BHK-21传代细胞培养
BHK细胞培养技术
BHK-21（幼仓鼠肾传代细胞）一、细胞复苏：1、从液氮罐取出一支装有BHK-21的细胞冻存管，用镊子立刻将冻存管置于37℃水浴箱中融解，将冻存管盖口以下面积浸入水中，不时摇动冻存管加速融化，直至管内冰块融化，约1~2min。
2、将融化后的冻存管放入超净台中。
取出一支15ml离心管，加入6ml DMEM(低糖培养液)，用1000µl移液枪移取全部冻存管内细胞液至离心管中，盖上离心管盖，轻轻上下颠倒混匀后离心（800r/min，5min）。
3、用移液枪将液面气泡吸走，倒去上清液。
4、加入2ml生长液（10% FBS(胎牛血清)，89% DMEM，1% 双抗（青霉素+链霉素）），用移液枪吹打均匀。
5、用移液枪将生长液移至25cm2细胞培养瓶中，补加4ml生长液。
6、盖上透气滤膜盖，置于37℃、CO25%培养。
备注：1、细胞复苏后5h，镜下观察细胞已贴壁，贴壁细胞密度50%~60%。
二、细胞换液（复苏后24h换液）1、取出细胞，镜下观察，细胞已长至80~90%，有部分细胞漂浮在培养液中。
2、倒去培养液，加入6ml生长液（10% FBS（胎牛血清），89% DMEM（低糖培养液），1%双抗），盖上透气滤膜盖，置于37℃、CO2 5%培养。
备注：1、一般复苏后的第一天（24h）需换液，复苏后第二天（48h）才能考虑传代，若没有传代，第三天（72h）必须传代。
2、处理过程不需用PBS（磷酸盐缓冲液）或HASS洗涤，因细胞刚复苏，不需过多处理细胞。
三、细胞传代（复苏后48h传代）1、镜下观察，细胞已长满整个细胞瓶底，有部分细胞漂浮。
2、倒去培养液，用移液枪吸取1ml PBS或HASS，沿培养瓶细胞对侧壁加入洗液，盖上盖子，轻摇瓶子让洗液洗涤整个瓶壁。
后续过程。
1200L反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒技术
1200L反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒技术一、技术背景国内口蹄疫布控形势仍严峻，高效、安全的病毒性疫苗是防止口蹄疫情发生的最有效方法。
BHK21细胞是繁殖FMDV的理想宿主，国外普遍采用了2000－5000L 反应器悬浮培养BHK21细胞技术生产口蹄疫苗。
目前国内主要通过大规模转瓶培养BHK21细胞生产口蹄疫苗，仅一家单位已采用上千升反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫疫苗。
转瓶培养BHK21细胞生产口蹄疫苗工艺，因为每个转瓶均是独立的细胞培养单元，每瓶的细胞质量、病毒产量和滴度都不同，导致疫苗批间差大，隐性污染引起高内毒素，副反应大等缺点。
反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫苗工艺，不仅能提高BHK21细胞密度，自动监控细胞生长或病毒繁殖时的最适生化条件，提高病毒滴度，而且工艺规模放大相对容易，管道化操作最大可能避免了污染的发生，能显著提高口蹄疫疫苗的质量。
MMBS已成功开发了BHK21反应器悬浮培养基、120L-650L-1200L反应器悬浮BHK21细胞技术、1200L反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫疫苗工艺等关键技术，为反应器生产口蹄疫疫苗的产业化奠定了扎实的技术基础。
二、工艺技术1200L反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒工艺：利用BHK21悬浮培养基从液氮中复苏已适应悬浮培养的BHK21细胞株，种子细胞经摇瓶、5L反应器、120L反应器和650L反应器等逐级放大培养，最后在1200L反应器中悬浮培养BHK21细胞至合适密度，接种口蹄疫病毒种毒，维持一定的溶氧、pH值、温度等工艺参数，适时收获一次性收获培养液,制备成苗。
图1表示了反应器悬浮培养BHK21细胞的照片，细胞密度可以达到3×106cells/ml左右以上。
图2表示了悬浮培养的BHK21细胞接种口蹄疫病毒14hr 后的BHK21细胞。
从反应器中收获上清的口蹄疫病毒抗原量（146S完整病毒粒子）高于转瓶培养工艺。
单一血清和混合血清培养BHK21细胞的比较研究
（ 中农 威特 生物 科技 股份 有 限公 司 ， 兰州
７ ３ ０ ０ ４ ６ ）
摘
要： 本试验 用单一血 清和 混合血清对幼年叙利亚地鼠 肾（ Ｂ Ｈ Ｋ ２ １ ） 细胞进 行 了培
养， 显微镜观察细胞的生长状况， 并用细胞计数仪对相应的细胞进行计数及活力测定。结果 表明， 在同一时间含 有 ５ ％的 ４ 种混合血清的低血清培养基培养的 Ｂ Ｈ Ｋ ２ １ 细胞比同一浓度
ｓ ｉ ｎ ｇ ｌ ｅ ａ ｎ ｄ ｐ ｏ ｏ ｌ ｅ ｄ ｓ ｅ ｒ ｕ ｍ． Ｔ ｈ ｅ ｇ ｒ ｏ ｗ ｔ ｈ ｓ ｔ ａ ｔ ｕ ｓ ｏ ｆ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｗ ｅ ｒ ｅ ｏ ｂ ｓ ｅ ｒ ｖ ｅ ｄ ｕ ｎ ｄ ｅ ｒ ｔ ｈ ｅ ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｓ ｃ ｏ ｐ ｅ ． Ｃｅ ｌ ｌ ｃ ｏ ｕ ｎ ｔ ｅ ｒ ｗａ ｓ ｕ ｓ ｅ ｄ ｔ ｏ ｃ ｏ ｕ ｎ ｔ ｔ ｈ ｅ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ａ ｎ ｄ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｃ ｅ ｌ ｌ ｖ ｉ ａ ｂ ｉ ｌ ｉ ｔ ｙ ．Ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ｓ ｈ ｏ ｗｅ ｄ ｔ ｈ ａ ｔ ，ａ ｔ ｔ ｈ ｅ ｓ ａ ｍｅ
的任何 一 种 单一 血 清培养 的 细胞 形 态更好 ， 细胞 活 力更 高 。
关键词 ： 混合犊牛血清； 单一源自牛血 清； Ｂ Ｈ Ｋ ２ １ 细胞 ； Ｍ Ｅ Ｍ Ｓ Ｌ Ｍ低血清培养基
Ｃｏ ｍｐ ａ ｒ ａ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ｏ ｆ Ｃｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｉ ｎ ｇ ＢＨＫ２ １ Ｃｅ ｌ ｌ ｓ ｉ ｎ Ｓ ｉ ｎ ｇ ｌ ｅ ａ ｎ ｄ Ｐｏ ｏ ｌ ｅ ｄ Ｓ ｅ ｒ ｕ ｍ
Ｋｅ ｙ Ｗｏ ｒ ｄ ｓ ： ｐ ｏ ｏ ｌ ｅ ｄ ｃ ａ ｌ ｆ ｓ ｅ １ ３ ． １ ｍ ；ｓ ｉ ｎ ｇ ｌ ｅ ｃ ａ ｌ ｆ ｓ ｅ Ｉ ＇ ｕ ｍ ；Ｂ ＨＫ ２ １ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ；ＭＥＭ Ｓ Ｌ Ｍ ｌ ｏ ｗ ｓ ｅ ｎ ｌ ｍ ｃ ｕ ｌ —
管道化培养与常规转瓶培养BHK21细胞的比较与分析
分 液硅 胶 管 ， 将 细胞 液通过 分液 硅胶 管 流入带 有管
道 的空 瓶 中 ， 作 为下 一代 的种 细胞 。
１ ． ４ ． ５ 制作好 的 带管 道 的种 细 胞 ， 拔 掉胶 塞上 的
不 锈钢 短 管 封堵 塞 ， 倾 倒 细 胞 废 液 后 用 封 堵 塞 封
中图分类号 ： ￥ ８ ５ ４ ． ４ ３
文献标识码 ： Ｂ
文章 编 号 ： １ ０ ０ ２— ５ ２ ３ ５ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ５— ０ ２ ４ ０— ０ ３
摘要 ： 本试 验在 常规 转瓶 培 养 Ｂ Ｈ Ｋ ２ １细胞 的基 础上 ， 推 出管道化 培养 Ｂ ＨＫ ２ １ 细胞， 旨在 控制 污染 ， 提升 产 品质量 。通过此工 艺 的革新 ， 在 降低 细胞 污染 率 和淘
数 量 和容 积外 ， 使 瓶 直 径尽 可 能小 ， 此 时表 面面 积 可 因直 径 或长度 的倍 增 而成倍 增加 。 所 谓 管道化 细胞 培 养 即 在 常规 转 瓶 细 胞 封 口 的胶塞 上安 装一 个 不锈钢 长 管和一 个不 锈钢 短 管 ， 管 口分 别用 封 口塞 密 封 ， 在细胞制备整个过程中，
出。
Ｂ Ｈ Ｋ ２ １细 胞 Ｆ ３ ８ ， Ｆ ８ ， Ｆ ５ ６ ， 使用 ５ ０ ％ ＭＥ Ｍ＋ ５ ０ ％乳 汉液 加 １ ０ ％ 新生 牛 血清 传 统 培养 基 按 常 规
组 织培 养法 进行 培养 和传 代 。
收 稿 日期 ： ２ ０ １ ５一 Ｏ ７一ｌ Ｏ
１ ． ４ ． ７ 拔掉 不锈 钢 长 管 封 堵 塞 ， 将 胰 酶打 入 带 管 道 的种 细胞 瓶 内正常 消化 ， 从短 管倒 出胰 酶加 上封
悬浮培养型bhk-21细胞生长特性 及成瘤性研究
２１ 细 胞 系 易 悬 浮 培 养 １４ １５ ,其 适 宜 大 规 模 培 养 １６ ．但 细 胞
成瘤性是限制细胞生产应用的主要因素之一 ．
细胞的成瘤性是指将完整的活细胞注入裸鼠、仓鼠或新生小鼠中能形成进行性肿瘤的过程 ．作为疫
苗生产的细胞基质,
BHKＧ
２１ 悬浮细胞成瘤性一直备受关注 ．驯化的悬浮培养型 BHKＧ
２１ 细胞、阳性细胞组(
He
l
a)和阴性细 胞 组 (
KMB１７)(
P ＞０．
０５),裸 鼠 成 瘤 体 积 增 长 率 均 高 于 其 他 三 组 (
P＜
０
０５)．结论:驯化的悬浮培养型 BHKＧ
２１ 细胞能显著提高细胞密度,其成瘤性方面还需进一步改善 ．
[关键词] 驯化后悬浮培养型 BHKＧ
２１ 细胞;贴壁培养型 BHKＧ
第 40 卷总第 116 期
2019 年 12 月
西 北 民 族 大 学 学 报
（ 自 然 科 学 版 ）
Ｊournal of Northwest Minzu University （Natural Science）
Vol.40,No.4
Dec ，2019
悬浮培养型 BHKＧ
２１ 细胞生长
[中图分类号]Q８１３．
１ [文献标识码] A [文章编号]１００９
Ｇ
２１０２(
２０１９)
０４
Ｇ
００５３
Ｇ
０７
[]
幼年叙利亚仓鼠肾细胞(
Baby Hams
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e
rSy
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BHKＧ
２１)由 Ma
cphe
BHK-21传代细胞培养
BHK-21 传代细胞培养BHK 是仓鼠肾细胞［原理］细胞在培养瓶壁上长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
［材料和试剂］1、细胞：贴壁BHK-21 细胞株2、试剂：0.25％胰蛋白酶、配制好的DMEM 培养液、小牛血清、双抗溶液、7.5%碳酸氢钠3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、胶塞、量筒、注射器、针头、酒精灯、污物缸等［操作步骤］1、应需要计算好培养液的总用量，按10%的比例加入血清，按1%的比例加入双抗。
用7.5%的碳酸氢钠调PH 至7.0~7.2 左右。
2、将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。
3、加入0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中为宜。
4、瓶口塞好胶塞，平放在实验台上。
约2~3 分钟会看到贴壁细胞层出现细针孔空隙，赶紧将胰酶弃去，加入少量培养液终止消化。
5、用注射器将贴壁的细胞反复吹打，使其均匀分散成悬液，再加入足量的培养液，分成两到三瓶。
塞好胶塞，置37 C温箱中继续培养。
细胞培养常用溶液的配制青、链霉素溶液青霉素钠盐（80万IU /瓶）5瓶链霉素（100万IU /瓶）4瓶将两者溶于400ml0.9 %的无菌生理盐水，分装小瓶，-20C保存。
双抗在培养基中的终浓度为100IU/ml 为宜。
二、7.5%碳酸氢钠溶液的配制称取碳酸氢钠7.5g ，加入超纯水使总体积为100ml 。
高压灭菌，分装于小瓶中，4C 贮存。
三、1%酚红溶液的配制首先配制1mol/L的NaOH溶液。
称取NaOH4.0 g,加入100ml超纯水，使NaOH 完全溶解，在室温或4C贮存（最好现用现配）。
配制好NaOH溶液后，再称取1.0 g酚红置研钵中，加1mol/L的NaOH （不多于7.0ml），研磨使酚红完全溶解，加超纯水至100ml,高压消毒，在室温或4 C贮存。
细胞培养与病毒培养实验步骤
实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养一、实验目的了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。
二、常用细胞的种类BHK-21：仓鼠肾传代细胞PK-15：猪肾传代细胞IBRS-2：猪肾传代细胞Hela：人的子宫瘤细胞Vero：非洲绿猴肾细胞Marc-145：来源于Vero细胞TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞Sf9：昆虫细胞三、材料1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞3、0.25%胰酶4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM5、伪狂犬病病毒液（PRV）四、传代细胞培养的条件要求1）细胞密度：2-3×105个/ml2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.83）培养温度哺乳动物细胞一般为37℃昆虫细胞28-30℃五、常用细胞分散剂与作用原理1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。
2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。
3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。
六、营养液1、人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。
2、血清1）血清的种类胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。
2）血清的处理无菌采集，过滤除菌。
用前56℃灭活30min。
3）血清的作用A、能提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子。
B、能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。
C、含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基质成分。
悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫疫苗现状及其关键技术
项目技术资料
1. 650L/4000L 反应器悬浮培养BHK21 细胞生产口蹄疫病毒总结报告 2. 650L /4000L 反应器悬浮培养BHK21 细胞生产口蹄疫病毒工艺规程 3. 5/10L 反应器悬浮培养BHK21 细胞操作规程 4. 120L 反应器悬浮培养BHK21 细胞操作规程 5. 650L /4000L反应器悬浮培养BHK21 细胞操作规程 6. 650L/4000L 反应器悬浮培养BHK21 细胞生产口蹄疫病毒操作规程 7. 650L /4000L 反应器悬浮培养BHK21 细胞生产口蹄疫病毒技术要点 8. 各级反应器细胞培养记录 9. 650L/4000L 反应器口蹄疫病毒培养记录
三、无血清悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫交钥 匙工程
工艺技术转让 验证和培训 指导客户生 产
反应器悬浮 生产线建设
生产线建设与工艺过程
生产线建设与工艺过程
生产线的布
局、建设主 要取决于产
品生产的工
艺模式和规
模
项目流程
业务接洽 了 解 需求 和 项目可行性
•项目目标 •反应器培养规模 •预期产业化规模 •反应器培养基础 及配套条件 •建立细胞库和病 毒库 •病毒检测的条件 和经验 ……
能源 成本
原料成本 原料种类少，配制差错率低，更容易 集中配制； 反应器无血清悬浮培养，不仅成本低
反应器无血清悬浮培养 培养基等2种
而且对抗原后期纯化难度下降，并且极
大地减弱了产品的不良反应；
原料种类
反应器低血清悬浮 培养 4种 转瓶培养 培养基、血清、水解 乳蛋白等10余种
据统计，反应器低血清悬浮产1000L 培养基、血清等约 病毒原液的成本仅为转瓶培养方式相同 产量的50%。
浅谈建立生产用BHK-21种细胞库的措施
为劣药。
② 粉针剂。主要是青霉素 、 链霉素等抗生素药品。 正常的粉
书。标签或说 明书上必须有注册 商标 、 兽药名称 、 规格 、 企业名 重 、 潮解或液化以及变色的 ， 说明药品已变质。 称 、 品批号和批准文号 、 产 主要成份 、 含量 、 作用 、 用途 、 用法 、 用
Ｉ ‘ ．止 Ｉ ‘ Ｌ 』 Ｌ ５ Ｉ Ｉ Ｌ Ｌ ＬＩ ‘ ｊＩ － Ｌ Ｌ 舢 ． Ｌ． 吐 ＳＩ ｓ Ｓ ．
ａ澄明度检查。水针剂除特殊 品种有规定外应均匀 、 明。 ． 澄
（ 查兽药名称。兽药名称包括法定名称（ ４ ） 国家标准、 专业标 准、 地方标准中收载的兽药名称） 和商品名， 兽药法定名称不得作
为商标注册。兽药产品标签、 说明书、 外包装必须印制兽药产品 若 出现浑浊 、 沉淀、 絮状物或其它可见异物等 ， 明药品已变质 。 说
库不仅能避免这种影响， 而且不会使前期传代工作白废。 生产中 液氮。迅速溶化可防止损害细胞， 故复苏时， 对取出的冷冻管须
种细胞应每隔 ５ ７ — 代进行冻存一次。
２４保持相对稳定的培养条件 ．
立即放入 ３ ℃水浴速溶， ７ 轻摇冷冻管使其在 １ ２ ｉ大部分融 ～ ｎ ｍ
化， 需残留一小块冰块。
。
～
２
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” … ～ 一 。 Ｌ
蔷
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７ ６一
围 技一 禽 学 轱占
秀殖户如何瑰场ｉｇ 假 兽药 Ｐｌ ，
无血清培养基悬浮培养BHK21细胞驯化的研究
草食 家畜 （ 双 月刊 ）
无血清培 养基悬 浮培 养 Ｂ ＨＫ２ １ 细胞驯化 的研 究
井莲娜 ， 付 智财 ， 黄 炯 （ １ ． 新 疆 天康畜 牧 生物技 术 股份有 限公 司， 新疆 （ ２ ． 新疆 畜 牧科 学 院兽 医研 究 所 ， 新疆 乌鲁 木齐 ８ ３ ０ ０ １ １ ）
缓 降方 式 比速 降方 式适 应性 要 好 ， 细胞 的形 态较好 ， 活 力在 ９ ０ ％以上 。 细胞从 低 血 清悬 浮到 无血 清 悬 浮
过 程 中， 两种过 渡 方式 无 明显差 异 ， 均经过 了 ５ － １ ０代 驯化 ， 细胞 就 完全 适应 了无 血清 悬浮培 养基 。 无 血 清
悬 浮细胞 从 液 氮 中复 苏后 ， 采 用直 线放 大的形 式从 １ ． ５ ｍ Ｌ到 ２ ５ ０ ｍ Ｌ再 到 ５ Ｌ反 应 器最后 到 ６ ５ ０ Ｌ反 应
器 中生 长。在 培 养参数 方 面进 行 了摸 索 ， 最终验证 用直线放 大的方法是 可行 的 。细胞数 量可达 ４ ． ５ ￣ １ ０ ６ ／ ｍＬ 左右 ， 细胞 活 力在 ９ ０ ％以上 ， 且 细胞 在 放 大过程 中 ， 形 态 良好 ， 倍增 时间稳 定在 １ ８ ｈ 。 关 键词 ： 无血 清悬 浮培 养 ； Ｂ ＨＫ ２ １ ； 驯 化
代 的传代 后 ， 细胞在 无 血 清悬 浮培 养基 中 生长 细胞 数 量 可达 ３ ． ０ ｘ ｌ ０ ／ ｍ Ｌ以上 ， 且 形 态较好 ， 倍 增 时间稳
定， 活 力在 ９ ０ ％以上 。 实验 中采 用速 降和 缓 降两种 方 法进 行过 渡 驯化 ， 结果表 明 ， 在 贴壁 状 态下 ， 细胞 对
BHK21细胞的悬浮驯化及其悬浮培养参数研究
BHK21细胞的悬浮驯化及其悬浮培养参数研究作者：田波尚勇良武发菊安芳兰万玉林刘学荣杨进才来源：《安徽农业科学》2014年第31期摘要 [目的] 探讨各种悬浮培养条件对BHK21细胞悬浮培养的影响，尤其是细胞生长过程中出现的细胞结团现象对细胞生长状态的影响，从而摸索出稳定的培养条件。
[方法]将BHK21细胞株进行悬浮驯化培养，通过对悬浮培养的培养液、pH、溶解氧、罐压、搅拌等各种细胞相关生长条件进行研究。
[结果] 细胞的结团严重影响了细胞的生长代谢。
最佳培养条件为最佳接种浓度0.2×106个/ ml，牛血清的最佳含量为5%，BHK21细胞培养液理想pH为7.0～7.2，采用2孔通气的100 r/min有利于BHK21细胞的生长。
[结论] 为体外规模化细胞培养平台奠定理论基础。
关键词 BHK21细胞；细胞驯化；悬浮培养中图分类号 S188 文献标识码A 文章编号 0517-6611（2014）31-10855-03Study on BHK21 Cell Suspension Adaptation and Culture Parameters in Suspension ConditionTIAN Bo1，2， SHANG Yongliang2，WU Faju2， LIU Xuerong2* et al （1.Gansu Agricultural University，Lanzhou，Gansu 730000；2.Zhongnong Weite Biotechndogy Co.Led.，Lanzhou，Gansu 730046）Abstract [Objective] The aim was to discuss the effect of various cultivate condition on BHK21 cell suspension cultures，especially the effect of cell aggregation phenomenon of cell growth in the process of the cells growth state，and the stable culture condition were found out.[Method] The BHK21 cells were suspended domestication，cultivation of suspension culture by nutritive medium，pH，dissolved oxygen，tank pressure for mixing all kinds of cell growth conditions were studied.[Result] Cluster cells greatly influenced the growth of the cell metabolism.The best culture conditions were optimal inoculation concentration of 0.2×106 / ml，the best content of bovine serum 5%，the ideal BHK21 cell cultures of pH 7.0 - 7.2，the two ventilation hole 100 r/min speed of BHK21 cell growth.[Conclusion] The study laid a theoretical foundation for largescale cell culture in vitro platforms.Key words BHK21 cells； The cellular acclimation； Cell suspension culture随着兽用生物制品产业的发展，近年来动物细胞培养成为国内外研究的热点。
BHK—21细胞生物反应器悬浮培养参数研究
BHK—21细胞生物反应器悬浮培养参数研究作者：路明华刘俊生刘延亭张希娟王忠辉张二磊侯艳红来源：《中国动物保健》2015年第12期摘要：使用国产BC-7L生物反应器对BHK-21细胞悬浮培养参数进行了初步研究。
通过对培养液血清含量、pH、溶氧和搅拌转速逐一进行优化研究，最终确定了BHK-21细胞悬浮培养的最佳参数为：血清浓度为5%，pH为7.40、DO为50%，搅拌转速为100r/min。
关键词：生物反应器；BHK-21细胞；悬浮培养动物细胞培养在生物技术和生物医药研究中已得到了广泛的应用。
近几十年来，随着生物工程和组织工程学的发展，相应的生物反应器水平也在不断提高，现已研制出多种不同用途、型号的动物细胞生物反应器，其性能也日趋完善，种类越来越多，规模越来越大，在国外，已放大到5000 -10000L。
悬浮培养技术最大优势是通过更为精确有效的工艺控制手段，在获得最大产量的同时能稳步提高产品的质量。
由于动物细胞在悬浮培养过程中对培养基和培养条件要求很高，不易达到最佳生长状态，故本研究对生物反应器悬浮培养BHK-21细胞的培养条件进行了研究，以期使BHK-21细胞达到最佳生长状态，为后续规模化生产提供参考。
1 材料和方法1.1 实验材料BHK-21细胞，新生牛血清（四季青），DMEM（GBICO），NaHC03，消泡剂。
1.2 仪器设备BC-7L生物反应器，为广州齐志生物工程设备有限公司产品。
1.3 实验方法1.3.1 BHK-21悬浮细胞制备取BHK-21贴壁细胞种进行复苏，待细胞长满单层并生长状态良好时，用0.25%胰酶消化，之后用移液管轻轻吹打成单个细胞悬浮液，以0.5×106个/mL的密度接种300-1000mL摇瓶中，于90r/min恒温摇床培养。
连续培养5代后，进行上罐培养。
1.3.2 血清含量对悬浮细胞培养的影响将摇瓶BHK-21细胞以0.5×106个/mL的密度接种至5生物反应器中进行培养，培养过程中血清含量分别调整2%、5%、10%三个浓度进行培养，培养过程中对各浓度细胞取样计细胞数并观察细胞形态。
(整理)传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养.
实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养一、实验目的了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。
二、常用细胞的种类BHK-21：仓鼠肾传代细胞PK-15：猪肾传代细胞IBRS-2：猪肾传代细胞Hela：人的子宫瘤细胞Vero：非洲绿猴肾细胞Marc-145：来源于Vero细胞TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞Sf9：昆虫细胞三、材料1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞3、0.25%胰酶4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM5、伪狂犬病病毒液（PRV）四、传代细胞培养的条件要求1）细胞密度：2-3×105个/ml2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.83）培养温度哺乳动物细胞一般为37℃昆虫细胞28-30℃五、常用细胞分散剂与作用原理1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。
2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。
3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。
六、营养液1、人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。
2、血清1）血清的种类胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。
2）血清的处理无菌采集，过滤除菌。
用前56℃灭活30min。
3）血清的作用A、能提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子。
B、能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。
C、含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基质成分。
低血清培养的BHK21细胞染色体遗传稳定性分析
低血清培养的BHK21细胞染色体遗传稳定性分析陈苗苗;董金杰;杜平【摘要】目的:分析1种商业化的低血清培养基适应BHK21细胞进行传代培养,该细胞染色体的变异稳定性,以判定其质量.方法:采用直接法制取4个代次的BHK21细胞的染色体标本,用常规Giemsa染色,1 000倍光学显微镜下计数中期分裂相染色体数目,求出染色体变异率(％),并进行核型分析.结果:BHK21为亚二倍体或亚四倍体细胞系,亚二倍体众数为42,亚四倍体细胞众数为72～74,该细胞系染色体的畸变率在各代次所占的比例为0～2％,均较低.结论:用商业化的低血清培养基驯化培养BHK21细胞,逐渐降低培养液中血清含量,进行传代培养,通过选取不同代次细胞的染色体进行核型分析,该细胞系的遗传学特性相对稳定,各代次间无本质差异,可候选为制苗用细胞.【期刊名称】《贵州畜牧兽医》【年(卷),期】2016(040)004【总页数】4页(P9-12)【关键词】低血清;BHK21细胞;染色体;遗传稳定性【作者】陈苗苗;董金杰;杜平【作者单位】中农威特生物科技股份有限公司,甘肃兰州730046;中农威特生物科技股份有限公司,甘肃兰州730046;中农威特生物科技股份有限公司,甘肃兰州730046【正文语种】中文【中图分类】Q813.1+1BHK21是源于幼仓鼠肾的一种传代细胞系［1，2］。
由于BHK21细胞对口蹄疫病毒敏感，且又是口蹄疫病毒很好的宿主细胞，所以在口蹄疫疫苗生产中，都使用BHK21细胞对口蹄疫病毒进行繁殖。
无论是传统的转瓶工艺还是悬浮培养工艺，都以贴壁的BHK21细胞为驯化对象，由权威机构的ATCC保存的BHK21细胞，在其介绍中明确说明，此传代细胞遗传上具有一定的变异性。
为了能够保证口蹄疫病毒生产的高效性，保证宿主细胞的遗传稳定性则是重中之重。
目前能够检测细胞变异系数的有效方法就是核型分析，这是细胞遗传学及细胞生物学的核心基本技术之一。
这一技术可以用于研究细胞和组织及个体的特异性鉴定、遗传变异、种属进化关系。
BHK-21细胞库的建立及其生物学特性鉴定
Ｅｓ ｔ ａ ｂｌ ｉ ｓ ｈ ｍｅ ｎｔ ａ ｎ ｄ Ｉ ｔ ｓ Ｃｈａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ ｓ Ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｉｃ ｆ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ＢＨ Ｋ－ ２１ Ｃｅ ｌ ｌ ｓ Ｂａ ｎ ｋ
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bhk-21细胞
HK－21的经验：吸出培养基，吸得越干净越好，直接加入1ml胰酶（T－25瓶），放到37度培养箱消化。
是否需要用hanks 或 pbs之类得缓冲洗细胞并不绝对必要，我都没有洗，感觉应该洗一下更好，但也更麻烦并增加了污染得可能性。
如果细胞长得太老，可以先加入1ml胰酶在细胞表面浸润一下就吸出来，然后再加入1ml胰酶消化。
胰酶在使用前最好预热到37度。
由于胰酶平时保存在4度，反复预热对胰酶的活性不好，我的经验是将胰酶进行分装，尽可能避免胰酶反复冷却加热。
消化时间的选择要根据实际情况决定，BHK－21还是比较好消化的，5－15min应该足够了，消化时间太长对细胞不利。
可以在显微镜下观察消化情况，必要时可以拍打培养瓶帮助细胞分散，消化结束后直接加入培养基即可，胰酶会被血亲灭活。
一般在T－25瓶中留7－8ml培养基培养。
在90％单层细胞时，1：4传代2天后可长满。
如果使用的培养基偏碱最好先放在CO2培养箱中平衡。
细胞生长中注意观察培养基颜色（加入酚红作指示剂），如出现偏黄表明细胞代谢产酸较多，此时如细胞未长满应更换部分或全部培养基以确保细胞状态不受影响。
1.犬瘟热受体slam基因BHK21表达系建立细胞培养（1）BHK-21细胞复苏从液氮罐中快速取出冻存的BHK-21细胞，浸入37℃的恒温水浴箱内快速摇晃使细胞在60 s内完全融化;在超净台内用酒精棉球擦拭冻存管封口处及冻存管，打开盖，轻轻吹打细胞悬浮，吸出细胞悬液装入离心管中，补加培养液至10 ml,1 000 r/min低速离心10 min; 先用无菌吸管吸取5 ml含有10% FBS DMEM培养基至无菌25 cmz培养瓶内备用，弃去离心管中上清后加入2 ml含有10% FBSDMEM培养基轻轻吹打，混匀后将细胞移入培养瓶中，轻轻反复吹打使细胞在培养瓶中混匀，将培养瓶置于含37℃、5%的CO:细胞培养箱中孵育，次日换液去除DMSO，继续培养。
C 2 ) BHK-21细胞传代待BHK-21细胞生长至汇合度为80%以上时，吸弃培养液，加入1 ml 0.25%的胰酶，轻轻晃动使0.25%的胰蛋白酶均匀覆盖培养瓶，置于CO:细胞培养箱中孵育1}3 min，显微镜下观察细胞收缩变圆后立即吸弃胰酶液，加入3 ml含有10% FBS DMEM培养基，用无菌吸管将细胞吹打均匀;细胞吹打均匀后1传2进行分瓶，5%COz孵箱37℃培养。
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BHK-21传代细胞培养
BHK是仓鼠肾细胞
[原理]
细胞在培养瓶壁上长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
[材料和试剂]
1、细胞：贴壁BHK-21细胞株
2、试剂：0.25％胰蛋白酶、配制好的DMEM培养液、小牛血清、双抗溶液、7.5%碳酸氢钠
3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、胶塞、量筒、注射器、针头、酒精灯、污物缸等
[操作步骤]
1、应需要计算好培养液的总用量，按10%的比例加入血清，按1%的比例加入双抗。
用7.5%
的碳酸氢钠调PH至7.0~7.2左右。
2、将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。
3、加入0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中为宜。
4、瓶口塞好胶塞，平放在实验台上。
约2~3分钟会看到贴壁细胞层出现细针孔空隙，赶紧
将胰酶弃去，加入少量培养液终止消化。
5、用注射器将贴壁的细胞反复吹打，使其均匀分散成悬液，再加入足量的培养液，分成两
到三瓶。
塞好胶塞，置37℃温箱中继续培养。
细胞培养常用溶液的配制
一、青、链霉素溶液
青霉素钠盐(80万IU／瓶) 5瓶
链霉素(100万IU／瓶) 4瓶
将两者溶于400ml0.9％的无菌生理盐水，分装小瓶，-20℃保存。
双抗在培养基中
的终浓度为100IU/ml为宜。
二、7.5%碳酸氢钠溶液的配制
称取碳酸氢钠7.5g，加入超纯水使总体积为100ml。
高压灭菌，分装于小瓶中，4℃贮存。
三、1%酚红溶液的配制
首先配制1mol/L的NaOH溶液。
称取NaOH4.0g，加入100ml超纯水，使NaOH 完全溶解，在室温或4℃贮存（最好现用现配）。
配制好NaOH溶液后，再称取1.0 g 酚红置研钵中，加1mol/L的NaOH（不多于7.0ml），研磨使酚红完全溶解，加超纯水至100ml，高压消毒，在室温或4℃贮存。
四、0.25%胰蛋白酶溶液的配制
氯化钠8.0g
氯化钾0.2g
柠檬酸钠(Na3C6H5O7•5H2O) 1.12g
磷酸二氢钠(NaH2PO4•2H2O) 0.056g
碳酸氢钠 1.0g
葡萄糖 1.0g
胰蛋白酶（1：250） 2.5g
超纯水加至1000ml
放4℃冰箱过夜，待胰蛋白酶充分溶解后，用0.2um微孔滤膜过滤除菌，分装于小瓶中，-20℃保存。
四、GIBCO的低糖DMEM粉剂配制：
1.将干粉培养基倒入一干净的大容器内，先加入约终体积一半的超纯水；用水洗包装袋面
2次，倒入培养液中，以保证所有干粉都溶解成培养液。
磁力搅拌或人工搅拌使之完全溶解。
2.根据包装袋上的说明补加所需量的丙酮酸钠、谷氨酰胺。
3.加水定容到终体积。
4. 用无菌0.2um滤膜过滤除菌，分装于无菌血清瓶中，4℃冰箱保存。
同时将少量滤液装
到无菌瓶或接种细菌培养基，37℃培养，48小时以后检查有无细菌生长。
细胞培养无菌操作基本技术
(1)实验前，无菌室及无菌操作台用紫外灯照射30-60分钟灭菌，用70% 酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风机运转10分钟后才可开始实验操作。
每次操作只处理一株细胞，以免造成细胞交叉污染。
实验结束后，将实验物品带出工作台。
如需要继续进行下一个实验，则用70% 酒精擦拭无菌操作台面，再让无菌操作台风机运转10分钟后才可进行下一个实验操作.。
(2)无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞，必要物品可以暂时放置，其它实验用品用完后应及时移出,以利气体流通。
实验用品要用70%酒精擦拭后才能带入无菌操作台内。
实验操作应在操作台中央无菌区域内进行，勿在边缘非无菌区域操作。
(3)小心取出无菌实验用品，避免造成污染.切勿碰触注射器针头部或容器瓶口，不要在打开的容器正上方操作实验。
容器打开后，用手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放在台面上.。
(4)工作人员应注意自身的安全，必须穿戴实验衣与口罩后才进行实验。
应小心有毒性试剂,例如DMSO等，并避免尖锐物品伤人等.。
(5)定期检查下列项目:培养箱内的温度：无菌操作台内气流压力是否正常，定期更换紫外灯。
实验室消毒的方法
1、甲醛薰蒸
福尔马林为34～40%甲醛溶液，有较强大杀菌作用。
1%～3%溶液可杀死细菌繁殖体，5%溶液90分钟可杀死芽胞，室内熏蒸消毒一般用20ml/m3的加等量水，室内温度21～24℃，相对湿度75％～85％，加热薰蒸使蒸汽弥漫全室，关闭门窗持续1小时。
消除芽胞污染，则需80ml/m324小时，适用于皮毛、人造纤维、丝织品等不耐热物品。
因其穿透力差，刺激性大，故消毒物品应摊开，房屋须密闭。
甲醛气体毒性非常强，所以操作时一定要带上防毒面具。
2、过氧乙酸薰蒸
通常按双氧水﹕冰醋酸3﹕7的比例混合二者，每100ml混合液再加2.1ml的浓硫酸，
室温作用24小时。
按5 g/ m3的量取高锰酸钾置一敞口耐腐蚀的容器中，然后把预先配好的双氧水和冰醋酸混合液倒在高锰酸钾中，在开始的3秒钟内没有反映，3秒钟以后，会产生大量烟气，消毒人员应马上离开灭菌室，并关上门。
3、紫外线消毒
紫外线能杀死细菌，无菌室及无菌操作台用紫外灯照射至少30分钟才能灭菌。
实验室高压蒸气灭菌法
常用高压锅进行灭菌。
高压蒸气灭菌通常压力为15~20磅，温度121～126℃，15～20分钟即能彻底杀灭细菌芽胞，适用于耐热、潮物品。
有些物质，如培养基等不耐热，可用1 0磅，温度115℃，持续10分钟灭菌。
我养BHK-21细胞的经验：
弃除旧的培养液后---用缓冲液冲洗一遍----用0.22%的胰酶消化液消化约两分钟左右可以看到细胞像沙子一样脱落——赶紧倒掉胰酶加入含10%的牛血清培养液终止消化。
但目前国内能找到的BHK-21细胞大部分都有支原体感染，如果是好的BHK-21细胞能做到1比20的分种率。