细菌的常用生化试验

方法：被检菌接种于硝酸盐培养基中，于35℃培养l～4d。将甲（对 氨基苯磺酸0.8g+5mol／L醋酸lOOml）、乙液（α-奈胺0.5g + 5mol/L醋酸lOOml）等量混合后（约0.1ml）加入培养基内，立即观 察结果。
结果：出现红色为阳性。 应用：本试验在细菌鉴定中广泛 应用。肠杆菌科细菌均能还原硝 酸盐为亚硝酸盐；铜绿假单胞菌 、嗜麦芽窄食单胞菌等假单胞菌
应用：用于肠杆菌科中菌属间的鉴定。在 肠杆菌科中埃希菌属、志贺菌属、爱德华
菌属和耶尔森菌属均为阴性，沙门菌属、
克雷伯菌属通常为阳性。
2.丙二酸盐利用试验

原理：有的细菌可利用丙二酸盐作为唯一碳源，将丙二酸盐分解生 成碳酸钠，使培养基变碱。 方法：将被检菌接种于丙二酸盐培养基培养基，35℃培养24～48h 后观察结果。

3.碳源和氮源利用试验
（1）枸橼酸盐利用试验（2）丙二酸盐利用试验 4.各种酶类试验 （1）氧化酶试验（2）过氧化氢酶试验（触酶试验）（3）硝酸盐还原 试验 （4）脂酶试验（5）卵磷脂酶试验（6）DNA酶试验（7）凝固酶试验 （8）CAMP试验

一、碳水化合物的代谢试验



结果：培养基由淡绿色变为深蓝色为阳性，颜色无变化为阴性。
应用：肠杆菌科中属间及种的鉴 别。克雷伯菌属为阳性，枸橼酸
杆菌属、肠杆菌属和哈夫尼亚菌
属中有些菌种也呈阳性，其他菌 属均为阴性。
四、酶类试验

1.氧化酶试验 原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系 统的最终呼吸酶。
细菌的常用生化试验
细菌室
23种细菌鉴定常用生化试验

1.碳水化合物的代谢试验 （1）糖（醇、苷）类发酵试验（2）氧化一发酵试验（O／F试验） （3）β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）（4）七叶苷水解试验 （5）甲基红试验（6）V-P试验 2.蛋白质和氨基酸的代谢试验 （1）明胶液化试验（2）吲哚（靛基质）试验（3）硫化氢试验 ）尿素分解试验（5）苯丙氨酸脱氨酶试验（6）氨基酸脱羧酶试验



三、碳源和氮源利用试验

1.枸橼酸盐利用试验 原理：某些细菌能以铵盐为唯一氮源，并且利用枸橼酸盐作为唯一 碳源，可在枸橼酸盐培养基上生长，分解枸橼酸盐，使培养基变碱 性。 方法：将被检菌接种于枸橼酸盐培养基，于35℃培养l～4d，每日观 察结果。


结果：培养基中的溴麝香草酚兰指示剂由淡绿色变为深蓝色为阳性；




菌，后者通常为阴性。
二、蛋白质和氨基酸的代谢试验

原理：不同种类的细菌分解蛋白质的能力不同。细菌对 蛋白质的分解，一般先由胞外酶将复杂的蛋白质分解为 短肽（或氨基酸），渗入菌体内，然后再由胞内酶将肽 类分解为氨基酸。 具体试验有：①明胶液化试验；②吲哚试验（靛基质试 验）；③硫化氢试验；④尿素酶试验；⑤苯丙氨酸脱氨 酶试验；⑥氨基酸脱羧酶试验。
1.糖（醇、苷）类发酵试验

原理：由于各种细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，故分解糖类的能力 各不相同，细菌分解糖类后的终末产物亦不一致，有的产酸、产气，有的仅 产酸，故可利用此特点以鉴别细菌。 方法：将分离的纯种细菌，以无菌操作接种到糖（醇、苷）类发酵培养基中， 置培养箱中培养数小时至两周后，观察结果。 结果：若能分解培养基中的糖（醇、苷）类产酸时，培养基中的指示剂呈酸 性反应。若产气可使液体培养基中倒管内或半固体培养基内出现气泡，固体 培养基内有裂隙等现象。若不分解，培养基中除有细菌生长外，无任何其他 变化。 应用：是鉴定细菌最主要和最基本的 试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤 为重要。

方法：常用方法有三种； 菌落法：直接滴加试剂于被检菌菌落上。


滤纸法：取洁净滤纸一小块，沾取菌少许，然后加试剂。
试剂纸片法：将滤纸片浸泡于试剂中制成试剂纸片，取菌涂于试剂纸上。

结果：细菌在与试剂接触10秒内呈深紫色，为阳性。为保证结果的 准确性，分别以铜绿假单胞菌和大肠埃希菌作为阳性和阴性对照。 应用：主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别，前者为阴性，后 者为阳性。奈瑟菌属、莫拉菌属细菌也呈阳性反应。
普罗威登菌和摩根菌为阳性，而斯
氏和产碱普罗威登菌阴性
5.苯丙氨酸脱氨酶试验

原理 方法：将被检菌浓厚接种于苯丙氨酸琼脂培养基斜面上， 于35℃培养l8～24h，滴加10%三氯化铁试剂3～4滴，自 斜面上方流下。 结果：出现绿色为阳性。应立即观察结果，延长反应时 问会引起褪色。 应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。变 形杆菌属、普罗威登斯菌属和摩根菌属细 菌均为阳性，肠杆菌种中其他细菌均为阴 性。

2.过氧化氢酶试验（触酶试验）

原理
方法：取槽置于洁净的试管内或玻片上，然后加3%过氧化氢数滴； 或直接滴加3%过氧化氢于不含血液的细菌培养物中，立即观察结果。 结果：有大量气泡产生者为阳性。不产生气泡者为阴性。 应用：革兰阳性球菌中，葡萄球菌和微球菌均产生过氧化氢酶，而 链球菌属为阴性，故此试验常用于革兰阳性球菌的初步分群。



2.氧化-发酵试验（0/F试验）

原理： 不同细菌对不同的糖分解能力及代谢产物不同，这种能力因 是否有氧气的存在而异，有氧条件下称为氧化，无氧条件下称为发 酵。 方法：将待检菌同时穿刺接种两支HL培养基，其中一支培养基滴加 无菌的液体石蜡（或其他矿物油），高度不少于lcm。将培养基于 35℃培养48h或更长。 结果：
结果：若3h后在菌落周围形成乳白色混浊环，即为阳性， 6h后混浊环可扩展至5～6mm。 应用：主要用于厌氧菌的鉴定。产气荚膜梭菌、诺维梭 菌产生此酶，其他梭菌为阴性。


6.DNA酶试验

原理：某些细菌产生DNA酶，可使长链DNA水解成寡核 苷酸链。因为长链DNA可被酸沉淀，寡核苷酸链则溶于 酸，所以当在菌落平板上加入酸后，会在菌落周围出现 透明环。 方法：将被检菌点种于0.2%DNA琼脂平板上，于35℃培 养l8～24h，然后用lmol/L盐酸覆盖平板，观察结果。 结果：在菌落周围出现透明环为阳性，无透明环为阴性。 应用：在革兰阳性球菌中只有金黄 色葡萄球菌产生DNA酶，在肠杆菌


原理
由于细菌各自具有不同的酶系统，对糖的分解能 力不同，有的能分解某些糖产生酸和气体，有的 虽能分解糖产生酸，但不产生气体，有的则不分 解糖。据此可对分解产物进行检测从而鉴别细菌。

具体试验有：①糖类发酵试验；②葡萄糖代谢类 型鉴别试验；③七叶苷水解试验；④淀粉水解试 验；⑤甲基红试验；⑥V-P试验；⑦β-半乳糖苷 酶试验（ONPG试验）。
应用：主要用于厌氧菌的鉴别。类杆菌属中的中间类杆 菌产生脂酶，其他类杆菌则阴性；芽胞梭菌属中产芽胞 梭菌、肉毒梭菌和诺维梭菌也有此酶，而其他梭菌阴性。
5.卵磷脂酶试验

原理：有的细菌产生卵磷脂酶（α-毒素），在钙离子存 在时，此酶可迅速分解卵磷脂，生成浑浊沉淀状的甘油 酯和水溶性磷酸胆碱。

方法：将被检菌划线接种或点种于卵黄琼脂平板上，于 35℃培养3～6h。



应用：主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌，前者为阳性，后者 为阴性。肠杆菌科中沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆 菌属等为阳性，而肠杆菌属、哈夫尼亚菌属则为阴性。
6.V-P试验

原理 方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，于 35℃培养48h后加入甲液（6%α-萘酚酒精溶液）和乙液 （40%KOH溶液），振摇。 结果：在数分钟内出现红色为阳性；如无红色出现且于 35℃4h后仍如故者即为阴性。 应用：本试验常与甲基红试验 一起使用，因为前者阳性的细


菌，绝大多数硫化氢阳性，其他菌属阴
性。沙门菌属中也有硫化氢阴性菌种。
4.尿素分解试验

原理 方法：将待检菌接种于尿素培养基，于35℃培养l8～24h 观察结果。 结果：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变 为阴性。



应用：主要用于肠杆菌科中变形杆
菌属细菌的鉴定。奇异变形杆菌和 普通变形杆菌脲酶阳性。另外雷氏




注意事项
①3%H2O2溶液要新鲜配制。 ②不宜用血琼脂平板上生长的菌落，因红细胞含有触酶，可致假阳 性反应。 ③取对数生长期的细菌。

3.硝酸盐还原试验

原理：在合成过程中，硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，再由氨转化为 氨基酸和细胞内其他含氮化合物；在分解代谢过程中，硝酸盐或亚 硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。能使硝酸盐还原的 细菌从硝酸盐中获得氧而形成亚硝酸盐和其他还原性产物。



本实验主要用于迟缓发酵乳糖菌株

的快速鉴定。
4.七叶苷水解试验

原理 方法：将待检菌接种于七叶苷培养基中，培养后观察结 果。 结果：培养基变为黑色为阳性，不变色者为阴性。 应用：主要用于D群链球菌 与其他链球菌的鉴别，



前者阳性，后者阴性。
5.甲基红试验

原理：肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生 丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥 珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5 以下，使甲基红指示剂变红。 方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，培养2～4d，于培 养基内加入甲基红试剂，立即观察结果。 结果：呈现红色为阳性；橘红色为弱阳性；黄色为阴性。


可产生氮气。
4.脂酶试验

原理：有的细菌产生脂酶，可分解脂肪成游离的脂肪酸。 从而使培养基中与脂肪结合形成无色化合物的维多利亚 蓝释放出来，呈现深蓝色。

方法：将被检菌接种于脂酶培养基（含维多利亚蓝）中， 于37℃培养24h
结果：培养基变为蓝色为阳性，阴性为粉红色或无色。




6.氨基酸脱羧酶试验

原理 方法：将被检菌分别接种于赖氨酸（或鸟氨酸或精氨酸） 培养基和氨基酸对照培养基中，并加入无菌液体石蜡或 矿物油，于35℃培养l～4d，每日观察结果。 结果：对照管应呈黄色，测定管呈紫色（指示剂为溴甲 酚紫）为阳性，若测定管呈黄色为阴性。若对照管呈现 紫色则试验无意义，不能作出判断。 应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。如沙门菌属中除 伤寒和鸡沙门菌外，其余沙门菌的赖氨酸和鸟氨酸脱羧 酶均为阳性。志贺菌属除宋内和鲍氏志贺菌外，其他志 贺菌均为阴性。

1.明胶液化试验

原理 方法：将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于22℃培养7d， 逐日观察结果。 结果：培养基呈液化状态为阳性。 应用：肠杆菌科细菌的鉴别，如沙 雷菌、普通变形杆菌、奇异变形杆 菌、阴沟杆菌等可液化明胶，而其 他细菌很少液化明胶。有些厌氧菌 如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌等也 能液化明胶。另外多数假单胞菌也 能液化明胶。


2.吲哚（靛基质）试验

原理
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方法：将待检菌接种于蛋白胨水培养基中，于35℃培养 24～48h，沿试管壁慢慢加入吲哚试剂。 结果：于两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。 应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。


3.硫化氢试验

原理 方法：将待检菌穿刺接种于醋酸铅培养基，于35℃培养 24～48h观察结果。 结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性。 应用：主要用于肠杆菌科中属及种的鉴 别。如沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑 那菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属细


产碱型
发酵型（产酸）
氧化型

应用：主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别，前者均为发酵型， 而后者通常为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌间的鉴 别，前者是发酵型，后者是氧化型。
3.β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）

原理 细菌分解乳糖依靠两种酶的作用，一种是β—半乳糖苷透性酶， 它位于细胞膜上，可运送乳糖分子渗入细胞。另一种为β-半乳糖苷 酶，亦称乳糖酶，位于细胞内，能使乳糖水解成半乳糖和葡萄糖。 具有上述两种酶的细菌，能在24—48h发酵乳糖，而缺乏这两种酶 的细菌，不能分解乳糖。 方法：从克氏双糖铁培养基上取菌，于0.25ml无菌生理盐水中制成 菌悬液，加入一滴甲苯并充分振摇，使酶释放。将试管置37℃水浴 5min，加入0.25ml ONPG试剂，水浴20min～3h观察结果。 结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在20～30min内显色。 应用：迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG 试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。