Western_blot_实验技术及原理
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Western blot 实验技术
定义：
印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应 的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上， 并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为 Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA 的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印 迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析 称为Eastern印迹法
条带比正常的窄？
凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合 均匀，动作轻缓 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心， 以免把上样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致 宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应 赶走气泡。同时注意电泳槽装臵是否 合适
“微笑”或“倒微笑”
条带？
管号 ddH2O 蛋白标 准液 样品 HCL 0 80 1 70 2 70 3 70 4 70 5 70 6 70 7 70 8 70
0 10 10
10 10 10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
原Hale Waihona Puke Baidu：
SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水 性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺 基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋 白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定 比例之 SDS 後,由於 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且 每单位重量之蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白 的泳动速率就只剩下分子大小一项因素
背景太高
原 因 膜没有均匀浸湿
膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交 叉反应 抗体浓度过高
1.
1.
2.
3. 4.
2.
对 策
3.
5.
4.
转膜前用100%甲醇将膜完 全浸湿 拿取膜与吸水纸时要戴手 套，更换新鲜转膜缓冲液 检测一抗、二抗与封闭剂 是否有交叉反应 杂交前检测一抗、二抗的 工作浓度
价格便宜
简单快速封闭非特异性抗体结合
膜的选择
封闭非特异性抗体结合麻烦
尼龙膜
价格昂贵
需要更高的蛋白结合率
（尼龙膜： 480µ g/cm2 ；硝酸纤维素膜：80µ g/cm2 ）
特殊要求下的选择 目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱 需要更大的机械强度
转膜
半干法
将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿 润滤纸之间，电转10－30min。 湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装 臵的缓冲液中，电转45min或过夜。
膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。
37℃一小时，4 ℃过夜。
倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 37℃一小时， 4 ℃过夜。
倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。
二抗与底物反应显色
•辣根过氧化物酶法（HRP）
凝胶成份
丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液
TEMED
过硫酸铵(时间) Tris-甘氨酸电泳缓冲液
凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度（％） 线性分离范围（KD)
15
10
12-43
16-68
7.5
5.0
36-94
57-212
转膜
硝酸纤 维素膜
水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液 对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 细胞裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 ，
0.05% PMSF ， 2μg/mL Aprotinin, 0.5μg/mL Leupeptin ， pH8.0
转膜后检测
丽春红S染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤 膜，换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的 Western印迹过程。
封闭
脱脂奶粉（5％） BSA Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）
一抗、二抗孵育
把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤
转膜及抗体检测
凝胶肿胀或卷曲？
可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液 中浸泡5-10min
条带歪斜或漂移？
单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？
电转仪长期使用导致海绵变薄，“三
明治”结构不紧凑导致。可在两块海 绵之间垫上少许普通的草纸
确保膜和胶块之间没有气泡
缓冲液中离子浓度太低，电流或电压 太高。转膜过程注意降温
有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、
丙酮和丁醇等。
通过层析或电洗脱法制备目的蛋白
蛋白样品的定量
Bradford法
考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可 配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值， 化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。(上样量) 试剂：考马斯亮蓝工作液，0.1N盐酸，双蒸水，蛋白标准液（ 将10mg/ml蛋白溶液稀释至 4.0mg/ml, 3.5mg/ml, 3.0mg/ml, 2.5mg/ml, 2.0mg/ml, 1.5mg/ml, 1.0mg/ml, 0.5mg/ml。）
Western Blot基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种 固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
Western Blot一般流程
转膜
蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳
封闭
一抗杂交
二抗杂交
底物显色
蛋白样品的制备
通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白
•碱性磷酸酶法（AP）
•化学发光显色法(HRP)
Western Blot常见问题分析
SDS-PAGE电泳
胶板洗刷干净
胶不平？ 凝胶漏液？
加入APS和TEMED的量要合适
加入试剂后摇匀，使其充分混
合，防止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶 聚合不均匀 两块玻璃板底部要对齐
定义：
印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应 的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上， 并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为 Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA 的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印 迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析 称为Eastern印迹法
条带比正常的窄？
凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合 均匀，动作轻缓 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心， 以免把上样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致 宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应 赶走气泡。同时注意电泳槽装臵是否 合适
“微笑”或“倒微笑”
条带？
管号 ddH2O 蛋白标 准液 样品 HCL 0 80 1 70 2 70 3 70 4 70 5 70 6 70 7 70 8 70
0 10 10
10 10 10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
原Hale Waihona Puke Baidu：
SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水 性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺 基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋 白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定 比例之 SDS 後,由於 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且 每单位重量之蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白 的泳动速率就只剩下分子大小一项因素
背景太高
原 因 膜没有均匀浸湿
膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交 叉反应 抗体浓度过高
1.
1.
2.
3. 4.
2.
对 策
3.
5.
4.
转膜前用100%甲醇将膜完 全浸湿 拿取膜与吸水纸时要戴手 套，更换新鲜转膜缓冲液 检测一抗、二抗与封闭剂 是否有交叉反应 杂交前检测一抗、二抗的 工作浓度
价格便宜
简单快速封闭非特异性抗体结合
膜的选择
封闭非特异性抗体结合麻烦
尼龙膜
价格昂贵
需要更高的蛋白结合率
（尼龙膜： 480µ g/cm2 ；硝酸纤维素膜：80µ g/cm2 ）
特殊要求下的选择 目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱 需要更大的机械强度
转膜
半干法
将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿 润滤纸之间，电转10－30min。 湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装 臵的缓冲液中，电转45min或过夜。
膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。
37℃一小时，4 ℃过夜。
倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 37℃一小时， 4 ℃过夜。
倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。
二抗与底物反应显色
•辣根过氧化物酶法（HRP）
凝胶成份
丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液
TEMED
过硫酸铵(时间) Tris-甘氨酸电泳缓冲液
凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度（％） 线性分离范围（KD)
15
10
12-43
16-68
7.5
5.0
36-94
57-212
转膜
硝酸纤 维素膜
水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液 对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 细胞裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 ，
0.05% PMSF ， 2μg/mL Aprotinin, 0.5μg/mL Leupeptin ， pH8.0
转膜后检测
丽春红S染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤 膜，换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的 Western印迹过程。
封闭
脱脂奶粉（5％） BSA Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）
一抗、二抗孵育
把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤
转膜及抗体检测
凝胶肿胀或卷曲？
可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液 中浸泡5-10min
条带歪斜或漂移？
单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？
电转仪长期使用导致海绵变薄，“三
明治”结构不紧凑导致。可在两块海 绵之间垫上少许普通的草纸
确保膜和胶块之间没有气泡
缓冲液中离子浓度太低，电流或电压 太高。转膜过程注意降温
有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、
丙酮和丁醇等。
通过层析或电洗脱法制备目的蛋白
蛋白样品的定量
Bradford法
考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可 配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值， 化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。(上样量) 试剂：考马斯亮蓝工作液，0.1N盐酸，双蒸水，蛋白标准液（ 将10mg/ml蛋白溶液稀释至 4.0mg/ml, 3.5mg/ml, 3.0mg/ml, 2.5mg/ml, 2.0mg/ml, 1.5mg/ml, 1.0mg/ml, 0.5mg/ml。）
Western Blot基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种 固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
Western Blot一般流程
转膜
蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳
封闭
一抗杂交
二抗杂交
底物显色
蛋白样品的制备
通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白
•碱性磷酸酶法（AP）
•化学发光显色法(HRP)
Western Blot常见问题分析
SDS-PAGE电泳
胶板洗刷干净
胶不平？ 凝胶漏液？
加入APS和TEMED的量要合适
加入试剂后摇匀，使其充分混
合，防止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶 聚合不均匀 两块玻璃板底部要对齐