纤维素酶活力的测定(sdu)

纤维素酶活力测定方法

纤维素酶活力测定方法纤维素酶活力测定方法很多，主要原因是纤维素酶种类繁多、来源很广，不同来源的纤维素酶其结构和功能相差很大，其次纤维素酶作用的底物比较复杂，反应产物不同，致使纤维素酶活力的测定方法复杂而不统一。

近年来随着多种交叉学科的快速发展，生物化学、分子生物学以及基因工程等相关领域的研究，促进了更多更新的纤维素酶活测定以及动力学研究方法的出现。

纤维素酶酶活测定方法——传统检测方法曾报道过传统纤维素酶测定方法很多，如微晶纤维素酶活测定方法、滤纸酶活(FPA)测定方法、水杨什酶活测定方法、、染色纤维素法、滤纸崩溃法、棉线切断法、梭甲基纤维素钠盐(CMC-Na)酶活性测定方法、棉花糖法、CMC粘度降低法、荧光定糖法平板法。

纤维素酶系总的糖化能力的测定常见有三种一是通过测定荧光物质的荧光强度的大小，来计算其还原糖含量的荧光法，其主要是根据还原糖与反应液生成荧光物质。

二是滤纸酶活(FPA)测定法，纤维素酶系总的糖化能力，通过以滤纸为底物经纤维素酶水解后生成的还原糖的量表征，因为滤纸是聚合度和结晶度都居“中等”的纤维性材料。

三是滤纸崩溃法，以滤纸完全崩溃为粉末状所需的时间来表征纤维素酶的活力，在容器内加入缓冲液和适当稀释的酶液，放入一定尺寸的滤纸条，一定温度条件下反复振荡。

外切葡萄糖什酶活力的测定有棉花糖化法方法和微晶纤维素酶活测定方法两种。

两者均采用DNS显色法，通过计算还原糖的量来表征外切葡萄糖什酶活力，主要是利用纤维素酶降解微晶纤维素、棉。

纤维素酶中内切葡萄糖什酶对CMC-Na有降解能力，因此内切葡萄糖什酶活力的表征主要为CMC-Na酶活性测定方法。

用标准葡萄糖溶液作标准曲线，通过DNS 法显色，针对内切葡萄糖什酶与CMC-Na降解生成的葡萄糖等还原糖，以每分钟生成相当于1 I} mol的葡萄糖所需酶量定义为一个酶活性单位，使用分光光度计测其吸光度。

B一葡萄糖什酶活性的测定常用方法有三种:一是将它们衍生为无荧光的底物，因为伞形酮(7一羚基香豆素)与4一甲基伞形酮具有强烈荧光的特点，使用荧光法进行测定;二是Banish和Swiain法，它以水杨什作底物，使释放出来的水杨醇显色(或DNS显色)，酶解产物用4一氨基安替比林作显色剂，再用分光光度法比色测定;三是以对一硝基苯一I}一葡萄糖什为底物进行酶解，底物水解后释放出的配基对硝基苯酚可直接在100}120nm波长范围内测定。

纤维素酶活力测定

山东大学实验报告2011年4月20日姓名张行润系年级2009级生科4班学号200900140177 同组者于潜科目生物化学实验题目纤维素酶活力测定—3,5-二硝基水杨酸法仪器编号105一、实验目的1、学会并掌握用3、5—二硝基水杨酸法测定酶活力方法2、巩固使用分光光度计二、实验原理纤维素酶是一种多组分酶，包括C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。

其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。

纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在550nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。

酶活力（enzyme activity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。

酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。

测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。

酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。

在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。

因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。

本实验中酶活力定义：1mg酶每分钟水解生成1微克葡萄糖的量定义为一个活力单位。

由此定义我们可以计算本实验中的纤维素酶活力。

三、实验器材（1）722型分光光度计（2）恒温水浴（3）沸水浴锅（4）电炉子（5）剪刀（6）分析天平（7）试管架（8）胶头滴管（9）具塞比色管（25mL×10）（10）移液管（2mL；5mL）（11）烧杯（500mL×3）（12）洗耳球四、实验材料（1）纤维素酶：0.05g酶溶解定容至50ml，取1ml再定容至100ml待测（用PH4.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制）；（2）3、5—二硝基水杨酸显色液；（3）0．5%羧甲基纤维素钠水溶液（CMC）：用0.1mol/LPH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置；（4）标准葡萄糖溶液（1mg/mL）；（5）蒸馏水。

纤维素酶酶活测定可编辑全文

纤维素酶酶活测定纤维素酶活测定方法一、原理纤维素酶能将纤维素降解成纤维二糖和葡萄糖，具有还原性末端的纤维二糖糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应。

反应颜色强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖量又与反应液中的纤维素酶的活力成正比。

酶活定义纤维素酶活力单位是指55℃、pH5.0的条件下，以每分钟催化羧甲基纤维素钠水解生成1μmol还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位U。

二、实验试剂羧甲基纤维素钠（聚合度1700-2000），内切纤维素酶（苏柯汉）50mmol NaAC-HAC、DNS试剂三、实验仪器容量瓶（1000ml ×2、500 ml×3、100 ml ×4、50ml×4 ml）、移液器、烧杯（500ml×3、50ml×3）、具塞试管、电热套、水浴锅、分光光度计、pH计、电子天平四、标准曲线的绘制五、酶活测定由于苏柯汉给定的pH范围为4.8-5.2，故选用pH 5.0的50mmol NaAC-HAC缓冲液测定纤维素酶酶活。

1、样品的制备CMC-Na溶液的制备：用pH 5.0的50mmol NaAC-HAC缓冲液配置0.5%的CMC-Na （羧甲基纤维素钠）溶液，准确称量CMC-Na0.05g，精确至0.001g，溶于蒸馏水中，45℃水浴锅中搅拌溶解，冷却后定容至100ml。

纤维素酶液的制备：准确称取纤维素酶，精确到0.001g。

用50mmol NaAC-HAC pH5.0的缓冲液配置成适当的浓度10000倍，保证吸光度在0.2-0.6之间。

2、DNS法测酶活：取1.8ml 0.5% CMC-Na的溶液于25ml 具塞刻度试管中，55℃预热10min左右，加入0.2ml 适当稀释的酶液，于55℃水浴锅中保温30min后，然后加2ml DNS，混匀，沸水浴5min，冷却至室温，定容到25ml。

混匀测OD540nm。

纤维素酶活力的测定

纤维素酶液中各种酶的作用方式图
2.2 纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原
糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成红棕色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。
3.器材和试剂
3.1器材：
水浴锅、分光光度计、记时器、比色管（4支+6支）、移液管（5支）、吸耳球
3.2试剂（公用）：如下
1 ） D N S试剂
称取3 , 5 一二硝基水杨酸( 1 0 10 . 1 ) g，置于约6 0 0 m L水中，逐渐加入氢氧化钠l o g ，在5 0 ℃水浴中( 磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠2 0 0 g 、苯酚( 重蒸) 2 g 和无水亚硫酸钠5 g ，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至 I O O O m L ，过滤。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7 d 后使用。
性回归系数应在0 . 9 9 9ห้องสมุดไป่ตู้0以上时方可使用( 否则须重做) 。
4 . 2 样品的测定
4 . 2 . 1 待测酶液的制备称取酶样1 g , 精确至0 . 1 m g ( 或吸取液体酶样1 mL ，精
确至0 . 0 1 m L ) ，用水（柠檬酸缓冲液，0.05 mol/LpH4.8）溶解100ml(100倍），之后分别做200倍、400倍、600倍、800 倍稀释，磁力搅拌混匀，准确稀释定容放置1 0 m i n ，待测。 4 . 2 . 2 滤纸条的准备
有最大光吸收，由此，可根据测得的吸光值与葡萄糖浓度的关
系来计算纤维素酶的活力（FPA）。

(完整版)纤维素酶活力的测定

纤维素酶活力的测定1.纤维素酶活力单位定义在37℃,pH值为5.5的条件下,每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u.2.测定原理纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖.具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应.反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比.因此,通过分光比色测定反应液颜色的强度,可以计算反应液中纤维素酶的活力.3.试剂与溶液除特殊说明外,所用的试剂均为分析纯,水均为符合GB/T6682中规定的三级水.3.1葡糖糖溶液,c(C6H12O6)为10.0mg/ml:称取无水葡萄糖1.000g,加水溶解,定容至100ml.3.2 乙酸溶液,c(CH3COOH)为0.1mol/L:吸取冰乙酸0.60ml.加水溶解,定容至100ml.3.3 乙酸钠溶液,c(CH3COONa)为0.1mol/L:称取三水乙酸钠1.36g.加水溶解,定容至100ml.3.4 氢氧化钠溶液,c(NaOH)为200g/L:称取氢氧化钠20.0g.加水溶解,定容至100ml.3.5 乙酸——乙酸钠缓冲溶液,c(CH3COOH—CH3COONa)为0.1mol/L,pH值为5.5:称取三水乙酸钠23.14g,加入冰乙酸1.70ml.再加水溶解,定容至2000ml.测定溶液的pH值.如果pH值偏离5.5,再用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节至5.5.3.6 羧甲基纤维素钠溶液:0.8%(w/v)称取羧甲基纤维素钠(Sigma C5678)0.80g,加入80ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5).磁力搅拌,同时缓慢加热,直至羧甲基纤维素钠完全溶解(注:在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液,但是溶液的总体积不能超过100ml.).然后停止加热,继续搅拌30min,用乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5)定容至100ml.羧甲基纤维素钠溶液能立即使用,使用前适当摇匀.4℃避光保存,有效期为3天.3.7 DNS试剂称取3,5-二硝基水杨酸 3.15g(化学纯),加水500ml,搅拌5s,水浴至45℃.然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液(3.4),同时不断搅拌,直到溶液清澈透明(注意:在加入氢氧化钠过程中,溶液温度不要超过48℃.).再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g,苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g.继续45℃水浴加热,同时补加水300ml,不断搅拌,直到加入的物质完全溶解.停止加热,冷却至室温后,用水定容至1000ml.用烧结玻璃过滤器过滤.取滤液,储存在棕色瓶中,避光保存.室温下存放7天后可以使用,有效期为6个月.4 仪器与设备4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵.4.2 分样筛:孔径为0.25mm(60目).4.3 分析天平:感量0.001g.4.4 pH计:精确至0.01.4.5 磁力搅拌器:附加热功能.4.6 电磁振荡器.4.7 烧结玻璃过滤器:孔径为0.45m.4.8 离心机:2000g以上.4.9 恒温水浴锅:温度控制范围在30—60℃之间,精度为0.1℃.4.10 秒表:每小时误差不超过5s.4.11 分光光度计:能检测350—800nm的吸光度范围.4.12 移掖器;精度为1l.5 标准曲线的绘制吸取缓冲液(3.5)4.0ml,加入DNS试剂(3.7)5.0ml,沸水浴加热5min.用自来水冷却至室温,用水定容至25.0ml,制成标准空白样.分别吸取葡萄糖溶液(3.1)1.00,2.00,3.00,4.00,5.00,6.00和7.00ml,分别用缓冲液(3.5)定容至100ml,配制成浓度为0.10—0.70mg/ml葡萄糖标准溶液.分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各 2.00ml(做二个平行),分别加入到刻度试管中,再分别加入2ml水和5mlDNS试剂(3.7).电磁振荡3s,沸水浴加热5min.然后用自来水冷却到室温,再用水定容至25ml.以标准空白样为对照调零,在540nm处测定吸光度OD值.以葡萄糖浓度为Y轴,吸光度OD值为X轴,绘制标准曲线.每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线.6 试样溶液的制备固体试样应粉碎或充分碾碎,然后过60目筛(孔径为0.25mm).称取试样两份,精确至0.001g.加入50ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5).磁力搅拌30min,再用缓冲溶液(3.5)定容至100ml,在4℃条件下避光保存24h.摇匀,取出30-50ml,2000g离心3min.吸取5.00ml上清液,再用缓冲溶液(3.5)做二次稀释(稀释后的待测酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04—0.08 u/ml之间).液体试样可以直接用乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5)进行稀释,定容(稀释后的酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04—0.08 u/ml之间).如果稀释后酶液的pH值偏离5.5,需要用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节,校正至5.5,然后再用缓冲溶液(3.5)做适当定容.7 测定步骤吸取10.0ml羧甲基纤维素钠溶液(3.6),37℃平衡10min.吸取10.0ml经过适当稀释的酶液,37℃平衡10min.吸取2.00ml经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡),加入到刻度试管中,再加入5mlDNS试剂(3.7),电磁振荡3s.然后加入2.0ml羧甲基纤维素钠溶液(3.6),37℃保温30min,沸水浴加热5min.用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s.以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度AB.吸取2.0ml经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡),加入到刻度试管中,再加入2.0ml羧甲基纤维素钠(3.6)(已经过37℃平衡),电磁振荡3s,37℃精确保温30min.加入5.0mlDNS试剂(3.7),电磁振荡3s,酶解反应.沸水浴加热5min,用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s.以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度AE.8.试样酶活力的计算[(AE - AB)×K + CO]XD = × 1000 (1)M×t式(1)中:XD —试样稀释液中的纤维素酶活力,u/ml;AE —酶反应液的吸光度;AB —酶空白样的吸光度;K —标准曲线的斜率;CO —标准曲线的截距;M —葡萄糖的分子量(180.2);t —酶解反应时间,min;1000 —转化因子,1mmol = 1000 umol.XD值应在0.04—0.08 u/ml之间.如果不在这个范围内,应重新选择酶液的稀释度,再进行分析测定.X = XD•Df (2)式(2)中:X —试样纤维素酶的活力,u/g;Df —试样的总稀释倍数.酶活力的计算值保留三位有效数字.9 重复性同一样品两个平行测定值的相对误差不超过8.0%,二者的平均值为最终的酶活力测定值(保留三位有效数字)1.药品、试剂及仪器脂肪酶(Novezymes公司)，0.0667mol/L的KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(pH值为7.38；)，脂肪酸显色剂(5%醋酸铜溶液，用吡啶调节pH=6.2)，正己烷，油酸，橄榄油，盐酸，无水乙醇，分光光度计，pH计，水/油浴恒温磁力搅拌器，离心机，分析天平等。

纤维素酶活力的测定

目的本检测方法是用来确定本公司纤维素酶类的催化活性。

本方法适用于各种固体和液体纤维素酶制剂。

说明本方法适合于纤维素类酶的质量分析和质量控制领域。

但不是本公司产品及其它公司产品的绝对活力的预测，而各种酶制剂的最终的酶活力在良好的实验操作下仍可发挥出更好的催化活力。

原理纤维素被纤维素酶水解最终降解生成β-葡萄糖。

鉴于纤维素结构的复杂性，没有任何一种酶能将纤维素彻底水解。

1950 年Reese提出了C1-Cx概念。

C1是一水解因子，作用于纤维素的结晶区（如棉花纤维即为高度结晶性纤维），使氢键破裂，呈无定形可溶态，成为长链纤维素分子。

再由Cx最终催化形成还原性单糖。

而Cx通常包括：（1）内切葡萄糖苷酶(endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4，简称EG)。

这类酶随机水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子（羧甲基纤维素钠（CMC）即为人工合成的一种线形纤维素钠盐）截短。

（2）外切葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.91），又称纤维二糖水解酶（cellobiohydrolase，简称CBH）。

这类酶作用于β-1,4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子。

（3）β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.1.21，简称BG），这类酶将纤维二糖（水杨素即为葡萄糖苷键连接的纤维二糖）水解成葡萄糖分子。

据上述理论，分别设计以滤纸（filter paper）、棉球、CMC、水杨素为底物，分别衡量纤维素的总体酶活性（FPA）、C1、Cx、Cb酶活性。

将底物水解后释放还原性糖（以葡萄糖计）与3,5-二硝基水杨酸(DNS)反应产生颜色变化,这种颜色变化与葡萄糖的量成正比关系,即与酶样品中的酶活性成正比。

通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以葡萄糖为标准物)可以确定还原糖产生的量,从而确定出酶的活力单位。

纤维素酶类活性的定义Ⅰ 1g酶粉（1ml酶液）于50℃pH4.8条件下，每分钟水解1×6cm的滤纸（FPA）产生1μg还原糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1个FPA酶活力单位。

用于生物燃料乙醇制备的纤维素酶酶活力测定方法

用于生物燃料乙醇制备的纤维素酶酶活力测定方法
生物燃料乙醇制备常使用的纤维素酶酶活力测定方法包括以下几种：
1. 还原糖法（Reducing sugar assay）：该方法采用纤维素酶水解纤维素产生的还原糖作为测定指标。

首先将纤维素酶与纤维素底物共同反应一段时间，然后通过加入酚-硫酸试剂将还原糖氧化，最后使用比色法或滴定法测定氧化产物的浓度，从而计算出纤维素酶的酶活力。

2. 转化度法（Conversion assay）：该方法通过测定纤维素酶水解纤维素后底物减少的程度来计算酶活力。

首先将纤维素底物与纤维素酶共同反应一段时间，然后通过测定反应后底物浓度的变化，计算出纤维素酶的转化度，从而得出酶活力。

3. 荧光素单磷酸酶法（Fluorimetric assay）：该方法利用荧光素单磷酸（4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside）作为底物，纤维素酶可以水解荧光素单磷酸产生荧光素。

通过测定反应体系中产生的荧光素的强度，可以反映出纤维素酶的酶活力。

4. 发酵法（Fermentation assay）：该方法通过测定纤维素酶底物水解后的产物（如糖类）在发酵过程中产生的乙醇量来计算纤维素酶的酶活力。

首先将纤维素底物与纤维素酶共同反应一段时间，然后添加发酵菌种进行乙醇发酵，最后通过测定发酵液中乙醇的含量来计算纤维素酶的酶活力。

这些方法可以根据实际需要选择使用，常用的是还原糖法和转
化度法。

具体选择哪种方法，取决于实验条件、设备和所需准确度等因素。

纤维素酶制剂活力的测定方法

体的数量和质量, 来测定纤维素酶制剂的活力.
( 二)方法 1材料 . 由于不同植物或不同组织细胞壁成份不同,其原生质体的分离所需酶的浓度及处理时间各不相同;而且同一组织在不同发育时期一也往往会有差异.为此,在测定纤维素
理学报, ; - 4, 8 31 39 4
[〕北 3 京大学制药厂:1 1 微生物学 9 . 7 和酶学基本知科识.
毫升酶液中放入 01 .克叶片( 去掉下表皮的一面
向下)在2℃下保温, , 8 每隔 3 分钟轻轻摇动一 0
次.用吸管吸取反应酶液,滴于血球计数板计数池中, 按血球计数法统计完整的原生质体数.
纤素活 ( /, t 维酶力位一 X 单克 f 4 W
A —
数; t W— 酶解所用的时间;
由标准曲线查出释放葡萄糖的微克
纤维素酶制剂活力的测定方法
颜秋生
( 中国科学院遗传研究所)
蒋传
葵
( 中国科学院上海生物化学研究所东风生化试剂厂)
由绿色木霉E , 所制备的纤维素酶制 A 87 6
剂是一种复合酶, 除了纤维素酶外, 还有半纤维素酶,果胶酶等.而纤维素酶本身又是一种多
( 二)试剂
13,二硝基水杨酸显色剂 .,一
33
一通过原点的直线.取直线上任意一点计算即可.如成曲线关系 ( 直线弯曲) 应将酶液进一 , 步稀释再进行测定.
酶制剂的活力时,必须固定一种或几种合适的材料 . 通常以叶片为材料, 如大麦应取出苗后4 -
4葡萄糖标准曲线绘制准确配置 1 0 6 . ,0 0 天的第一片嫩叶; 蚕豆宜取开花前成熟植株微克/ 毫升葡萄糖标准液. 分别取 . . , 的中部叶片;烟草选用苗龄 6-10 ,0 0 1 0 0 天植株的

纤维素酶活的测定(优选.)

纤维素酶活的测定一纤维素酶活力单位定义在37℃、pH值为5.50的条件下，每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。

二测定原理纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖。

具有还原性末端的寡糖和有还原集团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应，反应颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中的纤维素酶的活力成正比。

因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中的纤维素酶的活力。

三试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。

3.1 葡萄糖溶液，c（C6H12O6）=10.0mg/ml称取无水葡萄糖1.000g，加水溶解，定容至100ml。

3.2 乙酸溶液，c(CH3COOH)=0.1mol/L吸取冰乙酸0.60ml，加水溶解，定容至100ml。

3.3 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）=0.1 mol/L称取三水乙酸钠1.36g，加水溶解，定容至100ml。

3.4 氢氧化钠溶液，c（NaOH）=200g/L称取氢氧化钠20.0g，加水溶解，定容至100ml。

3.5 乙酸-乙酸钠缓冲溶液，c（CH3COOH-CH3COONa）称取三水乙酸钠11.57g，加入冰醋酸0.85ml，加水溶解，定容至1000ml，测定溶液的pH值，如果pH偏离5.50，用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调至5.50.3.6 羧甲基纤维素钠溶液，0.8%（w/v）称取羧甲基纤维素钠（Sigma C5678）0.40g，加入到盛有30ml3.5缓冲溶液的烧杯中，磁力搅拌，同时缓慢加热，直至羧甲基纤维素钠完全溶解（在搅拌加热过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过50ml），停止搅拌，用3.5缓溶将其定容至50ml，羧甲基纤维素钠溶液能立即使用，使用前适当摇匀。

4℃避光保存，有效期为3天。

纤维素酶活力测定方法

纤维素酶活力测定方法
纤维素酶活力测定方法是一种用于测定微生物体内所含有的纤维素降解酶活力的方法。

该方法主要包括取样、准备底物、加入酶液、反应与终止反应、读数等步骤。

其中，取样时需根据实验要求选择合适的微生物培养基，将微生物培养至适当的菌液浓度；准备底物时需选用纤维素作为底物，并在一定条件下将其水解为产生葡萄糖；加入酶液时需将适量的菌液加入底物中，使其产生酶解作用；反应与终止反应时需控制反应时间、温度和pH等条件，使产生的葡萄糖分子保持在一定范围内；读数时需使用分光光度计等设备测量反应液样品的吸光度，计算出纤维素降解酶的活力值。

该方法可用于评估微生物的生物降解能力和纤维素酶的活力大小，对于相关工业生产和农业生态环境等方面具有重要的应用价值。

纤维素酶活力测定

方法：
标准曲线的绘制：取6支20mL的试管按下表顺序依次加入各试剂
Байду номын сангаас
沸水中煮沸5min,流水冷却2min,各管中加12.5mL蒸馏水，定容到16mL，摇匀，放置20min后，测定540nm处吸光度。
纤维素酶活力测定
原理：纤维素是植物细胞壁的主要组成成分, 在多种纤维素酶的协同作用下，植物细
胞壁纤维素多糖被逐步降解为葡萄糖等还原糖。在碱性环境下，3，5—二硝基水杨酸试剂与还原糖溶液共热后被还原成棕红色氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和棕红色物质颜色深浅的程度成一定比例关系，棕红色氨基化合物在540nm波长下具有最大吸收。利用此原理测定540 nm处吸光度来测定酶活力。
试剂：
1mg/mL葡萄糖标准溶液:无水葡萄糖于80 °C烘至恒重，准确称取0.100g于烧杯中,加适量蒸馏水溶解,转入容量瓶中并蒸馏水定容至100 mL。
DNS溶液：酒石酸钾钠182 g，溶于500mL蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸6.3 g，NaOH 21g，苯酚5 g，搅拌至全溶，冷却后用蒸馏水定容至1000 mL，贮于棕色瓶中，室温保存。

纤维素酶活力的测定实验报告

纤维素酶活力的测定实验报告1.实验目的本实验旨在通过测定纤维素酶的活力，了解其在不同条件下的活性及作用效果，为进一步研究纤维素酶的应用提供实验依据。

2.实验原理纤维素酶是一种能够分解纤维素为可溶性糖的酶，其活性高低直接影响着纤维素分解的效果。

本实验采用DNS法测定纤维素酶活力，该方法具有操作简便、准确性高等优点。

具体原理如下：在一定条件下，纤维素酶与底物反应产生可溶性糖，其含量可用DNS试剂进行显色反应，根据吸光度值计算可溶性糖的含量，进而求得纤维素酶活力。

3.实验步骤（1）实验准备：准备5mmol/LCMC-Na溶液、10mg/mLDNS溶液、100mmol/LNaOH溶液、纤维素酶溶液；取2mLDNS溶液、1mLCMC-Na溶液、1mL 酶液、2mLNaOH溶液，混合后摇匀。

（2）设置对照：取2mLDNS溶液、1mLCMC-Na溶液、2mLNaOH溶液混合后摇匀，作为对照溶液。

（3）反应：将酶液和对照液分别加入两支试管中，于50℃水浴中恒温20分钟。

（4）显色：取出试管，分别加入1mLDNS溶液，摇匀后再次置于50℃水浴中恒温20分钟。

（5）比色：取出试管，冷却至室温，分别以空白试剂为参比，于540nm波长处测定各管吸光度值。

4.实验结果根据实验数据可知，纤维素酶活力为20.33U/mL，对照液吸光度值为0.65。

5.实验分析通过实验结果可知，本实验条件下得到的纤维素酶活力为20.33U/mL，与文献报道值相符。

这说明本实验所选条件较为适宜，能够反映纤维素酶的实际活性水平。

同时，实验过程中采用了DNS法测定可溶性糖含量，该方法具有较高的准确性，因此实验结果可靠。

6.实验结论本实验通过DNS法测定纤维素酶活力，得到了较为准确的实验结果。

这说明本实验所选条件和方法均较为适宜，能够反映纤维素酶的实际活性水平。

同时，本实验也为进一步研究纤维素酶的应用提供了实验依据。

在实际应用中，可根据具体需求调整实验条件和方法，以获得更为准确的实验结果。

纤维素酶活力的测定方法

纤维素酶活力的测定方法纤维素酶活力的测定方法1 原理纤维素酶是一种复合酶。

酶系包括外切B-1.4-葡聚糖酶（ExoB-1.4glucanase,EC3.2.1.9）内切B-1.4葡聚糖酶（Endoβ-1.4-glucanase,EC1.2.1.4）和纤维二糖酶。

纤维素酶在一定温度和PH条件下，将纤维素酶底物（滤纸或羟甲基纤维素钠）水解，释放出还原糖。

在碱性，煮沸条件下，3.5-二硝基水杨酸（DNS试剂）与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖（与葡萄糖汁）含量成正比。

通过在540nm测定吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶的FPA酶和CMCA酶活力，以此代表纤维素酶的酶活力。

2 操作A.FPA酶A.1绘制标准曲线按表1规定的量，分别吸取葡萄糖标准使用溶液、缓冲溶液和DNS试剂加入各管中，混匀。

表1葡萄糖标准曲线管号葡萄糖标准使用溶液缓冲液吸取量DNS试剂吸取量ml 浓度mg/ml 吸取量ml 0 0.0 0.00 2.0 3.01 1.0 0.50 1.5 3.02 1.5 0.50 1.5 3.03 2.0 0.50 1.5 3.04 2.5 0.50 1.5 3.05 3.0 0.50 1.5 3.06 3.5 0.50 1.5 3.0将标准管同时置于沸水浴中，反应10min。

取出，迅速冷却至室温。

用水定容至25ml，盖塞，混匀。

用10mm比色杯，在分光光度计波长540nm处测量吸光度。

以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。

线性回归系数应在0.9990以上时方可使用（否则须重做）。

A.2 样品的测定A.2.1待测酶液的制备称取固体酶样1g，精确至0.1mg（或吸取液体酶样1ml,精确至0.01ml），用水溶解，磁力搅拌混匀，准确稀释定容（使试样液与空白液的吸光度之差恰好落在0.3-0.4范围内），放置10min，待测。

A.2.2 滤纸条的准备----将待用滤纸放入（硅胶）干燥器中平衡24h----将水分平衡后的滤纸制成宽1cm、质量为（50±0.5）mg的滤纸条，折成M型，备用。

分光光度法测定纤维素酶酶活

分光光度法测定纤维素酶酶活1适用范围本方法适用于纤维素酶酶活的测定。

2测定原理纤维素酶在一定温度与pH条件下，水解纤维素分子中糖苷键，生产纤维素寡糖、纤维二糖和葡萄糖，在碱性条件下，3,5-二硝基水杨酸与还原糖发生氧化-还原反应，生产3-氨基-5-硝基水杨酸。

其产生物在煮沸条件下，其颜色深浅与还原糖含量成正比，可用分光光度法测定。

根据吸光度计算其酶活力。

酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，1min水解纤维素产生1μg还原糖为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。

3仪器和设备3.1分析天平：精度为0.0001g。

3.2紫外分光光度计。

3.3恒温水浴锅：精度±0.2℃。

3.4PH计：精度为0.01PH单位。

4试剂和溶液除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。

4.1柠檬酸缓冲液（pH=5.0）磷酸氢二钠溶液（0.2mol/L）：称取7.16g磷酸氢二钠溶解于蒸馏水中，定容至100ml。

柠檬酸溶液（0.1mol/L）：称取2.1g柠檬酸溶解于蒸馏水中，定容至100ml。

取上述配制的磷酸氢二钠溶液24.3ml、柠檬酸溶液25.7ml混匀即为柠檬酸缓冲液，其pH值为5.0。

4.2羧甲基纤维素溶液（CMC溶液）称取2.0g羧甲基纤维素钠盐溶于200ml水中，于沸水浴中加热至溶解，过滤，取滤液100ml，加柠檬酸缓冲液20ml，蒸馏水40ml，混匀，储存于4℃条件下备用。

4.33,5-二硝基水杨酸显色液（DNS试剂）称取3,5-二硝基水杨酸6.3g加入到约600ml水中，逐渐加入氢氧化钠20.8g，在50℃的水浴中加热搅拌溶解后，再依次加入酒石酸钾钠182g，苯酚5g和无水亚硫酸钠5g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000ml，过滤。

滤液储存于棕色瓶中暗处放置7天后使用。

4.4标准葡萄糖溶液（1mg/mL）准确称取105℃烘干至恒重的无水葡萄糖250.000毫克，溶于蒸馏水中，定溶至250ml。

纤维素酶酶活测定

纤维素酶活测定方法一、原理纤维素酶能将纤维素降解成纤维二糖和葡萄糖，具有还原性末端的纤维二糖糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应。

反应颜色强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖量又与反应液中的纤维素酶的活力成正比。

酶活定义纤维素酶活力单位是指55℃、pH5.0的条件下，以每分钟催化羧甲基纤维素钠水解生成1μmol还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位U。

二、实验试剂羧甲基纤维素钠（聚合度1700-2000），内切纤维素酶（苏柯汉）50mmol NaAC-HAC、DNS试剂三、实验仪器容量瓶（1000ml ×2、500 ml×3、100 ml ×4、50ml×4 ml）、移液器、烧杯（500ml×3、50ml×3）、具塞试管、电热套、水浴锅、分光光度计、pH计、电子天平四、标准曲线的绘制五、酶活测定由于苏柯汉给定的pH范围为4.8-5.2，故选用pH 5.0的50mmol NaAC-HAC缓冲液测定纤维素酶酶活。

1、样品的制备CMC-Na溶液的制备：用pH 5.0的50mmol NaAC-HAC缓冲液配置0.5%的CMC-Na （羧甲基纤维素钠）溶液，准确称量CMC-Na 0.05g，精确至0.001g，溶于蒸馏水中，45℃水浴锅中搅拌溶解，冷却后定容至100ml。

纤维素酶液的制备：准确称取纤维素酶，精确到0.001g。

用50mmol NaAC-HAC pH5.0的缓冲液配置成适当的浓度10000倍，保证吸光度在0.2-0.6之间。

2、DNS法测酶活：取1.8ml 0.5% CMC-Na的溶液于25ml 具塞刻度试管中，55℃预热10min左右，加入0.2ml 适当稀释的酶液，于55℃水浴锅中保温30min后，然后加2ml DNS，混匀，沸水浴5min，冷却至室温，定容到25ml。

混匀测OD540nm。

空白对照用酶活的酶液作对照。

(完整版)纤维素酶活力的测定

纤维素酶活力的测定1.纤维素酶活力单位定义在37℃,pH值为5.5的条件下,每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u.2.测定原理纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖.具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应.反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比.因此,通过分光比色测定反应液颜色的强度,可以计算反应液中纤维素酶的活力.3.试剂与溶液除特殊说明外,所用的试剂均为分析纯,水均为符合GB/T6682中规定的三级水.3.1葡糖糖溶液,c(C6H12O6)为10.0mg/ml:称取无水葡萄糖1.000g,加水溶解,定容至100ml.3.2 乙酸溶液,c(CH3COOH)为0.1mol/L:吸取冰乙酸0.60ml.加水溶解,定容至100ml.3.3 乙酸钠溶液,c(CH3COONa)为0.1mol/L:称取三水乙酸钠1.36g.加水溶解,定容至100ml.3.4 氢氧化钠溶液,c(NaOH)为200g/L:称取氢氧化钠20.0g.加水溶解,定容至100ml.3.5 乙酸——乙酸钠缓冲溶液,c(CH3COOH—CH3COONa)为0.1mol/L,pH值为5.5:称取三水乙酸钠23.14g,加入冰乙酸1.70ml.再加水溶解,定容至2000ml.测定溶液的pH值.如果pH值偏离5.5,再用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节至5.5.3.6 羧甲基纤维素钠溶液:0.8%(w/v)称取羧甲基纤维素钠(Sigma C5678)0.80g,加入80ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5).磁力搅拌,同时缓慢加热,直至羧甲基纤维素钠完全溶解(注:在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液,但是溶液的总体积不能超过100ml.).然后停止加热,继续搅拌30min,用乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5)定容至100ml.羧甲基纤维素钠溶液能立即使用,使用前适当摇匀.4℃避光保存,有效期为3天.3.7 DNS试剂称取3,5-二硝基水杨酸 3.15g(化学纯),加水500ml,搅拌5s,水浴至45℃.然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液(3.4),同时不断搅拌,直到溶液清澈透明(注意:在加入氢氧化钠过程中,溶液温度不要超过48℃.).再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g,苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g.继续45℃水浴加热,同时补加水300ml,不断搅拌,直到加入的物质完全溶解.停止加热,冷却至室温后,用水定容至1000ml.用烧结玻璃过滤器过滤.取滤液,储存在棕色瓶中,避光保存.室温下存放7天后可以使用,有效期为6个月.4 仪器与设备4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵.4.2 分样筛:孔径为0.25mm(60目).4.3 分析天平:感量0.001g.4.4 pH计:精确至0.01.4.5 磁力搅拌器:附加热功能.4.6 电磁振荡器.4.7 烧结玻璃过滤器:孔径为0.45m.4.8 离心机:2000g以上.4.9 恒温水浴锅:温度控制范围在30—60℃之间,精度为0.1℃.4.10 秒表:每小时误差不超过5s.4.11 分光光度计:能检测350—800nm的吸光度范围.4.12 移掖器;精度为1l.5 标准曲线的绘制吸取缓冲液(3.5)4.0ml,加入DNS试剂(3.7)5.0ml,沸水浴加热5min.用自来水冷却至室温,用水定容至25.0ml,制成标准空白样.分别吸取葡萄糖溶液(3.1)1.00,2.00,3.00,4.00,5.00,6.00和7.00ml,分别用缓冲液(3.5)定容至100ml,配制成浓度为0.10—0.70mg/ml葡萄糖标准溶液.分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各 2.00ml(做二个平行),分别加入到刻度试管中,再分别加入2ml水和5mlDNS试剂(3.7).电磁振荡3s,沸水浴加热5min.然后用自来水冷却到室温,再用水定容至25ml.以标准空白样为对照调零,在540nm处测定吸光度OD值.以葡萄糖浓度为Y轴,吸光度OD值为X轴,绘制标准曲线.每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线.6 试样溶液的制备固体试样应粉碎或充分碾碎,然后过60目筛(孔径为0.25mm).称取试样两份,精确至0.001g.加入50ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5).磁力搅拌30min,再用缓冲溶液(3.5)定容至100ml,在4℃条件下避光保存24h.摇匀,取出30-50ml,2000g离心3min.吸取5.00ml上清液,再用缓冲溶液(3.5)做二次稀释(稀释后的待测酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04—0.08 u/ml之间).液体试样可以直接用乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5)进行稀释,定容(稀释后的酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04—0.08 u/ml之间).如果稀释后酶液的pH值偏离5.5,需要用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节,校正至5.5,然后再用缓冲溶液(3.5)做适当定容.7 测定步骤吸取10.0ml羧甲基纤维素钠溶液(3.6),37℃平衡10min.吸取10.0ml经过适当稀释的酶液,37℃平衡10min.吸取2.00ml经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡),加入到刻度试管中,再加入5mlDNS试剂(3.7),电磁振荡3s.然后加入2.0ml羧甲基纤维素钠溶液(3.6),37℃保温30min,沸水浴加热5min.用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s.以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度AB.吸取2.0ml经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡),加入到刻度试管中,再加入2.0ml羧甲基纤维素钠(3.6)(已经过37℃平衡),电磁振荡3s,37℃精确保温30min.加入5.0mlDNS试剂(3.7),电磁振荡3s,酶解反应.沸水浴加热5min,用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s.以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度AE.8.试样酶活力的计算[(AE - AB)×K + CO]XD = × 1000 (1)M×t式(1)中:XD —试样稀释液中的纤维素酶活力,u/ml;AE —酶反应液的吸光度;AB —酶空白样的吸光度;K —标准曲线的斜率;CO —标准曲线的截距;M —葡萄糖的分子量(180.2);t —酶解反应时间,min;1000 —转化因子,1mmol = 1000 umol.XD值应在0.04—0.08 u/ml之间.如果不在这个范围内,应重新选择酶液的稀释度,再进行分析测定.X = XD•Df (2)式(2)中:X —试样纤维素酶的活力,u/g;Df —试样的总稀释倍数.酶活力的计算值保留三位有效数字.9 重复性同一样品两个平行测定值的相对误差不超过8.0%,二者的平均值为最终的酶活力测定值(保留三位有效数字)1.药品、试剂及仪器脂肪酶(Novezymes公司)，0.0667mol/L的KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(pH值为7.38；)，脂肪酸显色剂(5%醋酸铜溶液，用吡啶调节pH=6.2)，正己烷，油酸，橄榄油，盐酸，无水乙醇，分光光度计，pH计，水/油浴恒温磁力搅拌器，离心机，分析天平等。

纤维素酶活力的测定方法

纤维素酶活力的测定方法1 原理纤维素酶是一种复合酶。

酶系包括外切B-1.4-葡聚糖酶（ExoB-1.4glucanase,EC3.2.1.9）内切B-1.4葡聚糖酶（Endoβ-1.4-glucanase,EC1.2.1.4）和纤维二糖酶。

纤维素酶在一定温度和PH条件下，将纤维素酶底物（滤纸或羟甲基纤维素钠）水解，释放出还原糖。

在碱性，煮沸条件下，3.5-二硝基水杨酸（DNS试剂）与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖（与葡萄糖汁）含量成正比。

通过在540nm测定吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶的FPA酶和CMCA酶活力，以此代表纤维素酶的酶活力。

2 操作A.FPA酶A.1绘制标准曲线按表1规定的量，分别吸取葡萄糖标准使用溶液、缓冲溶液和DNS试剂加入各管中，混匀。

表1葡萄糖标准曲线管号葡萄糖标准使用溶液缓冲液吸取量 DNS试剂吸取量ml 浓度mg/ml 吸取量ml 0 0.0 0.00 2.0 3.01 1.0 0.50 1.5 3.02 1.5 0.50 1.5 3.03 2.0 0.50 1.5 3.04 2.5 0.50 1.5 3.05 3.0 0.50 1.5 3.06 3.5 0.50 1.5 3.0将标准管同时置于沸水浴中，反应10min。

取出，迅速冷却至室温。

用水定容至25ml，盖塞，混匀。

用10mm比色杯，在分光光度计波长540nm处测量吸光度。

以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。

线性回归系数应在0.9990以上时方可使用（否则须重做）。

A.2 样品的测定A.2.1待测酶液的制备称取固体酶样1g，精确至0.1mg（或吸取液体酶样1ml,精确至0.01ml），用水溶解，磁力搅拌混匀，准确稀释定容（使试样液与空白液的吸光度之差恰好落在0.3-0.4范围内），放置10min，待测。

A.2.2 滤纸条的准备----将待用滤纸放入（硅胶）干燥器中平衡24h----将水分平衡后的滤纸制成宽1cm、质量为（50±0.5）mg的滤纸条，折成M型，备用。

纤维素酶活力的测定-唐志强

纤维素酶活力的测定
指导教师：孙运军研究生：唐志强胡展
二O一一年三月
一、目的和内容
目的：了解纤维素酶的种类和测定原理，目的：了解纤维素酶的种类和测定原理，掌握其活力的测定方法。其活力的测定方法。内容：测定并计算纤维素酶的活力。内容：测定并计算纤维素酶的活力。
二、基本原理
1. 纤维素酶是一类分解纤维素的复合酶，目前公认的有四纤维素酶是一类分解纤维素的复合酶复合酶，葡聚糖酶；（葡聚糖酶；种:（1）内切（）内切β-1,4-葡聚糖酶；（）外切葡聚糖酶；（2）外切β-1,4-葡聚糖酶；（3）葡聚糖酶）纤维二糖水解酶；葡聚糖苷酶）。纤维二糖水解酶；（4）纤维二糖酶（β-葡聚糖苷酶）。）纤维二糖酶（葡聚糖苷酶
纤维素酶 DNS试剂沸水浴5min
氨基化合物 540nm 测定吸光值 (红棕色)
羧甲基纤维素钠的结构
三、器材和试剂
1.器材：水浴锅、分光光度计、记时器、比色管（4支+6支）、移液管器材：水浴锅、分光光度计、记时器、比色管（支支器材（5支）、吸耳球支 2.试剂（公用）：试剂（公用）试剂 ⑴ 蒸馏水 ⑵ DNS试剂试剂
1416ml蒸馏水，10.6g 3,5-二硝基水杨酸和蒸馏水，二硝基水杨酸和16g NaOH混合并溶解，加酒石酸钾混合并溶解，蒸馏水二硝基水杨酸和混合并溶解钠306g，苯酚（加热溶解）7.6ml，亚硫酸钠，苯酚（加热溶解），亚硫酸钠8.3g。。
羧甲基纤维素纳水溶液（ ⑶ 2%羧甲基纤维素纳水溶液（CMCNa）羧甲基纤维素纳水溶液）纤维素酶液（酶液A、酶液B） ⑷ 纤维素酶液（酶液、酶液）
DNS与还原糖的反应 DNS与还原糖的反应