝病人的血清样本，经过脱蛋白处 理。经过去噪音，峰型尖锐化等处理。使用PLS-DA处理代谢数据，研究确 定了代谢物标记分子。（Journal of Proteome Research, 2006, 5, 554-561） 下图为分析结果：
数据处理和分析（峰检测，去噪音，峰匹配，统计分析 与识别），主要用到软件：PCA， PLS-DA，ANN
靶标识别：运用TOFMS， FT-ICR-MS, MS/MS, NMR
数据库检索，标准物对照。可用数据库： KEGG，Human Cyc，ARM，METLIN
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
使用PLS-DA处理代谢数据正常组和慢性乙肝组对照（Journal of Proteome Research, 2006, 5, 554-561）
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
新型液相色谱技术UPLC
HPLC色谱柱填料颗粒：3、5μm
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
UPLC在代谢组学中的研究优势：
• UPLC相对于传统的HPLC有更好的分离效 率、峰容量、及灵敏度，提供更适合与质 谱联用的接口，有助于检出更多的代谢物。 • 提高方法通量、灵敏度，改善与质谱联用 的定性定量结果。 • UPLC与质谱联用为代谢组学研究提供更加 高效、灵敏的研究平台。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
第一节 代谢组学及其研究进展
特点
1.关注于内源性小分子化合物。 2.对生物体系中的小分子化合物进行定性定量研究 3.内源性小分子化合物的上调和小调指示了与疾病、 毒性、基因修饰或环境因子的影响。 4.内源性化合物的特点用来表征疾病和药物筛选。
代谢组学研究什么？？
生物体系（细胞、组织或生物体）
环境变化 特定基因突变
代谢产物发生变化（种类，随时间变化）
代谢组学研究对象 生物体系
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
第一节 代谢组学及其研究进展
体内各种物质代谢过程互相联系形成一个整体
脂类 糖类