针对外显子设计PCR测序引物教程

针对外显子设计PCR测序引物教程

在园子搜索后，没有看到长基因（大与1000base)最简洁方法，而我现在欧洲实验室里从事这方面工作，作了大量这方面的工作。自乐不如同乐，愿将我们设计引物技巧与大家分享，敲字很辛苦，请斑竹给点分。可能有战友说了，我们的长基因都是交给测序公司用鸟枪法来测全基因的。当然，您有钱当然可以这样做。我们的方法适用于基因测序筛查突变，步骤相对简便，比较经济。另外，本实验室最近的一偏文章采用该法发在了NEMJ上，可见该法已经是经典成熟的。

（1）基础知识

我们知道gDNA由非编码区，外显子，内含子构成。我们关心的基因是否突变在非编码区，外显字以及临近外显子的一小段内含子上。至于其他的内含子（gDNA中的大头），发生突变与否并不是我们关心的，其临床意义也相当小。因此我们只要设计引物来PCR上面三个重点区域就可以了。

（2）设计软件

在线设计软件exon primer

http://ihg2.helmholtz-muenchen.de/ihg/ExonPrimer.html

大家从上图可以看到，网页提示我们现在需要输入两个序列，一个是cDNA，一个是gDNA。

由于我们还要考虑非编码区，而CDNA是没有非编码区UTR的。因此，我们必须要用mRNA 输入网页中的cDNA栏。否则我们得到的引物不会包含UTR。要是有看官还看不懂的话，建议看下分子生物学教材关于cDNA和mRNA的区别。

下面我们以smurf2基因来说明如何设计针对外显子的测序引物。

（2）找到smurf2 mRNA

打开gene bank

/,注意要在database中选nucleotide

如下图

蹦出一大串序列。找到我们要的人类的smurf2

Homo sapiens SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 2 (SMURF2), mRNA

直接点我们要的序列名字，就得到了mRNA了，Format:GenBank FASTA Graphics More Formats选项中当然要求点选FASTA形式了

把mRNA序列拖选，拷贝下来

再拷贝入在线设计软件exon primer （见第一贴）

http://ihg2.helmholtz-muenchen.de/ihg/ExonPrimer.html

好了。下面就要找gDNA了。

（3）ensembl在线查找gDNA

/Homo_sapiens/Info/Index

进入人类基因序列库

输入smurf2

得到下面的信息

点击Ensembl protein_coding Gene: ENSG00000108854 (HGNC (automatic): SMURF2

得到两段序列,201和202,其实两段序列是不同机构作出来的,大同小异.点第一个

得到如下页面

点页面里的supporting evidence,再点exon,就得到了smurf2的全基因序列,我们可以看到大写的碱基为外显子,小写的碱基为内含字.其实ensembl不同于ncbi的最大优势在于分开了外显字和内含字.我们设计的引物就知道是在外显子还是内含子上了.

现在将全部的gDNA用鼠标拖选起来,大家注意到两点(1)务必使内涵子全部显示,我们在页面左下角的

Configure this page里有这个选项.(2)鼠标拖选后,里面会有一些页面里的单词,比如ENSE00001331843什么的,必须把这类字母过滤掉.

可以用DNA-Star 工具软件里的Editseq(网上有下),将序列过滤,仅保留ATCG字母.或者用下列在线过滤工具

/sms/index.html

将过滤后的ATCG拷入

在线设计软件exon primer 的gDNA栏中(见第一贴)

http://ihg2.helmholtz-muenchen.de/ihg/ExonPrimer.html

默认的参数不变. done!

就得到了我们要的外显子引物了.大家可以发现我们的引物cover了非编码区，外显字以及临近外显子的一小段内含子.大功告成!(全文完)