质谱在蛋白质组学中的应用

#6252-6252 RT:73.33-73.33 NL: 1.22E4 100
y
+1 8
968.3
95
90
85
80
75
70
65
1042.60 0200
55
z=250 45 40
y
+1 5
y
+1 6
621.4 692.4
+1 b 11 1113.3
35
30
y
+1 10
y
+1 12
1364.5
b
+1 14
1.1 蛋白质组学基本概念
蛋白质组 • 基因组表达的所有蛋白质，即一种细 蛋胞白、质组织学或生物体所拥有的全部蛋白 • 质以一种细胞、组织或生物体所拥有的
全部蛋白质为研究对象的学科
1.2 蛋白质组学的分类和研究对象
➢ 表达蛋白质组学
• 采用高通量的蛋白质组学研究技术分析细胞、组织和生 物体内尽可能多乃至于接近所有的蛋白质，对这些蛋白 质进行分离、识别、定量、定位，从而构建某个细胞、 组织或生物体全蛋白质的表达谱
SIEVE的非标记（Lable Free）定量结果
• SEQUEST for protein/peptides • ChemSpider for small molecules
➢ 功能蛋白质组学
• 以某种特定细胞、组织或生物体为对象，研究蛋白质的 翻译后修饰、蛋白质结构、蛋白质的定位及表达水平差 异与功能之间的关系，研究蛋白质之间的相互作用及其 意义，构建蛋白质功能网络
➢ 结构蛋白质组学 ➢ 生物信息学
1.3 蛋白质组学的应用和发展趋势
➢ 研究对象：
• 原核微生物、真核微生物、植物和动物等
四级杆/三重四级杆 (Quadrupole/Triple Quadrupole) 离子阱/线性离子阱(Ion Trap/Linear Ion Trap) 静电场轨道阱(Orbitrap) 飞行时间(Time Of Flight)
FTMS
3. 各类蛋白质组学 研究内容和方法
3.各类蛋白质组学研究
➢ 蛋白质的高通量分离和鉴定
进样系统 (LC或者直大气压
接进样)
离子化方式
真空系统
质量分析器
检测器
数据处理 系统
电喷雾电离 ESI 基质辅助激光解析电离 MALDI 大气压化学电离 APCI
大分子
2.4 生物质谱的离子源
2.4 生物质谱的质量分析器
进样系统 (LC或者直大气压
接进样)
离子化方式
真空系统
质量分析器
检测器
数据处理 系统
蛋白质定量
Top Down蛋白质组学
3.1 Thermo蛋白质组学解决方案——Protein ID
Innovative Software
SEQUEST MASCOT ZCORE
蛋白质的发现与鉴定 蛋白质的相对定量
HCD, PQD ETD, CID
翻译后修饰蛋白质组学研究
3.2 定量蛋白质组学研究
3.2.1 相对定量
3.2.1.1 体外同位素标记
• 一系列具有相同化学结构的用同位素标记的MS/MS标签，可 与氨基发生反应
Tandem Mass Tags - TMT
Thompson, A., et al. Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Anal. Chem. 2003, 75(8), 1895-1904. Dayon, L., et al. Relative quantification of proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6-plex isobaric tags. Anal. Chem. 2008, 80(8), 2921 -2931.
3.2 生物质谱应用于定量蛋白质组学
• 非标记相对定量：峰面积 • 同位素标记相对定量
ICAT： Isotope-coded affinity tag ( ICAT) 同位素代码标记技术应用一种含与蛋白质反应基 团、乙烯甘油结合区和生物素标记的试剂，这项技术目前主要由美国ABI公司推动。 目前, 商品化的ICAT试剂可专与蛋白质或肽段的L2半胱氨酸的巯基反应, 所带的同位素标记为含8 个氢原子的(d0) 轻试剂和8 个氘原子的( d8 ) 重试剂 （体外标记） iTRAQ： ABI公司推出的质谱定量方法,可以同时标记四个不同的样品(现在有最新的可同时 标记八个不同的样品的iTRAQ试剂)。其原理是使用非聚合同重标签标记肽段,该标签含有一 个报告基团(分子量分别为114 ,115 ,116 ,117)、一个平衡基团(分子量分别为31,30 ,29 ,28) 和一个肽反应基团,不同的报告基团分别与相应的平衡基团相配,保证总分子量为145。肽反 应基团将iTRAQ标签与肽段的N-端基团和每个赖氨酸侧链相连,可标记所有酶解肽段（体外 标记） TMT：Thermo Fisher Scientific （体外标记） SILAC： 在培养介质中加入稳定同位素标记的必需氨基酸，如赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu) 、苯丙氨酸(Phe)等，主要用于高等动物细胞中蛋白质的鉴定及定量（体内标记） • 绝对定量 ：峰面积定量（SRM、MRM、SIM）
95 90 85 80 75 10070 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
1041.0171 z=2 1041.5186 z=2
1038.5087 1038.0074z=2
z=2
1039.0102 z=2
1039.5125 z=2
AEDNADTLALVFEAPNQEK*
3.2 Thermo蛋白质组学解决方案——目标蛋白质 定量
发现生物标记物
Slow, lower-throughput High-resolution, information-rich data
Sample Preparation
Patient Samples
LC-MS/MS
LC-MS/MS Intelligent SRM
➢ 应用领域：
• 生命科学：细胞生物学、神经生物学 • 生物医学：寻找疾病分子标记和药物靶标最有效的方法之
一，应用于癌症、老年痴呆等疾病的临床诊断和治疗
➢ 技术发展：
• 多种技术并存 • 生物质谱是蛋白质组学发展中的关键技术
2. 应用于蛋白质组学的 生物质谱技术
2.1 生物质谱简介
蛋白质混合样品 蛋白质流份
• TMT
• SILAC
• iTRAQ
• Dimethylated SILAC
• ICPL
• ICPL
• O16/O18
3.2.1.4 非标记相对定量
SIEVE——无标记定量分析软件
State 1 raw file
State 2 raw file
State … raw file
SIEVE Workflow
b
+1 12
1260.3
y
+1 13
1465.6
y
+1 14
1580.8
b
+1 16
1671.7
+1 b 17 1799.8
b
+1 18
1928.5
300
400
500
600
700
800
900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900
m /z
1042.5215 z=2
酶解
蛋白质定量
肽段混合物 色谱分离
质谱鉴定
蛋白质软件
2.2 蛋白质组学的研究方法
蛋白质 提取
蛋白质 分离
质谱 鉴定
2.3 生物质谱解析蛋白质组学基本流程
2.3 生物质谱解析蛋白质组学基本流程——酶 解
Trypsin 胰蛋白酶
Mass determination of the resulting peptides： Peptide Mass Fingerprint
质谱在蛋白质组学中的应用
• 蛋主白要质内组容学基本概念、分类和研究对象
• 应用于蛋白质组学的生物质谱技术 • 各类蛋白质组学研究方法 • Thermo蛋白质组学全面解决方案简介
1. 蛋白质组学基础
1.1 蛋白质组学基本概念
什么是蛋白质？
1.1 蛋白质组学基本概念
蛋白质是一切生命的物质基础，是生命活动的主要承担者
Differential Expression Analysis
List of candidate biomarkers
为医疗诊断提供目标蛋 白质定量分析方法
Fast, high-throughput Sensitive, specific, targeted Robust, reproducible Cost-effective
2.3 生物质谱解析蛋白质组学基本流程——裂 解
MS
MS/MS
2.3 生物质谱解析蛋白质组学基本流程——裂 解
➢CID、ECD、ETD裂解方式示意图
➢多肽串级质谱碎片离子示意图
2.3 生物质谱解析蛋白质组学基本流程——裂
解
R 1
H HO
R 3
HH
肽段： H 2 N C C N C C N C C N C C O O H
• 分离：凝胶电泳、多维液相色谱、其它 • 鉴定：生物质谱
➢ 定量蛋白质组学
• 同位素标记：ICAT，ITRAQ，TMT，SILAC • 无标记：质谱峰面积，质谱数（Spectral Counts）
➢ 翻译后修饰蛋白质组学
• 磷酸化蛋白质分离及鉴定 • 糖基化蛋白质分离及鉴定 • 其它翻译后修饰
➢Top Down蛋白质组学
Align Frame Identify
得到结果：
• 特征鉴定 • 半定量信息 • 具有统计学意义 • 提供趋势变化信息
适用于：肽段，蛋白质，小分子
3.2.1.4 生物标记物的发现
例子：谱图保留时间校正
Before alignment
After alignment
3.2.1.4 生物标记物的发现
SILAC Ratio
1043.0231 H:L = 2.09 z=2
1037
1038
1039
1040
m/z
Light (L)
1041
1042
1043
Heavy (H)
3.2.1.3 软件处理
Discovery Quantitation
Reporter Ion Based
Precursor Ion Based
蛋白质检测
电泳& 染色 免疫检测 蛋白质测定
样品制备
细胞裂解 透析和除盐 质谱前样品处理Байду номын сангаас
免疫检测
Affinity bioreagents Endogen
Pathway tools 二级抗体
3.1 Thermo蛋白质组学解决方案
Thermo Scientific 生物质谱系列
蛋白质发现和鉴定
蛋白质组学软件
3.2.1.1 体外同位素标记
TMT标记用于蛋白质相对定量
3.2.1.1 体外同位素标记
定量信息
肽段的氨基酸序列信息
3.2.1.2 体内同位素标记
SILAC技术用于蛋白质相对定量
Ligh:t Heavy 1H : 2H 12C : 13C 14N : 15N 16O : 18O
Relative Abundance Relative Abundance
1460.4
y
+1 9
1180.5
b
+1 13
25
1067.5
1389.3
20
y
+1 7
b
+1 10
y
+1 11
821.4
1014.3
1251.6
15
b
+1 6
10
y
+2 8
616.2
484.2
5
b
+2 6
y
+1 3
b
+1 5
308.2 410.3 501.3
0
y
+2 16
b
+1 9
901.5
883.2
Final list of target proteins
Refine Target List
Refined list of target proteins
Pinpoint Software
Links biomarker discovery to quantitative biomarker verification
3.1 蛋白质的高通量分离和鉴定
3.1 Thermo蛋白质组学解决方案
样品制备
LC-MS/MS 分离鉴定
The Most Successful Labs and Companies
软件分析
3.1 Thermo蛋白质组学解决方案
蛋白质功能
亲和纯化 抗体
蛋白质表达 蛋白质相互作用
蛋白质修饰 蛋白质结构
HO
R 2
H HO
R 4
典型的 CID裂解
典型的 ECD、 ETD裂解
2.3 生物质谱解析蛋白质组学基本流程——算法 和数据库
MS MS/MS
✓ 算法
• SEQUEST • Mascot • Z Core • X! Tandem • ……
✓ 数据库
• Swissprot • NCBI • ……
2.4 生物质谱简介