BHK-21传代细胞培养

BHK-21传代细胞培养

BHK是仓鼠肾细胞

[原理]

细胞在培养瓶壁上长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。

[材料和试剂]

1、细胞：贴壁BHK-21细胞株

2、试剂：0.25％胰蛋白酶、配制好的DMEM培养液、小牛血清、双抗溶液、7.5%碳酸氢钠

3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、胶塞、量筒、注射器、针头、酒精灯、污物缸等

[操作步骤]

1、应需要计算好培养液的总用量，按10%的比例加入血清，按1%的比例加入双抗。用7.5%

的碳酸氢钠调PH至7.0~7.2左右。

2、将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。

3、加入0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中为宜。

4、瓶口塞好胶塞，平放在实验台上。约2~3分钟会看到贴壁细胞层出现细针孔空隙，赶紧

将胰酶弃去，加入少量培养液终止消化。

5、用注射器将贴壁的细胞反复吹打，使其均匀分散成悬液，再加入足量的培养液，分成两

到三瓶。塞好胶塞，置37℃温箱中继续培养。

细胞培养常用溶液的配制

一、青、链霉素溶液

青霉素钠盐(80万IU／瓶) 5瓶

链霉素(100万IU／瓶) 4瓶

将两者溶于400ml0.9％的无菌生理盐水，分装小瓶，-20℃保存。双抗在培养基中

的终浓度为100IU/ml为宜。

二、7.5%碳酸氢钠溶液的配制

称取碳酸氢钠7.5g，加入超纯水使总体积为100ml。高压灭菌，分装于小瓶中，4℃贮存。

三、1%酚红溶液的配制

首先配制1mol/L的NaOH溶液。称取NaOH4.0g，加入100ml超纯水，使NaOH 完全溶解，在室温或4℃贮存（最好现用现配）。配制好NaOH溶液后，再称取1.0 g 酚红置研钵中，加1mol/L的NaOH（不多于7.0ml），研磨使酚红完全溶解，加超纯水至100ml，高压消毒，在室温或4℃贮存。

四、0.25%胰蛋白酶溶液的配制

氯化钠8.0g

氯化钾0.2g

柠檬酸钠(Na3C6H5O7•5H2O) 1.12g

磷酸二氢钠(NaH2PO4•2H2O) 0.056g

碳酸氢钠 1.0g

葡萄糖 1.0g

胰蛋白酶（1：250） 2.5g

超纯水加至1000ml

放4℃冰箱过夜，待胰蛋白酶充分溶解后，用0.2um微孔滤膜过滤除菌，分装于小瓶中，-20℃保存。

四、GIBCO的低糖DMEM粉剂配制：

1.将干粉培养基倒入一干净的大容器内，先加入约终体积一半的超纯水；用水洗包装袋面

2次，倒入培养液中，以保证所有干粉都溶解成培养液。磁力搅拌或人工搅拌使之完全溶解。

2.根据包装袋上的说明补加所需量的丙酮酸钠、谷氨酰胺。

3.加水定容到终体积。

4. 用无菌0.2um滤膜过滤除菌，分装于无菌血清瓶中，4℃冰箱保存。同时将少量滤液装

到无菌瓶或接种细菌培养基，37℃培养，48小时以后检查有无细菌生长。

细胞培养无菌操作基本技术

(1)实验前，无菌室及无菌操作台用紫外灯照射30-60分钟灭菌，用70% 酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风机运转10分钟后才可开始实验操作。每次操作只处理一株细胞，以免造成细胞交叉污染。实验结束后，将实验物品带出工作台。如需要继续进行下一个实验，则用70% 酒精擦拭无菌操作台面，再让无菌操作台风机运转10分钟后才可进行下一个实验操作.。

(2)无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞，必要物品可以暂时放置，其它实验用品用完后应及时移出,以利气体流通。实验用品要用70%酒精擦拭后才能带入无菌操作台内。实验操作应在操作台中央无菌区域内进行，勿在边缘非无菌区域操作。

(3)小心取出无菌实验用品，避免造成污染.切勿碰触注射器针头部或容器瓶口，不要在打开的容器正上方操作实验。容器打开后，用手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放在台面上.。

(4)工作人员应注意自身的安全，必须穿戴实验衣与口罩后才进行实验。应小心有毒性试剂,例如DMSO等，并避免尖锐物品伤人等.。

(5)定期检查下列项目:培养箱内的温度：无菌操作台内气流压力是否正常，定期更换紫外灯。

实验室消毒的方法

1、甲醛薰蒸

福尔马林为34～40%甲醛溶液，有较强大杀菌作用。1%～3%溶液可杀死细菌繁殖体，5%溶液90分钟可杀死芽胞，室内熏蒸消毒一般用20ml/m3的加等量水，室内温度21～24℃，相对湿度75％～85％，加热薰蒸使蒸汽弥漫全室，关闭门窗持续1小时。消除芽胞污染，则需80ml/m324小时，适用于皮毛、人造纤维、丝织品等不耐热物品。因其穿透力差，刺激性大，故消毒物品应摊开，房屋须密闭。

甲醛气体毒性非常强，所以操作时一定要带上防毒面具。

2、过氧乙酸薰蒸

通常按双氧水﹕冰醋酸3﹕7的比例混合二者，每100ml混合液再加2.1ml的浓硫酸，

室温作用24小时。按5 g/ m3的量取高锰酸钾置一敞口耐腐蚀的容器中，然后把预先配好的双氧水和冰醋酸混合液倒在高锰酸钾中，在开始的3秒钟内没有反映，3秒钟以后，会产生大量烟气，消毒人员应马上离开灭菌室，并关上门。

3、紫外线消毒

紫外线能杀死细菌，无菌室及无菌操作台用紫外灯照射至少30分钟才能灭菌。

实验室高压蒸气灭菌法

常用高压锅进行灭菌。高压蒸气灭菌通常压力为15~20磅，温度121～126℃，15～20分钟即能彻底杀灭细菌芽胞，适用于耐热、潮物品。有些物质，如培养基等不耐热，可用1 0磅，温度115℃，持续10分钟灭菌。

我养BHK-21细胞的经验：

弃除旧的培养液后---用缓冲液冲洗一遍----用0.22%的胰酶消化液消化约两分钟左右可以看到细胞像沙子一样脱落——赶紧倒掉胰酶加入含10%的牛血清培养液终止消化。但目前国内能找到的BHK-21细胞大部分都有支原体感染，如果是好的BHK-21细胞能做到1比20的分种率。