第四代基因组测序技术
一二三四代测序技术原理详解
一二三四代测序技术原理详解一、第一代测序技术原理第一代测序技术最早出现于1977年，是由Sanger等人发明的，并被称为“链终止法”。
其原理是通过DNA聚合酶将输入的DNA序列再生产出一条互补链，同时在每个位点上加入一种特殊的荧光标记的二进制核苷酸，然后将这些被标记的DNA片段分开进行电泳，根据电泳结果可以得到DNA的序列。
第一代测序技术的核心原理是首先将待测序列分成多个片段，然后利用DNA聚合酶在每个片段的3'末端加入一种荧光标记的二进制核苷酸。
这种核苷酸的特殊之处在于，它们只能和待测序列的碱基互补配对，并且在加入过程中会停止DNA链的生长。
随后，将加入了荧光标记的DNA片段进行分离和电泳。
由于不同长度的DNA片段在电场下移动的速度不同，所以通过观察不同片段的移动位置，可以推断出每个片段的碱基序列。
二、第二代测序技术原理第二代测序技术的原理是通过对待测DNA片段进行多轮的扩增和测序，最后将所有结果进行比对和组装，得到完整的DNA序列。
第二代测序技术的核心原理是将待测DNA样本分成许多小片段，然后将每个片段进行扩增，所得到的扩增产物再次进行扩增，并且在扩增过程中引入一种荧光标记的二进制核苷酸。
在每个扩增步骤之后，需要将扩增产物进行分离，例如利用固相法将扩增产物固定在芯片上。
然后，对每个扩增产物进行毛细管电泳或基于光信号的测量，以确定每个扩增产物对应的碱基序列。
最后，通过将所有碱基序列进行比对和组装，可以得到待测DNA的完整序列。
第二代测序技术相较于第一代测序技术具有更高的通量和更低的成本，可以同时进行大规模的测序，因此被广泛应用于基因组学和生物医学研究。
三、第三代测序技术原理第三代测序技术是在第二代测序技术的基础上发展而来的，其主要原理是通过直接测量DNA或RNA单分子的序列来进行测序，无需进行扩增和分离过程。
第三代测序技术的核心原理是通过探测DNA或RNA单分子在固定的平面上的位置变化，来确定每个单分子的碱基序列。
第四代基因测序技术——纳米孔测序技术
纳米孔测序技术原理
基本原理：
Nanopore测序是将人工合成的一种多聚物膜浸入离子溶液，多聚物膜上 布满了经穿膜孔的跨膜通道蛋白，即纳米孔蛋白也叫Reader蛋白。在膜 两侧施加不同电压产生电压差，DNA双链在马达蛋白的牵引下解螺旋通 过纳米孔蛋白，不同碱基通过时形成特征性离子电流变化信号，这被称 为Nanopore信号。
采用边合成边测序的方法，高通量为其特点。以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa， Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术大大降低测序成本，大幅提高了测 序速度和准确性，但阅读长度相对较短。
单分子测序为主要特征的第三代测序技术（也称为Next-generation sequencing）也还在研究当 中，测序过程无需进行PCR扩增。如Heloscope 单分子测序技术也是基于边合成边测序的思想， 但不需要PCR 扩增，所以更能反映样本的真实情况，通量也更高。 还有PacBio公司的SMRT 测序技术，SMRT 芯片为一种多ZMW 孔的厚度为100nm 的金属片，测序时将DNA 聚合酶、不 同荧光标记的dNTP、待测序列加入ZMW 孔的底部，然后进行合成反应。
第四代基因测序技术简介
——纳米孔测序技术（Nanopore sequencing)
小珮妮
基因测序技术发展历史
第一代测序技术： 第二代测序技术： 第三代测序技术：
第四代测序技术：
Sanger双脱氧链终止法，Gilbert化学裂解法等，操作复杂，自动化程度低，测序时间长且成 本高，不满足大规模基因测序要求。
四代DNA测序技术简述
四代DNA测序技术简述姚亭秀【摘要】DNA测序技术是现代分子生物学研究中最常用的技术,极大推动了生物学的发展.从20世纪70年代至今,DNA测序技术已历经4代.简介被称为DNA测序始祖的第1代测序技术、边合成边测序的第2代测序技术、不依赖于PCR扩增的第3代测序技术,以及处于研发中的第4代测序技术.【期刊名称】《生物学通报》【年(卷),期】2017(052)002【总页数】4页(P5-8)【关键词】第1代测序技术;第2代测序技术;第3代测序技术;第4代测序技术【作者】姚亭秀【作者单位】北京市第八十中学北京 100102【正文语种】中文【中图分类】Q81自1953年J.D.Watson和P.H.C.Crick发现DNA双螺旋结构之后，DNA测序技术随着科学技术的进步迅猛发展，目前已成为现代分子生物学研究中最常用的技术之一。
该技术从1977年起至今，历经了第1代至第4代的发展。
本文对一些主要测序技术的原理，核心步骤及优、缺点进行简介。
1 第1代测序技术第1代测序技术诞生于1977年,分别是F.Sanger和A.R.Coulson发明的DNA双脱氧核苷酸末端终止测序法，以及A.M.Maxam和W.Gilbert发明的化学降解法。
在上述2种方法的基础上，后来又分别诞生了荧光自动测序技术和杂交测序技术等。
1.1 DNA双脱氧核苷酸末端终止测序法/Sanger法该技术原理为：利用双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）比脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）少3′－OH，因此不能在DNA合成过程形成磷酸二酯键，使DNA合成反应中断，进而测得DNA序列。
因该技术的主要发明人为F.Sanger，故该测序法又叫Sanger法。
该方法的核心步骤为：1）将含有待测单链片段的PCR反应液中分别加入一种含放射性标记的双脱氧核苷三磷酸，完成PCR反应；2）分别收集、纯化反应产物；3）对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；4）对电泳结果进行放射自显影，并判断待测DNA序列。
(完整)基因测序技术概述
基因测序技术概述摘要：基因测序技术是一种发展迅速和应用广泛的现代分子生物学技术之一.本文基于国内外基因测序技术的发展现状，综合评述了四代基因测序技术，归纳了它们各自的特点与优缺点，以及应用现状、范围及其在实际应用中的优势和不足，总结了当前出现的基因测序新方法，并对该项技术的发展趋势进行展望。
关键词：基因测序技术；发展；应用；前景Abstract： Gene sequencing technology is a kind of modern molecular biology techniques with rapid development and wide application .In this paper， it is based on the current development of gene sequencing technology at home and abroad， a comprehensive review is given on the four generations of gene sequencing technology, it sums up their respective characteristics ， advantages and disadvantages, as well as their application about status， scope and its advantages and disadvantages in practical application， it summarizes the new gene sequencing method, and points out the development trend of itself。
Key words： Gene sequencing technology; Development； Application; Prospects基因测序技术，又称DNA测序技术，是分子生物学研究中最常用的技术，它的出现极大地推动了生物学的发展成熟。
核苷酸四代测序
核苷酸四代测序摘要：1.核苷酸四代测序的概述2.核苷酸四代测序的发展历程3.核苷酸四代测序的技术原理4.核苷酸四代测序的应用领域5.核苷酸四代测序的优势与局限性正文：核苷酸四代测序（Fourth-generation sequencing，简称4G sequencing）是一种先进的基因测序技术，相较于传统的Sanger 测序和Illumina/Solexa 测序，具有更高的测序通量、更快的测序速度以及更低的测序成本。
本文将详细介绍核苷酸四代测序的发展历程、技术原理、应用领域以及优势与局限性。
一、核苷酸四代测序的概述核苷酸四代测序是一种基于半导体技术的测序方法，通过检测合成链终止时产生的信号来确定DNA 序列。
与传统的Sanger 测序和Illumina/Solexa 测序相比，核苷酸四代测序在通量、速度和成本方面具有明显优势。
二、核苷酸四代测序的发展历程核苷酸四代测序技术起源于美国，其发展经历了几个阶段：1.2004 年，美国Pacific Biosciences 公司（现Oxford Nanopore Technologies 公司）推出第一款核苷酸四代测序仪，开启核苷酸四代测序技术的研究与发展。
2.2011 年，Pacific Biosciences 公司发布第二代核苷酸四代测序仪，测序速度和通量得到显著提升。
3.2014 年至今，核苷酸四代测序技术不断优化和完善，已广泛应用于多个领域。
三、核苷酸四代测序的技术原理核苷酸四代测序基于单分子实时测序技术，其主要原理如下：1.纳米孔：核苷酸四代测序采用纳米孔作为检测单元，纳米孔内可形成单个分子通道，实现对单个核苷酸的实时检测。
2.合成链终止：核苷酸四代测序通过合成链终止技术来确定DNA 序列。
在测序过程中，合成链会在特定位置终止，终止点处会产生电信号，通过检测这些信号，可获得DNA 序列信息。
3.信号检测与分析：核苷酸四代测序采用半导体技术检测合成链终止时产生的信号，并利用计算机分析数据，得到最终的测序结果。
四种测序对比(四代测序比较)
原理应用一代测序DNA双脱氧核苷酸末端终止法，即在测序过程中掺入四种不同的ddNTP，由于ddNTP末端没有羟基，所以双链无法继续延伸，DNA合成终止。
这样合成的终产物包括了很多长短不一的片段，利用电泳分离该混合物，依据电泳条带即可读出片段序列。
第一次人类全基因组测序二代测序边合成边测序，即将待测序列变性后锚定与于固相表面，在每一个待测序簇进行延伸互补时，每加入一个被荧光标记的dNTP就会释放出对应的荧光，通过对荧光信号进行捕捉来转换成测序峰图，继而得到待测片段的序列信息，通过生物信息学工具将可以将片段信息进行组合，得到整个基因中国大熊猫种群测序，大规模基因组测序，宏观了解基因组和基因组学相关信息三代测序基于纳米孔相关技术的单分子测序技术，或可称为直接测序技术。
首先建立纳米级别的孔径，使DNA分子单独通过孔径，由于碱基化学组成不同，其电导率也不同，根据电导率可以直接读出相应的碱基序列。
某些罕见病的低突变率位点鉴定基因芯片基因芯片技术基于DNA杂交原理，通过将数以万记的寡核苷酸探针固定于面积很小的固相上制成阵列，将待测序列用荧光进行标记，待测序列与核酸探针互补，洗脱后确定荧光强度最强的位置，获得该组探针的序列，通过生物信息学工具重组靶核苷酸全部序列。
农作物筛选和代谢酶相关基因检测测序方法比较优势劣势技术原理简单，成本低基于PCR技术，对DNA合成质量要求很高。
每次只能读取一条序列。
测序长度有严格的限制。
快速，操作简便，成本较低基于PCR技术，对DNA合成质量要求很高。
测序长度有严格的限制。
后续结果处理需要大量生物信息学支持。
不涉及PCR，测序精确，快速，大批量样本易降低成本，可以连续检测较长的DNA序列。
后续结果处理需要大量生物信息学支持。
高通量检测，容易实现自动化。
寡核苷酸探针组成复杂，条件不易统一，进而造成假阳性和假阴性，对重复序列还没有很好的解决方法。
四种测序对比（四代测序比较）
四种测序对比（四代测序比较）原理应用一代测序DNA双脱氧核苷酸末端终止法，即在测序过程中掺入四种不同的ddNTP，由于ddNTP末端没有羟基，所以双链无法继续延伸，DNA合成终止。
这样合成的终产物包括了很多长短不一的片段，利用电泳分离该混合物，依据电泳条带即可读出片段序列。
第一次人类全基因组测序二代测序边合成边测序，即将待测序列变性后锚定与于固相表面，在每一个待测序簇进行延伸互补时，每加入一个被荧光标记的dNTP就会释放出对应的荧光，通过对荧光信号进行捕捉来转换成测序峰图，继而得到待测片段的序列信息，通过生物信息学工具将可以将片段信息进行组合，得到整个基因中国大熊猫种群测序，大规模基因组测序，宏观了解基因组和基因组学相关信息三代测序基于纳米孔相关技术的单分子测序技术，或可称为直接测序技术。
首先建立纳米级别的孔径，使DNA分子单独通过孔径，由于碱基化学组成不同，其电导率也不同，根据电导率可以直接读出相应的碱基序列。
某些罕见病的低突变率位点鉴定基因芯片基因芯片技术基于DNA杂交原理，通过将数以万记的寡核苷酸探针固定于面积很小的固相上制成阵列，将待测序列用荧光进行标记，待测序列与核酸探针互补，洗脱后确定荧光强度最强的位置，获得该组探针的序列，通过生物信息学工具重组靶核苷酸全部序列。
农作物筛选和代谢酶相关基因检测测序方法比较优势劣势技术原理简单，成本低基于PCR技术，对DNA合成质量要求很高。
每次只能读取一条序列。
测序长度有严格的限制。
快速，操作简便，成本较低基于PCR技术，对DNA合成质量要求很高。
测序长度有严格的限制。
后续结果处理需要大量生物信息学支持。
不涉及PCR，测序精确，快速，大批量样本易降低成本，可以连续检测较长的DNA序列。
后续结果处理需要大量生物信息学支持。
高通量检测，容易实现自动化。
寡核苷酸探针组成复杂，条件不易统一，进而造成假阳性和假阴性，对重复序列还没有很好的解决方法。
测序技术在基因组学中的应用
测序技术在基因组学中的应用基因组学作为现代生命科学的重要分支，研究的是生物的基因组结构、功能以及在组成生物的生命过程中起到的作用。
其中，测序技术成为了基因组学研究中最为重要的技术手段之一，因此，本文将探讨测序技术在基因组学中的应用。
一、测序技术的发展和分类测序技术指的是对DNA或RNA序列进行测定的实验技术，是解析基因组结构和功能的基础。
随着科技的不断进步，测序技术也得以快速发展，在过去的几十年中经历了多次技术创新和突破。
目前，测序技术主要分为4代、5代和单分子测序技术等多种类型。
其中，第一代测序技术采用了链终止法（Sanger法），能够以准确的方式测定较短的DNA序列，其数量也较为有限。
第二代测序技术则通过扩增DNA复制得到更多的DNA片段，并进行准确的测序，能够同时测定大量的DNA序列信息，且快速、高通量。
第三代测序技术利用单分子扩增的方法对DNA或RNA进行测序，无需扩增平台，且提供单分子级别的测序和长序列信息。
而单分子测序技术，能够获得更为准确、完整和详细的序列信息。
二、测序技术在基因组学中的应用1. 基因组测序基因组测序是基因组学研究中最基础也是最重要的一项任务。
测序技术可以精确测定DNA序列，帮助科学家分析基因组结构和功能，发现、鉴定和定位基因、蛋白质及其相互关系，对基因组特征进行准确描述。
现代测序技术能够以高精度、高速、高通量地完成基因组测序，并生成大量的序列数据。
随着测序技术的发展，达到全基因组测序也变得越来越可行。
全基因组测序是一种研究基因组结构和功能的重要方法，但是对于大规模的基因组来说，需要克服复杂度、精度、时间和成本等多个难关。
2. 转录组测序转录组测序是基于RNA的测序技术，可以精确检测RNA在细胞中的量和类型，反映出基因表达水平。
在研究生物各种复杂的生理和病理状态时，转录组测序技术发挥了很大的作用。
它可以对各种组织和细胞的转录本和转录间区域信息进行定量检测、差异性分析，对细胞分化、发育、恢复等过程中转录组变化规律及不同基因表达关系进行分析，反映出生物活动和生命过程的多种特征。
基因测序设备的技术进步考核试卷
B. Visium
C. MERFISH
D. seqFISH
三、填空题（本题共10小题，每小题2分，共20分，请将正确答案填到题目空白处）
1.第一代基因测序技术中，Sanger测序的原理是______。
答案：
2.第二代基因测序技术中，Illumina测序平台采用的测序方法是______。
答案：
3.第三代测序技术中，PacBio SMRT技术的特点是______。
A.样本的DNA浓度
B.测序试剂的稳定性
C.设备的运行状态
D.数据分析软件的版本
9.以下哪些技术可以用于检测DNA中的结构变异？（）
A. PacBio SMRT技术
B. Oxford Nanopore技术
C. Illumina HiSeq技术
D. array CGH技术
10.以下哪些技术适用于宏基因组测序？（）
三、填空题
1.双脱氧终止法
2.边合成边测序法（或SBS技术）
3.读取长度长，错误率较高，实时测序
4.蛋白质通道
5.重叠
6. RNA-Seq
7. Methyl-Seq
8. CRISPR相关蛋白9（或CRISPR associated protein 9）
9.测序
10. Gene prediction tools（或基因预测工具）
D. Sanger测序
16.以下哪种技术的发展显著降低了基因测序的成本？（
A. Sanger测序
B.第二代测序技术
C.第三代测序技术
D.第四代测序技术
三分钟了解4代基因测序技术
三分钟了解4代基因测序技术基因检测技术是近年来伴随“精准医疗”概念的提出而迅速发展起来的一门科学技术，它可以从基因组机制上阐释遗传学、发育生物学、进化生物学等学科的经典概念，在全基因组水平延伸了染色体高级构象、细胞异质性、功能模块等新概念，为精准医学开辟了应用性新领域。
近年来，随着分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善，基因检测成为临床诊断和研究的热点。
基因检测技术应用于遗传病诊断、罕见病、产前筛查、临床个体用药以及肿瘤监诊断疗等领城的科研成果也层出不穷。
目前，应用较广的基因检测技术大致分三类：基因测序、以核酸扩增为基础的PCR技术，以荧光杂交检测为基础的FISH技术。
这三类技术沟通构成了基因检测基础，大部分基因检测项目都有赖于这三项基础技术开展。
与PCR和FISH技术相比，基因测序技术可直接读取DNA分子的30亿个碱基序列，具有高通量、数据量大的特点。
此外，基因芯片技术应用范围也较广。
基因检测技术对比在本文中，小编汇总了4代基因测序技术并比较其优缺点，以期帮助正在从事基因检测工作或行业的您，了解这项技术的发展历程。
基因组学与基因检测技术的概述基因组学是伴随“人类基因组计划”发展起来的一门新兴学科，是新世纪科学的莫基学科，已成为生命科学发展的基础性和引领性学科。
20世纪50年代，Watson和Crick提出DNA双螺旋结构后，人们对基因的遺传学功能逐渐有所认识，并开始致力于DNA序列检测的探索。
1975年Sanger等发明了第一代测序技术并在1980年完成了人类历史上第一个基因组序列¬——噬菌体X174的测序，它标志着人类正是进入基因组学时代。
从1985年人类基因组计划提出，到2001年人类基因组草图完成，基因组学的研究也从以全基因组测序转向以基因功能鉴定为日标的后基因组时代。
基因检测技术经过近70年的发，从第一代的双脱氧链测序技术已经发展到第四代固态纳米测序技术。
测序技术的发展使人们能够方便准确地获取大量的基因组信息，并将其应用于疾病的研究，借此人们遜渐认识到基因变异与疾病发生发晨的关系。
DNA测序技术的发展和其最新进展
DNA测序技术的发展和其最新进展DNA测序技术是指对DNA分子的序列进行分析和研究的技术手段。
随着科技的不断发展，DNA测序技术也在不断进步和演变。
以下是DNA测序技术的发展历程和最新进展：1. 第一代测序技术（Sanger测序）：20世纪70年代发展起来的Sanger测序技术是第一代DNA测序技术。
该技术基于DNA合成链终止原理，通过引入一种特殊的二进制核苷酸（ddNTP）来阻止DNA链延伸，从而确定DNA的序列。
虽然Sanger测序技术准确可靠，但是速度较慢且昂贵。
2. 第二代测序技术（高通量测序）：2005年以后，高通量测序技术的发展使DNA测序速度大幅提升，成本显著降低。
高通量测序技术包括454、Illumina、Ion Torrent等多种技术平台。
这些技术利用多个并行反应来进行快速大规模测序，数据生成速度快，适用于基因组学研究和临床检测。
3. 第三代测序技术（单分子测序）：第三代测序技术突破了传统测序技术的限制，实现了对单个DNA分子的直接测序。
这些技术包括SMRT（Single-Molecule Real-Time）测序、Nanopore测序等。
第三代测序技术具有高通量、长读长、快速和低成本的特点，可用于对复杂基因组结构、基因突变和转录组的研究。
最新进展：1. 快速测序：DNA测序速度不断提升，目前已经可以在短时间内完成耗时较长的全基因组测序和全外显子组测序。
这样快速测序技术的应用使得大规模人群的基因组信息获取成为可能。
2. 单细胞测序：单细胞测序技术可以对个体细胞进行测序，揭示人体各个细胞类型的基因表达和遗传变异情况。
这种技术的应用有助于揭示疾病发生和发展的机制，并为个体化医疗提供依据。
3. 元基因组学测序：元基因组学是指对微生物群落中所有基因组的研究。
元基因组学测序技术能够高通量地对微生物群落进行测序，帮助研究人员深入了解微生物的多样性和功能。
4. CRISPR技术在测序中的应用：CRISPR基因编辑技术不仅可以用于基因修饰，还可以用于DNA测序和基因组编辑。
核苷酸四代测序
核苷酸四代测序核苷酸四代测序是一种高通量测序技术，被广泛应用于基因组学、遗传学、疾病研究等领域。
本文将从技术原理、应用领域和未来发展等方面介绍核苷酸四代测序。
一、技术原理核苷酸四代测序技术是一种高效、高通量的DNA测序技术。
它基于DNA链延伸的原理，通过将DNA分子固定在固相载体上，利用荧光标记的四种不同核苷酸在适当条件下的特异性链延伸，通过高通量测序仪器进行荧光信号的检测和记录，从而获得DNA序列信息。
核苷酸四代测序技术具有高通量、高准确性、高灵敏度和高效率的特点。
它能够同时测序多个DNA分子，每次测序可以产生数百万到数十亿个碱基对的序列数据，大大提高了测序效率和成本效益。
二、应用领域核苷酸四代测序技术在各个领域都有广泛的应用。
在基因组学研究中，核苷酸四代测序技术可以用于揭示物种的基因组组成、基因结构和功能等信息，帮助科学家深入了解生物的遗传特征和进化历程。
在医学研究中，核苷酸四代测序技术可以用于疾病的基因诊断、个体化治疗和药物研发。
通过测序病人的基因组，可以发现与疾病相关的遗传变异，为疾病的早期预测和治疗提供依据。
在农业和生物工程领域，核苷酸四代测序技术可以用于农作物的基因改良和品种筛选，提高作物的产量和抗逆性。
同时，它也可以用于微生物的基因组学研究，帮助科学家了解微生物的功能和生态特性。
三、未来发展随着科学技术的不断进步，核苷酸四代测序技术也在不断发展。
目前已经出现了更加高效和经济的测序技术，如核苷酸五代测序技术。
这些新技术在提高测序效率和准确性的同时，也降低了测序的成本，使得测序技术更加普及和应用广泛。
未来，核苷酸四代测序技术有望在医学、农业和生物工程等领域发挥更大的作用。
随着测序技术的进一步完善，我们可以更好地了解生命的奥秘，为人类的生活和健康做出更多贡献。
总结起来，核苷酸四代测序技术是一种高通量、高效、高准确性的DNA测序技术。
它在基因组学、医学研究、农业和生物工程等领域都有广泛的应用。
新一代基因测序技术PPT课件
03
新一代基因测序技术的应用
医学研究领域的应用
精准医疗
新一代基因测序技术能够快速准 确地检测出个体基因变异，为精 准医疗提供有力支持，实现个性
化治疗和用药。
遗传病诊断
通过对患者基因的测序和分析，有 助于遗传病的早期诊断和预防，为 遗传病患者提供更好的治疗方案。
肿瘤研究
基因测序技术在肿瘤研究中发挥着 重要作用，有助于肿瘤的分类、分 型、预后评估以及药物研发。
下一代测序技术的原理
下一代测序技术主要基于大规模平行测序原理，将待测基因组DNA打断成一定长 度的片段，然后利用固相分子链接酶将测序引物结合到DNA片段上，通过循环延 伸和合成互补链的方式逐个测定每个片段的碱基序列。
不同的测序平台，如Illumina、PacBio和Nanopore等，其原理和技术细节略有 不同，但基本思路一致。
基因测序技术在生命科学研究、医学 诊断、生物信息学等领域的重要性和 应用价值。
新一代基因测序技术的意义
提高测序速度和通量
新一代基因测序技术相较于传统测序 技术，能够更快地完成大规模基因组 测序，提高测序效率。
降低测序成本
拓展应用领域
新一代基因测序技术的应用领域不断 扩大，不仅局限于基础研究，还涉及 到临床诊断、个性化医疗、生物信息 学等领域。
农业领域
新一代基因测序技术的应用，使得精准育种成为可能，提 高了农作物的产量和品质，为解决全球粮食安全问题提供 了有力支持。
对未来科技发展的启示
01 02
跨学科合作
新一代基因测序技术的发展和应用，需要多学科的交叉融合，包括生物 学、医学、物理学、化学等，这启示我们在未来科技发展中要注重跨学 科的合作与交流。
随着技术的不断进步，新一代基因测 序技术的成本逐渐降低，使得更多人 能够享受到基因测序服务。
DNA测序的原理与技术
DNA测序的原理与技术DNA测序是一项利用生物技术分析和解读DNA序列的过程，现已成为各个领域的重要研究手段。
本文将简要介绍DNA测序的基本原理和常用技术及其优缺点。
一、基本原理DNA测序的基本原理是利用DNA的单一碱基（即核苷酸）序列的排列方式来确定一个特定DNA分子的唯一标识，从而确定DNA分子在整个DNA序列中的位置和序列。
DNA的四种碱基分别为腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）。
这些碱基按照一定的排列方式构成了人类和其他物种的基因组DNA序列。
DNA测序方法根据其实验过程的不同，分为传统Sanger测序和新兴测序。
二、传统Sanger测序Sanger测序也称为二代测序，是一种通过使用一种特殊的增殖方法来测定DNA序列的技术。
在这种方法中，DNA被复制成许多相同的串联序列，每一次增殖都会随机生成一个已知序列的碱基。
通过逐步扩大这些随机扩增的序列的长度，Sanger测序可以得到完整的位于DNA中的所有碱基的序列。
Sanger测序的优点在于其精度和可靠性高，但它需要耗费时间和更多的资金和劳动力来生成结果。
此外，Sanger测序需要大量的输入DNA，在宏观生物学研究中尤其适用。
三、新兴DNA测序技术新兴DNA测序技术包括第三代测序、单分子打孔测序、纳米孔测序、以及第四代单通道测序等多种技术。
这些技术都以高通量、高速度和低成本而著称，为测量、分析和研究大规模DNA基因组的方法带来了更多机会。
1.第三代测序第三代测序是一种通过平台上的一些微小传感器来读取单个DNA分子上的碱基信息，产生高通量读取的新技术。
目前这种技术的常见应用包括基因组组装、分析和宏基因组学。
第三代测序的优点在于其高精度、低成本和高效性。
2.单分子打孔测序单分子打孔测序技术是新兴的DNA测序技术，其原理是利用小孔将单个DNA碱基传导到电子传感器中。
通过利用微流控技术进一步优化，可以实现以比Sanger测序更快的速度进行DNA测序。
基因诊断中测序技术的应用及优缺点
FOOD INDUSTRY ·139 陈跃龙 楚雄医药高等专科学校基因诊断中测序技术的应用及优缺点腺嘌呤与胸腺嘧啶（Ｔ）和胸腺嘧啶（Ｔ）相似，但与其他核苷酸相比，Ｔ在环糊精中的滞留时间为３倍。
胞嘧啶（Ｇ）和停留时间也不同。
因此，每个基因和当前的干扰幅度是唯一的。
此外，由于Ｃ－甲基化在环糊精中的停留时间大约为正常Ｃ停留时间的２倍之久，所以Ｃ－纳米孔单分子序列的甲基化可以以９９．９％的准确度直接读出，而无需重复测序孔快速去除。
测序技术的发展及其优缺点ＤＮＡ测序是基因诊断史上具有里程碑意义和划时代意义的技术革命，被称为基因诊断的黄金标准。
桑格在１９７７年发明了基因测序技术以来，基因测序技术诞生已经有４０多年，它广泛应用于遗传病的基因诊断和产前／植入前诊断，特别是单基因疾病。
２００７年，罗氏公司伊利米纳公司和ＡＢＩ公司发明了高通量测序技术，即下一代测序技术。
然而，测序技术的发展至今仍未停止，以单分子实时测序和纳米孔技术为标志的第三代测序新产品也进入了历史阶段。
优点。
（１）ＤＮＡ聚合酶的反应迅速，能较好地实现基本的测序技术，可在１秒内测量１０个核苷酸。
测序速度为化学测序的速度的二万倍。
（２）ＤＮＡ聚合酶反应具有持续性，可以进行长时间的基因测序，这种技术可以用来测量数千个碱基。
高精度，高达９９．９９９９９９％。
这将大大减少体外转录。
（３）基因聚合酶能够测出不同基因序列，基于时间差异，可以确定模板Ｃ是否被甲基化。
可以获得许多重要的突变，节省项目成本。
（４）挖掘ＤＮＡ突变和来源的频率，验证率很高。
（５）基因测序技术能够有效的预防癌症的发生。
（６）区分正常和癌症遗传变异水平。
（７）基因组测序，因为它读取时间长，可以精确预测癌细胞的减少数量。
在基因组测序中，重叠群测序重叠群（重叠后）显着减少了随后的基因组装配和注释的工作量，节省了大量时间。
它比ＮＧＳ快得多。
因此，基因组测序和表征被广泛用于细菌和病原体。
单分子测序的优点在突变或ＳＮＰ鉴定的病理学检测中是无与伦比的。
分子生物学中的基因组测序技术
分子生物学中的基因组测序技术基因组测序技术是分子生物学领域中一项重要的技术，它可以揭示生物体内所有基因的序列信息。
过去几十年来，基因组测序技术取得了巨大的进展，从最初的手工测序到现在的高通量测序，不断推动了生物学研究的发展。
一、测序技术的发展历程基因组测序技术的发展经历了多个阶段。
最早的手工测序方法是由Sanger等人于1977年提出的，这种方法通过DNA链延伸的方式逐个测序碱基，虽然耗时费力，但是奠定了测序技术的基础。
随着PCR技术的发展，测序方法也得到了改进，如荧光标记测序、自动测序仪的出现，大大提高了测序效率。
2005年，第一代高通量测序技术（NGS）问世，其通过并行测序数百万个DNA片段，大大提高了测序速度和效率。
二、第一代高通量测序技术第一代高通量测序技术的代表是Roche 454测序仪、Illumina测序仪等。
这些技术利用DNA聚合酶合成DNA片段的特性，通过不断地循环DNA合成、荧光标记和图像获取，最终得到DNA序列。
第一代高通量测序技术的优点是测序长度长，可以达到几百个碱基，但是其缺点是测序错误率较高，且成本较高。
三、第二代高通量测序技术第二代高通量测序技术的代表是Illumina HiSeq测序仪、Ion Torrent PGM测序仪等。
这些技术利用DNA链延伸的方式进行测序，通过不断地添加碱基、荧光标记和图像获取，最终得到DNA序列。
第二代高通量测序技术的优点是测序速度快，成本低，但是其缺点是测序长度短，通常只有几十个碱基。
四、第三代高通量测序技术第三代高通量测序技术的代表是PacBio测序仪、Oxford Nanopore测序仪等。
这些技术利用单分子测序原理，直接测序DNA分子的碱基序列。
第三代高通量测序技术的优点是测序长度长，可以达到几万个碱基，且不需要PCR扩增，但是其缺点是测序错误率较高。
五、基因组测序技术的应用基因组测序技术在许多领域都有广泛的应用。
在医学领域，基因组测序可以用于疾病诊断、个体化治疗等。
一代、二代、三代测序技术
三代基因组测序技术原理简介摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。
虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。
测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。
在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。
图1：测序技术的发展历程生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。
以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。
第一代测序技术第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。
自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。
研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。
在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。
这个网址为sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。
值得注意的是，就在测序技术起步发展的这一时期中，除了Sanger法之外还出现了一些其他的测序技术，如焦磷酸测序法、链接酶法等。
第四代测序技术名词解释
第四代测序技术名词解释
第四代测序技术是指一种高通量测序技术，它在DNA或RNA测序过程中采用了新的方法和技术。
这些技术相对于前几代测序技术有着更高的效率、更低的成本以及更快的速度。
第四代测序技术通常包括单分子测序、纳米孔测序和光学显微镜测序等多种方法。
单分子测序是指直接在单个DNA或RNA分子上进行测序，而不需要进行PCR扩增或克隆步骤。
这种方法可以避免PCR引入的偏差和错误，提高了测序的准确性。
纳米孔测序利用纳米孔来单个分子进行测序，通过测量分子在纳米孔中的电导率变化来确定碱基序列。
这种方法具有高通量、快速和低成本的特点。
光学显微镜测序利用光学显微镜对DNA进行观察和测序，通过观察DNA链的生物发光或荧光信号来确定碱基序列。
这种方法具有高分辨率和快速测序速度的优势。
总的来说，第四代测序技术在提高测序效率、降低成本、提高
准确性和加快测序速度方面都取得了显著的进展，为基因组学研究和临床诊断提供了强大的工具。
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荧光测序DNA序列信息转换成两种颜色的图形信
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缺陷
点。因为速度太快，检测的信号质量就不高，甚至很多小 的信号根本就检测不到。在120mV的条件下，DNA会 以每个碱基/1μ s~20μ s的速度通过α 溶血素纳米孔。 这就需要探测器的检测带宽达到MHz级，才能检测到皮安 级的电流强度。 当DNA在电泳作用下通过纳米孔时，由于扩散作用的影响，降低了测序的质量。由于DNA分子的随机 运动使 得它通过纳米孔的时间，即通过时间的跨度非常大，因此，人们无法判断有多少碱基通过了纳米孔。而且，由于 跨孔DNA分子与纳米孔表面间存在的 非特异性的相互作用还会受到非连续性的粘滑现象影响，所以相互作用会 发生改变。同一种碱基分子通过纳米孔时的通过时间也会不同。而且如果碱基分子通过纳米孔的时间小于平均通 过时间，那么它极有可能被漏检。 鉴于此，对于纳米孔测序技术来说，最为重要的一点就是如何控制并减慢DNA分子通过纳米孔的速度， 同 时尽量消除由于纳米孔表面相互作用给DNA分子跨孔动力学上造成的波动现象。降温和增加溶液的粘稠度 可以 在一定程度上减慢DNA分子通过纳米孔的速度，但这两种方法都不能消除因纳米孔表面相互作用造成的跨孔动力 学波动现象。
纳米通道(nanopore)是1999年由美国加州大学的Deamer和哈佛大学的Brant 组共同提出的，是指由7聚体的a溶血素(aHL)在双层脂膜上形成的直径在 (1．5～2．6)nm通道。左膜通道最窄处直径尺寸约为1.5 nm, 恰好允许单链 DNA分子通过, 并且大小严格一致，从本质上说是一种离子通道．核酸外切 酶附着在碱基表面将落入的孔的一侧的外表面，而让一种合成的环糊精作为 传感器共价结合到纳米孔的内表面，将这个系统镶嵌在一个脂质双分子层内。 为了提供既符合不同碱基检测又满足外切酶活性的物理条件，须事先将脂质 双分子层，调为不同的盐浓度。在合适的电压下，核酸外切酶消化单链DNA， 单个碱基落入孔中，并与孔内的环糊精短暂作用，从而影响流过纳米孔的电 流。
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电容检测法
隧道电流对DNA分子经过电极时的位置、方向十分敏 感,所以即使非常微小的差异也会引起隧道电流的变化, 如 何控制DNA分子准确、单一方向地通过纳米孔也很难。 电容检测法作为一种可能的电学解决方案,也有研究者 对此进行了研究,当单个碱基通过纳米孔时,其自身所带电 荷会引起纳米电容上的电荷量发生变化,从而可以检测到电 压的变化,理论上4种不同的碱基所带电荷不同,引起的电压 变压也会有所差异,因此可以用于DNA的测序.在绝缘体上 硅衬底上制作出poly-SiO2-Si结构的纳米电容,来检测碱 基通过纳米孔时引起的电压波动, 通过仿真验证了采用电 容的电压波动分辨单个碱基信息的可能性,通过仿真给出了 C, A, T, G 4种碱基单独穿越纳米孔时引起的电压波动的变 化。可以看出, C, A, G 3种碱基的电压曲线较为相近,有一 个峰值和一个谷值,与单个偶极子穿越纳米孔引起的电压波 动类似,而T的电压曲线可区分度较高,有1个峰值和2个谷值. 图中得到的结果是脱离DNA骨架的单个碱基得到的结果, 实际在测量单个碱基过程中得到的电压值会受到DNA骨架、 附近碱基和溶液离子的影响, 因此在碱基识别的准确度上 还有很多需要研究的问题.
1，DNA高速通过纳米孔的特性使得高速测序成为可能，但同时这种高速度也正是很多纳米孔测序技术的弱
2，溶血素七聚体是最常用于在脂质双分子层中制造生物纳米孔的材料，它性质非 常稳定。但脂质双分
子层的性质却不那么稳定，尤其是液态脂质双分子层，制造起来极难且费时。 使用离子束雕刻、电子束钻孔和原子层沉积等方法可以在氮化硅、氧化硅或其它金属氧化物等介质上“制 作出”稳定的、有功能的固态纳米孔，不过要得到直径在1.5nm~2.0nm的纳米孔芯片还是一件非常困难 的工作。现在，人们已经可以制作出 装载有用于检测隧穿电流探针的纳米孔，但是目前的纳米孔制作工艺 非常繁琐，速度慢又耗费人力，而且制 作出的产品还常常无法达到应用的要求。
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息，然后再通过光学读出技术进行检测、分析。然而， 要将荧光探 针标记到DNA链中的每一个碱基上是非常 困难的工作。于是人们开发出了一种新的方法，使用合 成DNA和光读取技术测序。待测DNA链中的每一个核 苷酸都被替换成更长的由橙色和蓝色碱基组成的寡聚体， 每一个待测核苷酸都被12bp的寡聚体替代。将这种转 换后的新 DNA链与分子信标杂交。杂交链在通过纳米 孔时分子信标会脱落，释放出荧光，读取这些荧光就可 以推测出原始 DNA链的序列。用两种不同的12 碱基寡 聚体（12-mer oligos）——A和B，按照四种不同的组 合方式（AB、BA、AA、BB）将A、B组合起来，这样 就可以对DNA链中的每一个核苷酸进行替换了。因为单 个核苷酸通过纳米孔的速度实在是太快了，完全无法进 行检测，所以将单核苷酸替换成这种长一点的寡聚体， 可以减缓通过速度，方便检测。同时，通过这种信号转 化还将DNA链中原本的四种信号A、T、G、C简化成了 A、B两种信号。挪威Lingvitae公司已经成功开发出了 一种自动化的、大规模并行处理方法。该方法可以在24 小时内将一个人类基因组序列转化成由24bp寡聚体序 列组成的“新”序列。
纳米孔基因测序技术
巴德年医学1501 王世瑀
Байду номын сангаас
基因测序
第一代基因测序：Sanger
测序采用的是直接测序法，Sanger 测序目的是寻找与疾病有关的特定的基 因突变。但是对于没有明确候选基因或候选基因数量较多的大样本病例筛查是难以完成的，而且其只能在 PCR扩增后测序。而且只能逐段测序，分析单个DNA片段。测序成本高，数据分析量大，自动化程度不高。 另外，此法，速度慢，时间长。
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前提条件：（ⅰ) 每个核苷酸都有其特有的电流阻塞信号; (ⅱ) 纳米孔具有合适的几何尺寸,
一次只容纳一个碱基通过; (ⅲ) 电流分辨率足以检测核苷酸的移动; (ⅳ) 核苷酸分子的运动 必须是单向的; (ⅴ) 纳米孔与薄膜之间的组合应当足够牢固以适应实验所需的温度和化学环境. 薄膜将溶液分为2个区域, 薄膜上的纳米孔作为连接2个区域的导电通道. 在薄膜的两侧加上偏置电压, 溶液中的离子在电压作用下经过纳米孔产生离子电流, 在外部条件不变且无DNA分子通过纳米孔的情况 下, 该电流是稳定的. DNA分子在驱动电压作用下单向通过纳米孔通道时, 在合适的电压下，核酸外切 酶消化单链DNA，单个碱基落入孔中，并与孔内的环糊精短暂作用。 由于碱基阻塞了通道导致流经纳米 孔通道的离子流量减小, 因此可以观察到离子电流的减小. 离子电流可以通过偏置电压乘以总电导的 方式求得.腺嘌呤A与胸腺嘧啶T的电信号大小很接近，但T在环糊精停留的时间是其他核苷酸的2到3倍， 鸟嘌呤G和胞嘧啶C各自停留的时间也不同，所以每个碱基都有特有的电流干扰振幅而区分开来。另外甲 基化的c在环糊精的停留时间为正常c在环糊精的停留时间的两倍，所以通过纳米孔检测还可以直接读取 甲基化的c
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英国牛津纳米孔公司最新研发出第三代基因测序技术，这项新 的基因测序技术采用纳米孔单分子读取技术
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工作原理
对DNA进行生物或化学处理,而采用物理办法直接读出DNA序列.其原理可以简单的描述为: 电 泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔。单个碱基通过纳米尺度的通道时, 会引起通 道电学性质的变化.理论上, A, C, G, T 4 种不同的碱基化学性质的差异会导致它们穿越纳米孔 时引起的电学参数的变化量也不同, 对这些变化进行检测可以得到相应碱基
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THANKS
谢 谢 聆 听
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MinION的尺寸之小，只有一支笔的长度，重大约100克，MinION完全颠覆 了测序仪的形象，MinION直接通过USB链接到笔记本上，原始的电流信号通 过网络传到英国的服务器上，进行读取。一个MinION有500个纳米孔在并行 测序，每个孔每秒测30bp，因此，要测到1G的数据，需要3天时间。
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纳米孔
尺寸有着近乎苛刻 的要求. 生物纳米孔
前言：DNA链的直径非常小(双链DNA直径约为2 nm, 单链DNA直径约为1 nm), 所以对所采用的纳米孔的
固体纳米孔
固态纳米孔主要是利用硅及其衍生物制造而成, 一般使用离子束或电子束在硅或其他材料薄膜表面 钻出纳米尺度的孔洞, 再进一步对孔的形状和大小 进行修饰而成. 相比于生物纳米孔, 固态纳米孔在 稳定性、电流噪声、工艺集成方面有着显著的优势, 但是因为受限于如今的半导体工艺制造水平, 固态 纳米孔的制造还较为复杂与昂贵.
第二代基因测序第二代测序技术测序平台和测序成本仍然十分高昂，仪器普遍高达40-70 万美元，而一个全基因组测序至少需要2000-5000美元，同时花费几周的时间；第二代测序 技术依赖于基因样品的扩增过程，大量的洗脱过程即增加了成本和样品制备的时间，也容 易出现错误累积；第二代测序技术普遍读长为150-400bp，无法满足更高的科研需要；大量 的数据拼接工作和光学读取导致的大体量数据，让分析变成了耗时耗力的工作。
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总结
尽管离纳米测序完全投入商业化还有一段距离，但是我们可以预见，一旦其技术条件完全成熟，为人类 的基因测序带来的改变是巨大的。纳米孔测序技术在成本、速度等方面有着十分巨大的优势。不需要借 助PCR扩增、多聚酶、连接酶等就能进行测序，而且测序的长度可以达到10,000~50,000 nt。一个成 功的纳米孔测序仪其测序费用应该非常低廉，极有可能达到NIH设定的只用1,000美元就能 完成个人基 因组测序的目标。同时，纳米孔测序仪本身不会太贵。如果能在一个测序芯片上整合100个纳米 孔以及 相应的微流体系统和电子探针系统，那么对一个人类基因组进行六倍覆盖率的测序也只需要一天的时间