基因敲除小鼠的实验流程 PPT
cre_loxp基因敲除系统解读ppt课件
MerCreMer融合蛋白
该系统将雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)的配 体结合区(ligand-binding domain,LBD)和Cre重组 酶进行融合，产生一种嵌合重组酶，该嵌合重 组酶的表达被置于特异启动子的调节之下，从 而使其在特定组织和器官或者特定发育阶段产 生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥Cre重组 酶的活性，因为雌激素受体结合区的存在使其 不能进入核内与loxP位点相结合。只有加入雌 激素后才能使其进入核内发挥作用。
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基因敲除机理 （续）
Offspring: 25% homozygous knockout after 2 generation
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二、基因敲除的基本流程
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（1）打靶载体构建
Attention: Exon1 3N GT/AG
Conditional Knockout
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（2）转化ES细胞
电转需要的细胞数量2-5x107
同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。 在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设 计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源 的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组
同源重组示意图
3
一、Cre/Loxp系统
Cre重组酶（37℃）
acids 281 to 599, G525R)
D.S. Sohal, M. Nghiem. Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein. Circ Res. 89:20-25 (201061).
建立基因敲除小鼠颈动脉粥样硬化模型ppt课件
ELK
injured
EK
Mean Intimal and Medial Cross-sectional Areas
of EK and ELK Mice 8 Weeks after Injury
10
8
*
EK
ELK
6
Mean Area(um2X104)
4
**
2
0
media intimal
carotid artery counterstained with ORO and haematoxylin
noninjured
ELK
injured
EK
lipid deposit after carotid artery injury by FeCl3 for 8 weeks
carotid artery counterstained with ORO and haematoxylin
Future Works
PAI-1↑
？ LPL↓ ？
Other
？Pathways
Neointima formation↑
Thank You！
118.3±7.91
64.54±6.10
109.7±4.46
EK (n=3)
85.19±17.74 61.61±3.14 109.53±2.90P value0.190.68
0.98
Animal Body Weight of ELK and EK Mice Fed HCC
30
NS NS
ELK
NS
EK
carotid artery stained with H&E
noninjured
建立基因敲除小鼠颈动脉粥硬化模型课件28页PPT
Common carotid arteries of apoE-/-, LPL+/- (ELK)mice (A) and apoE-/-, LPL+/+ (EK)mice (B) 8 weeks after ferric chloride injury
neointima formation after carotid artery injury by FeCl3 for 8 weeks
Knock-out Mice
Candidate genes in lipoprotein metabolism
Lusis et al Circulation. 2004
Lipoprotein Lipase in the Arterial Wall
Pentikäinen et al Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2002
noninjured
ELK
injured
EK
Macrophage stain for 8 weeks
ELK
EK
Von Willebrand Factor Stain for 8 concentration(mg/dl)
The Plasma Triglyceride Levels of ELK and EK Mice Fed HCC
carotid artery counterstained with ORO and haematoxylin
noninjured
ELK
injured
EK
lipid deposit after carotid artery injury by FeCl3 for 8 weeks
carotid artery counterstained with ORO and haematoxylin
基因敲除小鼠的制作方法
一、常规基因敲除鼠( Conventional Knockout )常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用 Neo Cassette 替换掉。
这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。
此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。
二、条件性基因敲除小鼠( Conditional Knockout )条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个 loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。
该小鼠和表达 Cre 酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。
当和组织特异性表达 Cre 酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。
条件性基因敲除鼠适用范围为：( 1 )该基因有胚胎致死性；( 2 )用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。
三、基因敲入小鼠( Knockin )基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。
此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。
一、 ZFN 技术制作基因敲除鼠ZFN 能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。
随后细胞利用天然的DNA 修复过程来实现 DNA 的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。
这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而 ZFN 的基因敲除效率能达到 10% 。
利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。
这项技术中设计特异性的 ZFN 是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的 ZFN，但 ZFN的脱靶( off target )，也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。
也正因为这个原因，利用 ZFN 技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。
全基因敲除小鼠基因型鉴定原理及方法
全基因敲除小鼠基因型鉴定原理及方法下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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TALEN-小鼠-基因敲除流程
Step2 构建TALEN打靶载体
通过FastTALETM一步连接法完成TALEN载体的构建
上游引物测序结果比对
下游引物测序结果比对
Step3 细胞水平TALEN活性验证
Day1:小鼠3T3细胞铺板 筛选出一对高活性的 TALEN质粒用于后续实验 Day2：Fugene 共转TALEN 左右臂质粒和EIP质粒 ①PCR产物测序结果 查看套峰
Day3:药物筛选 （puromycin, 1μg/ml）
②PCR产物进行TA克隆 测序，计算突变率
Day6:收集剩余细胞, 抽基因组DNA
PCR靶向序列片段， 扩增出500bp左右
在靶位点上下游设计PCR引物，对打靶后的细胞基因组 DNA进行PCR
PCR-F >200bp TALEN-L >200bp
Step5 胚胎注射mRNA
TALEN左右臂 mRNA按1:1 比例混合
注射至一细胞 期受精卵 细胞质中
37℃培养24h 至二细胞期
移至代孕雌鼠 中，至小鼠 出生（3周）
注射浓度 300-500 ng/ul 注射体积：5-15 pl
Step6 F0代突变体小鼠检测
F0代小鼠剪尾， 抽提基因组DNA T7E1酶切鉴定法： 剪小鼠的尾巴或脚趾 提取基因组DNA PCR靶向基因序列 PCR扩增靶基因位点 PCR产物于94℃失活、50-60℃退火 T7E1酶切鉴定PCR 产物，进行初步筛选
注：图中第一排WT为原始序列，---表示缺失，红色为插入或置换。
Step4 体外转录生成mRNA
TALEN质粒线性化
根据载体所带启动子选择 相应试剂盒进行体外转录
mRNA浓度、纯度检测
原核启动子：sp6或T7 mRNA转录后的大小检测： 若片段大于1.5kb可用琼脂糖凝胶电泳检测；若片段较小，建议用聚 丙烯酰胺凝胶电泳检测。
条件性基因敲除与敲入ppt课件
构建Cre转基因动物与构建普通转基因动物的方法相
似，最为常用的基因转移方法仍为受精卵雄性原核
显微注射法和胚胎干细胞的囊胚注射法。
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先将Cre时空特异表达载体线性化后注入雄性原核，使其以随机插入的 方式整合进基因组，然后将该受精卵或早期胚胎植人到假孕母鼠的输 卵管或子宫内。受精卵雄性原核显微注射法的具体步骤简述如下：
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经典的基因敲除的具体实施方法可以简述如下： 选择需要研究的目的基因的部分或全部DNA片 段，通过分子生物学方法使其产生突变，然后 与相应的载体进行重组，成为靶载体。分离试 验动物的胚胎干细胞，在体外将上述靶载体导 入到胚胎干细胞内，使其与细胞内相似或相同 的序列进行同源重组，替代细胞内原来的基因。 通过一定的筛选方法筛选出发生同源重组的细 胞，再将其注入囊胚腔内；把经过上述处理的 囊胚重新植入到假孕小鼠的子宫内，使其发育 成为一个完整的个体。含有相应突变基因的嵌 合体雄性小鼠与正常雌性小鼠进行交配后，通 过筛选可获得携带该突变基因的纯合子小鼠。
条件性基因敲除与敲入
1
在科学研究中，为了明确某一组织或器官的功能， 常将实验动物体内所要研究的组织或器官切除，进 而根据实验动物的生理指标或功能的变化来推测切 除部分的功能。生命科学发展到今天，人们对于生 命现象的认识已经逐步深入到了分子水平，而上述 的“部分切除—观察整体—推测功能”的研究思想 仍然有效。具体地说，就是在分子水平破坏想要研 究的基因，然后观察生物体的生理指标、功能、整 体形态、组织结构、发育过程的变化等，进而推测 相应基因的功能。这种研究过程称为基因敲除(gene knock out)。此外，为了研究某种疾病与某个基因之 间的关系，常向生物体内人为引入某个基因，然后 观察实验动物出现的各种变化，从而推测疾病与基 因的关系，这种研究方法称为基因敲人(gene knock in)。
基因敲除小鼠制作的基本流程
基因敲除小鼠制作的基本流程(一)基因打靶载体的构建基因打靶载体的基本结构：中间为正筛选基因和相关序列，左右分别为长短同源臂以及在长同源臂外为负筛选基因。
设计载体时，需要在打靶位点两侧分别设计一段大小为几kb长度的同源臂，用于同源重组。
大家普遍认为同源臂越长，重组效率越高。
不过，也有研究用不到1kb的同源臂完成实验，而同时也有研究证实同源臂长度超过8kb后对于同源重组效率的提高就不再有明显的提高作用。
同源重组效率最主要还是由目标位点和打靶基因周围序列决定的，所以研究者现在普遍采用一长一短的适中长度同源臂设计方式，便于后期用PCR 进行筛选以及最终的DNA印迹(southern blotting)检测确认打靶是否成功。
短同源臂长度为2～3kb，而长同源臂为4～6kb。
(二)ES细胞基因打靶和中靶克隆的筛选目前使用的小鼠ES细胞主要来源于129、 C57BL/6和BALB/c背景的小鼠。
研究者们将同源重组应用到ES细胞中从而获得了定点基因修饰的目的，通过将DNA片段导入细胞中，利用片段上的宿主细胞同源臂进行同源重组，将目的基因置换插入细胞基因组中整合表达。
在ES细胞中进行同源重组需要将打靶载体进行线性化后，通过诸如电转染(electroporation)、核转染等手段导入细胞中，研究已经证明线性化载体更有利于同源重组的发生。
目前，基因打靶事件的确定通常是首先用PCR反应筛选中靶的ES 细胞克隆。
PCR引物的设计原则是一个引物位于同源臂外，另一个引物位于载体内。
用PCR扩增同源臂短臂，成功的基因打靶克隆会有扩增产物出现。
阳性克隆还需要Southem blotting分析进一步验证。
确定正确后，用于下一步的ES细胞显微注射，一体以产生嵌合体小鼠。
(三)ES细胞克隆的胚胎显微注射和胚眙移植筛选得到的中靶细胞通过显微注射的方式注入到囊胚期胚胎的囊胚腔中，然后将囊胚移植到如假孕母鼠体内，从而产生子代嵌合小鼠。
(四)基因敲除小鼠培育嵌合小鼠需与野生型小鼠交配，以实现基因修饰生殖系传递。
CDAA诱导基因敲除小鼠
CDAA诱导基因敲除小鼠实验室说明
• 饮食诱导如CDAA饲料诱导小鼠（NAFLD），是一种常规病理学研究 实验； • 文献中特定的基因敲除小鼠BidΔ hep，在相同的CDAA饲料诱导情 况下，选取不同阶段NAFLD肝脂肪变性到HCC肝细胞性肝癌变异过 程中，病理学实验结果表明：CDAA喂养48周后，BidΔ hep小鼠在 HCC肝细胞性肝癌发展过程中有明显抑制作用，而小鼠自身体重、 肝组织比重没有明显差异。 • 实验室动物造模试验说明：肝细胞Bid基因，在HCC肝细胞性肝癌 形成中有重要作用；同时为慢性肝病变（肝细胞凋亡）基因研究 提供可靠的数据。
CDAA用于Bid-基因敲除小鼠实验 (BidΔhep)
• 参考文献发表在2015年 • Cell Death and Differentiation (2015), 1–10 • 美国，圣地亚哥加利福尼亚大学(University of California HCC：hepatocellular carcinoma（肝细胞性肝癌） • 基因组学上，采用基因缺失小鼠，在饮食诱导情 况下，观察肿瘤生长周期对比数据得出，特定基 因在肝癌代谢发展中的抑制作用。
肝肿瘤细胞对比
肿瘤形态大小及切片标记后，WT显示肿瘤发展是BidΔhep 小鼠的四倍。
肿瘤标记物TUNEL-positive实验
饮食诱导喂养小鼠CDAA饲料20周后，TUNEL-positive标记显示： 对比WT小鼠，BidΔ hep小鼠肿瘤细胞明显受到抑制 抑制的程度用Mann–Whitney测试量化：指标大于1倍
实验设计
• 造模时间：12 months • 实验动物：BidΔhep & Bidflo/flo mice, 8w • 基因改造小鼠8w入组，持续喂食CDAA；观察1 年
《基因敲除技术》PPT课件
1.什么是传统机械按键设计？
传统的机械按键设计是需要手动按压按键触动PCBA上的开关按键来实现功 能的一种设计方式。
传统机械按键结构层图：
按键
PCBA
开关键
传统机械按键设计要点：
1.合理的选择按键的类型，尽量选择 平头类的按键，以防按键下陷。
2.开关按键和塑胶按键设计间隙建议 留0.05~0.1mm，以防按键死键。 3.要考虑成型工艺，合理计算累积公 差，以防按键手感不良。
系统来介导Cre 的表达，则可省去建立携带 Cre 的转基因动物的过程。
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2.2利用随机插入突变进行基因敲除。
2.2.1 原理：
此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或 其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入 突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后 通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞 （原理见图5）[11,12] 。根据细胞的不同，插入载 体的选择也有所不同。逆转率病毒可用于动植物细 胞的插入；对于植物细胞而言农杆菌介导的T-DNA 转化和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基因敲 除。
ｄ．选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然 发生率极低，动物的重组概率为10－2～10-5，植物的概率 为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同 源重组的胚胎干细胞非常重要。目前常用的方法是正负筛选 法（PNS法），标记基因的特异位点表达法以及PCR法。其中 应用最多的是PNS法。
并且这种效应可以传递到子代细胞中,所以 RNAi的反应过程也可以用于基因敲除。近年 来，越来越多的基因敲除采用了RNAi这种更 为简单方便的方法。
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2.3.1 RNAi阻断基因表达的机理 双链RNA进入细胞后，能够在Dicer酶的作用下被裂
条件性敲除小鼠
条件性敲除小鼠定义：条件性基因敲除小鼠（也叫Flox小鼠）是指在目的基因中含有成对的loxp位点的小鼠，与Cre工具小鼠交配后可在特定的组织或细胞中敲除目的基因。
CKO如何实现？重组酶系统（如：Cre-loxP）介导的位点特异性重组技术。
Cre是重组酶（38kDa），可识别34bp 长的DNA 序列loxP。
loxP 两侧各13bp 构成回文结构，中间8bp为非回文结构，因此loxp具有方向性。
（当DNA 分子上存在两个同向loxP 序列时，Cre可将两个loxP 序列之间的DNA 片段切出并环化，同时将loxP 两侧的序列进行连接；当DNA 分子上存在两个方向相反的loxP 序列时，Cre 可导致loxP 之间的序列发生反转。
）CKO敲除的是什么？条件性基因敲除的靶基因中必须带有可以被Cre 重组酶识别的loxP 序列，这种基因称为floxed gene。
带有floxed 靶基因的小鼠称为flox 小鼠。
在这种小鼠中，通常采用DNA 同源重组方法，在拟敲除基因片段的两侧分别放置一个同向的loxP 位点。
loxP 位点的存在应不影响该基因的功能，故选择对照为flox/flox小鼠CKO敲除何时何地发生？除了flox 小鼠以外，重组酶系统介导的条件性基因敲除还需要另一类重要的基因工程小鼠的参与——Cre 工具鼠。
Cre 工具鼠中，将Cre 重组酶的编码序列置于特定的基因启动子下，Cre 的表达特性决定了靶基因何时何地发生敲除。
Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的敲除就发生在哪种组织细胞；Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率；使用诱导型Cre 重组酶可以通过给予诱导剂，决定在特定的发育时期或疾病发生阶段，定时地进行基因敲除。
（范衡宇老师课件）实验时，将flox 小鼠和Cre 工具鼠进行交配，最后获得flox 纯合且Cre 杂合的小鼠。
在这类小鼠中，凡是表达Cre 的细胞，两个loxP 之间的序列被切除，从而实现组织特异性基因敲除。
第九-十一章 转基因鼠的构建过程2、小鼠的基因敲除(gene knockout)流程
第11章1、转基因鼠的构建过程PPT-显微注射法：(1)用显微注射法将纯化的外源基因片段导入受精卵的雄原核内；(2)将微注射后经鉴定为存活的受精卵移植到同步交配的假孕母鼠的输卵管内，其中一部分移植卵能够继续生长发育成个体；(3)鉴定子代鼠中外源基因的整合和表达；(4)转基因动物品系的建立。
补充-逆转录病毒法：将插入有外源基因的逆转录病毒载体DNA，通过辅助细胞包装成高感染低毒的病毒颗粒，再感染上升期的胚胎细胞，随后将胚胎导入子宫，可发育成携带外源基因的子代动物。
补充-胚胎干细胞法：(1)分离培养ES细胞先要获取发育至一定时期的胚胎，经培养后，剥离和分散内细胞团，再行培养，最后分离，扩大培养并鉴定ES细胞;(2)在ES细胞上的基因操作通过基因打靶技术，将外源基因导入ES细胞，体外培养和筛选外源基因表达者；(3)获取囊胚细胞，作为ES细胞的移植受体；(4)通过显微操作将ES细胞注入到囊胚期胚胎的腔内，与其细胞团紧靠在一起，成为嵌合体；(5)将注射过的胚胎，经培养后筛选无发育缺损的囊胚，移植到交配第三天的假孕受体鼠子宫内，培育出转基因动物。
2、小鼠的基因敲除（gene knockout）流程基因敲除是采用同源重组的方法，用体外合成的无效基因或突变基因取代相应正常基因，再应用转基因方法孵育出转基因动物。
简：将灭活的基因导入ES细胞中，使这一灭活基因通过同源重组取代原有的目的基因，筛选到基因已定点灭活的细胞后，通过显微注射将细胞注入小鼠囊胚中。
细胞在小鼠囊胚中参与胚胎的发育，最终形成嵌合体小鼠。
由于嵌合体小鼠的一部分细胞来源于ES细胞，所以通过小鼠培育即可获得纯合子基因敲除小鼠。
繁：a.获取ES细胞ｂ．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因的载体上，此重组载体即为打靶载体。
ｃ．将基因打靶载体通过一定的方式(常用电穿孔法)导入同源的胚胎干细胞(EScell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将打靶载体中的DNA序列整合到内源基因组中从而得以表达。
小鼠基因敲除的基本步骤
小鼠基因敲除的基本步骤小鼠基因敲除听起来可能有点复杂，但别担心，我来给你简单明了地讲讲这个过程，顺便还想聊聊小鼠这个家伙的可爱之处。
首先，咱们得知道，基因敲除就是把某个特定基因给“关掉”，这样就能研究这个基因对小鼠的影响，简而言之，就是给科学家们提供了一扇观察基因如何工作的窗子。
1. 准备工作1.1 选择目标基因在一切开始之前，科学家得先决定要敲除哪个基因。
这个就像选口味一样，你可以选择巧克力、香草，还是草莓？每个基因都有自己的“性格”，而你要的就是找到那个特别的、让你心动的。
为了决定哪个基因最重要，科学家们通常会做一些文献调研，看看过去的研究成果，找出哪些基因和疾病、行为等方面有关系。
1.2 制备小鼠胚胎干细胞一旦选定了目标基因，接下来就要制备小鼠胚胎干细胞。
这些细胞就像是小鼠未来的“小宇宙”，能够发展成任何细胞。
科学家们会取小鼠的胚胎，经过一系列的处理，把这些细胞培养出来。
想象一下，就像是种花一样，浇水、施肥，让它们茁壮成长。
不过，咱们这次不是为了观赏，而是为了科学实验！2. 基因编辑2.1 设计靶向载体这一步就有点像是制作一张地图，科学家要设计一个靶向载体，把这个载体引导到目标基因的位置。
这个载体就像是一个快递包裹，里面装着“关掉”目标基因的指令。
科学家们利用一些分子生物学的技术，把这个载体制作好，准备在小鼠胚胎干细胞里实施“任务”。
2.2 转染小鼠胚胎干细胞有了载体，接下来就是把它送进小鼠的胚胎干细胞里。
这一步可得小心翼翼，像是把珍贵的陶瓷小心翼翼地放进柜子里。
科学家们会用一些化学试剂，或者电穿孔的方法，把载体导入细胞内。
这时，载体就会开始和目标基因“打招呼”，并实施敲除的计划。
3. 产生转基因小鼠3.1 筛选成功的细胞完成转染后，科学家需要筛选出那些成功“敲掉”基因的细胞。
这个过程有点像考试，只有通过了才能进入下一轮。
科学家会用一些特定的标记物来检测这些细胞，看看有没有成功的小伙伴。
如果找到了，哇，那可是大大的喜讯！3.2 复制小鼠最后一步是把这些成功的细胞注入到小鼠胚胎里，然后再将这些胚胎植入到代孕母鼠的体内。
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4. 晾干沉淀，加入100ul的PCR级的水。
二、PCR扩增
变变 90变95变
70变75变
cycle
变变
变变 40变60变
25～30 次循环后，模板DNA的含量可以 放大100万倍以上。
动画
PCR:（20ul体系）
可以互相讨论下，但要小声点
三、琼脂糖凝胶电泳
原理： 在pH8.0~8.3的缓冲液中，核酸分子带负电荷，
向正极移动。由于不同大小和构象的核酸分子电荷密度 大致相同，因此在自由泳动时，各种核酸分子的迁移率 相似，无法分开。然而，在浓度适当的凝胶中，由于分 子筛效应，使大小和构象不同的核酸迁移率出现差异， 从而把它们分开。核酸在凝胶中的迁移率取决于其分子 大小、高级结构、胶浓度和电场强度，与分子的碱基组 成及电泳温度（4℃~30℃之间）无明显关系。一般说， 同样构象的分子迁移率与分子量对数及胶浓度成反比， 与电场强度（小于5V/cm）成正比。
基因敲除小鼠的实验流程
一、动物基因组DNA的提取
实验原理 真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来
制备基因组 DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式 存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将 DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分 子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞 在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化 分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得 到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
每只小鼠鼠尾加入500ul裂解液和10ul 蛋白酶 K(20mg/ml)，55度水浴过夜，至鼠尾溶解。
提DNA步骤： 1. 每管鼠尾加入300ul饱和NaCl，充分混匀，
12500rpm 离心20min 2. 取上清700ul至新的离心管中，加入预冷的异丙
醇700ul，上下颠倒混匀，动作轻柔，直至看到 絮状DNA析出为止, 12500rpm 离心20min， 弃上清
琼脂糖凝胶电泳ຫໍສະໝຸດ 2x Mix 无菌水 2pmol引物1 2pmol引物2 2pmol引物3 模板DNA
10ul 2ul 2ul 2ul 2ul 2ul
PCR扩增仪
95℃ 3min 95℃ 30sec 60℃ 30sec 72℃ 30sec 72℃ 5min
35 cycles
大家有疑问的，可以询问和交流