血小板抗体(固相凝集法)检测标准操作规程

1目的为规范血小板抗体检测操作，保证检测的有效性及临床用血的安全性，依据《输血实验室管理规程》4.19.4条款的要求制定本规程。

2适用范围适用于医疗机构输血科（血库）进行血小板抗体检测。

3职责医疗机构输血科(血库)技术人员负责血小板抗体的检测。

4原理微孔板反应孔中包被有抗血小板单克隆抗体（针对血小板表面糖蛋白IIb/IIIa、Ib/V/IX），血小板悬液经离心洗涤后可在反应孔底部表面形成血小板单层。加入受检血清或血浆，在孔中经过孵育后，若该血清或血浆中含有血小板抗体，则该抗体和反应孔中的血小板单层结合，未结合的成分通过洗涤被去除。加入抗IgG及IgG致敏红细胞（指示红细胞），经离心后指示红细胞通过抗IgG的桥连与血小板单层上的血小板抗体结合，因此阳性反应为指示红细胞黏附在反应孔底部表面，而阴性反应为指示红细胞在离心力的作用下聚集于反应孔底部中央。

5设备与材料

5.1材料血小板抗体检测试剂盒（固相凝集法）、血小板抗体筛检细胞（冻干粉）、

血小板抗体检测用指示红细胞（固相凝集法）。

5.2设备平板离心机、血型血清学专用离心机、电热恒温水浴箱。

6检测环境室温应控制在18-25℃，湿度应控制在30%-70%。

7操作步骤

7.1血标本采集及处理

7.1.1检测样本准备

7.1.1.1采集患者静脉血2ml，乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）或枸橼酸钠抗凝，

经3000rpm离心5分钟，分离出血浆进行检测。

7.1.1.2如果患者血标本为如果患者血标本为不抗凝血，经3000rpm离心5-10

分钟，取上清进行检测。

7.1.1.3如果患者血标本为血浆（血清），3000转离心5-10分钟。

7.1.2血标本处理样本4℃可保存7天。若需长期保存，应离心后分离血清或血浆，

－20摄氏度冻存。

7.2平衡室温

取出血小板抗体检测试剂盒（固相凝集法）、血小板抗体检测用指示红细胞（固相凝集法）、血小板抗体筛检细胞（冻干粉）放在室温中平衡至室温。

7.3制备血小板悬液

7.3.1商品化的冻干血小板稀释后直接使用。也可采用三人份等比例混合O型血小

板悬液，将有效期内机采血小板用生理盐水进行5-10倍稀释后混合。或采血

当天8小时内乙二胺四乙酸二钾、枸橼酸钠抗凝全血经200g离心10分钟，取

上层2/3富血小板血浆混合。

7.3.2血小板悬液的适宜浓度为50-150×109/L。血小板悬液应贮于塑料容器中，

20-25℃保存并在8小时内进行检测。

7.4配制浓缩洗涤液

将浓缩洗涤液以1：24比例与蒸馏水混合（满瓶20ML浓缩洗涤液兑480ML蒸馏水）。

7.5配制血小板抗体筛检细胞

将血小板抗体筛检细胞冻干粉依比例与生理盐水混合（冻干粉0.5ML与0.5ML生理盐水混合），混合后放置5分钟，使用前轻轻摇匀。

7.6标识

根据检测量取出反应板条，标记患者、阳性对照及阴性对照孔，未使用的板条应储存于自封袋中，加入干燥剂密封后，2-8℃储存。

7.7加血小板：

向反应板孔中各加入1滴（约50μl）混匀的血小板悬液，轻摇反应板约10秒钟。

7.8固着

将反应板用平板离心机以50g离心5分钟（专用血小板离心机用程序1，650转/分离心5分钟），使血小板固定在反应孔底部。

7.9洗涤

将反应板用洗涤液洗3至4次，洗涤过程中轻摇微孔板，然后再轻轻甩掉洗涤液。最后一次洗涤后将残余液体蘸干。

7.10加样

先向各孔中加入2滴（100μl）低离子强度溶液，再分别滴加1滴（50μl）阳性对照、阴

性对照、检测样本。

7.11孵育

将反应孔用封口胶纸封好，轻摇混匀后置湿盒中37℃孵育30分钟（或气浴孵育35至40分钟）。

7.12洗涤(同步骤7.9)反复洗涤5至6次。

7.13加指示物

立即向上述各孔加入1滴抗人IgG（50μl）和1滴（50μl）混匀的血小板抗体检测用指示红细胞悬液，轻轻振荡混匀。

7.14离心

将反应板以200g离心5分钟（专用血小板离心机用程序2，1300转/分离心5分钟）。

8结果判定

将检测孔与对照孔的结果进行比较，判读并记录实验结果。

8.1阳性结果

阳性反应为指示红细胞黏附在反应孔底部表面；若指示红细胞只结合到孔底局部，且结合的区域比阴性对照大为弱阳性；表明受检者血清或血浆中含有血小板抗体或血小板交叉配型不合。

8.2阴性结果

阴性反应为指示红细胞在离心力的作用下聚集于反应孔底部中央，表明受检者血清或血浆中不含血小板抗体或血小板交叉配型相合。

9质量控制

每次实验要求做阳性对照和阴性对照，对照样品应出现预期结果。若检测结果中出现阳性对照血清不能检出阳性结果和（或）阴性对照血清不能检出阴性结果，则检测必须重新进行。

10注意事项

10.1检测脂类含量过高的标本，微生物污染的样本及血液没有完全凝固的血清样本可

能会有错误结果。严禁使用含中性分离胶的试管采集标本。

10.225×浓缩洗涤液若有结晶形成，使用前应于37℃中溶解后再稀释成工作洗涤液。

工作洗涤液室温可保存1周左右。

10.3洗涤过程须滴加洗涤工作液，水流剧烈冲击可能会造成血小板单层的破坏而导致

错误结果。

10.4血小板悬液的浓度不合适会影响实验结果，浓度过低（<10×109/L）或太高（>350

×109 /L）都会导致错误结果。血小板悬液放置时间过长或4℃放置易使血小板聚

集而造成假阳性结果。

10.5所有试剂使用前应充分摇匀，加样时滴管应垂直滴加。

10.6抗人球蛋白试剂如浑浊则不能使用；指示红细胞出现浑浊、结块或溶血则不能使

用。

10.7献血者与受血者ABO血型不相容或患者自身IgG抗体结合到献血者血小板上易引

起假阳性结果。离心时间及速度不合适，血小板和微孔板结差，可能会降低实验

结果的敏感性和反应强度。

10.8如果出现可疑结果（出现不规则的、非同心圆状的细胞层消失），则检测必须重

新进行。

10.9所有血液制品必须以具潜在感染性对待。没有任何已知的检测方法能使人确信源

于人血的产品不能传播感染因子。试剂盒的原材料符合国家食品药品监督管理局

现行的强制性检测标准。

11相关文件

11.1《中国输血技术操作规程》（血站部分）. 天津：天津科学技术出版社，1997

11.2《输血技术学》（第二版）. 北京：人民卫生出版社，2002

12相关记录

12.1《血小板抗体（固相凝集法）检测试验报告单》