临床生化检验：第二十四章 氧化应激的生物化学检验
氧化应激（oxidativestress）与氧化损伤
氧化应激（oxidativestress）与氧化损伤自由基和活性氧是重要的生物活性物质，那么氧化损伤是否存在。
其实在生物体系中，氧化损伤不仅存在，而且自由基和活性氧导致的氧化损伤在许多疾病发生发展中发挥十分重要的作用。
具有重要生理功能的物质同时也可以导致机体损伤，是否存在矛盾？一、生命在于平衡任何事情都有两面性。
例如，氧气十分重要，当空气中氧气浓度低于15%，我们就会发生缺氧。
但是把氧浓度提高到70%以上，长时间呼吸氧气就会对肺造成严重伤害。
假如我们的空气中只有氧气，我们根本无法长时间生存，存活很难超过一月，因为氧气本身就属于自由基，当浓度过高，暴露时间过长，就会使肺发生严重的氧化损伤，这就是肺慢性氧中毒。
如果在高压下呼吸氧气，甚至可导致全身，特别是脑功能迅速伤害，严重时表现为惊厥大发作，这就是急性氧中毒。
又比如血液中葡萄糖是我们赖以生存的物质，如果血液中葡萄糖浓度太低（低过4.0 mM），就会发生低血糖。
低血糖比高血糖危害更大，非常容易威胁患者生命，对于高血糖的危害，糖尿病患者甚至一般读者都知之较多，也非常重视，而对于低血糖的严重性往往重视不够。
再一个例子是关于钙等微量元素，一般我们都非常担心缺钙，但可能不了解，细胞内游离钙离子浓度升高几乎是所有细胞损伤甚至死亡的重要介质。
另如酸硷平衡、激素浓度、氨基酸的神经兴奋性、高血压和低血压和高低体温等等。
这样的例子在生物体系中不胜枚举。
可以说，生物功能的维持就是多种因素的动态平衡，许多重要的物质和生命指标都必须控制在一个有限的正常范围内，过低或过高都无法维持正常的生理过程。
医学生理学领域把这种现象称为稳态。
以上事例说明，我们判断一种物质是否有害，是要根据具体情况，对生物活性物质，我们必须了解同样一种物质，在有的情况下对机体有用，而有的情况下对机体有害，绝对不能简单地把一种物质如自由基看作什么百病之源，万恶之首。
许多商业宣传往往把某种有害因素过分夸大，把自己产品的有利作用随意夸张，这显然是错误的。
临床生物化学检验技术试题及答案(八)
临床生物化学检验技术试题及答案第十三章内分泌疾病的生物化学检验一、A型题：1．甲状腺激素发挥效应与下列何类信号途径关系最为密切?（）A．cAMP-PKA信号途径B．以IP3和DAG为第二信使的信号途径C．以单跨膜片段为受体的信号途径D．与酪氨酸激酶有关的信号途径E．与热休克蛋白有关的信号传导途径2．甲状腺激素来源于：（）A．甲状腺胶质细胞B．甲状腺腺泡细胞C．甲状腺滤泡旁C细胞D．甲状腺胶质细胞及甲状腺滤泡旁细胞E．甲状腺腺泡细胞及甲状腺胶质细胞3．鉴别原发性和继发性甲状腺功能减退最好的方法是：（）A．TSH测定B．TT3、TT4测定C．甲状腺131I吸收D．FT3、FT4测定E．TGA、MCA4．诊断甲状腺功能减退最敏感的试验是：（）A．基础代谢率测定B．血清T4测定C．血清T3测定D．血清TSH测定E．甲状腺131I吸收率测定5. 下列哪一项与Graves病无关?（）A．甲状腺功能刺激抗体(TSAb)B．甲状腺球蛋白抗体(TGA) C．抗微粒体抗体(MCA)D．抗T3、T4抗体E TSH受体抗体(TRAb)6．下列哪种检查结果不符合原发性甲状腺功能减退症?（）A．血清蛋白结合碘低于正常B．游离FT3、FT4低于正常C．血胆固醇增加D．血清TSH增高E．膝腱反射亢进7．垂体性甲亢主要是哪一种激素原发性升高?（）A．TRHB．TSHC．FT3、FT4D．rT3E．以上都不是8．直接进入细胞核内，与核受体结合发挥作用的激素有：（）A．糖皮质激素、胰岛素B．肾上腺素、去甲肾上腺素C．胰岛素、雄激素D．三碘甲状腺原氨酸、维甲酸E．糖皮质激素、儿茶酚胺9．下述激素必须通过细胞膜上受体才能发生效应的有：（）A．血管加压素、胰岛素样生长因子和儿茶酚胺B．糖皮质激素、儿茶酚胺和甲状腺素C．CRH、醛固酮和甲状腺激素D．胰岛素、前列腺素和雄激素E．胰岛素样生长因子、生长激素和糖皮质激素10．有关激素水平的测定正确的是：（）A．激素分泌与体位无关B．激素水平高于或低于正常一定提示功能异常C．使用化学发光和酶免法，随时可取血测定D．24小时尿中激素浓度的测定受影响更少E．激素分泌与情绪无关11．关于正常人皮质醇节律，下列说法哪项正确?（）A．清晨最高，下午最低B．午夜最高，下午最低C．下午最高，午夜最低D．清晨最高，午夜最低E．午夜最高，清晨最低12.下列哪项不是肾上腺皮质增多症的临床表现?（）A．糖耐量异常B．血压增高C．血脂增高D．血钙减少E．发育延迟(小儿) 13．皮质醇增多症患者的临床表现．少见的是：（）A．水牛背B．胆固醇明显增高C．高血压D．骨质疏松E．高血糖14．男，20岁，多毛，肥胖，24小时尿游离皮质醇浓度增高，小剂量地塞米松不能抑制，大剂量地塞米松能抑制。
氧化应激 PPT课件
阴性对照组+H2O2
实验方案
MTT和LDH 测定
SOD和GSH测 定
Western blot方法
Real-time PCR
细胞存活率
氧化应激程度
Nrf2表达
抗氧化基因 HO-1,NQO-1
研究意义
心血管 疾病 神经系 统疾病
癌症
氧化应 激
泌尿系 统疾病
糖尿病
THE END
立论依据
活性氧的化学性质非常活泼，
1、能够攻击生物膜磷脂中的多聚不饱和脂肪酸，引发脂 质过氧化作用，使细胞膜、细胞器膜等膜结构受损、功能 障碍； 2 、在活性氧的作用下，脂质和膜蛋白以及某些酶发生交 联、聚合或肽链的断裂，造成蛋白质结构改变，使其失去 活性，功能丧失。 3、活性氧可作用于 DNA，与碱基发生反应，从而使碱基 发生修饰、断裂和交联，引起基因突变。
够抵抗细胞的氧化应激损伤，对多种疾病具有抗氧化的保 护作用。然而， Srxn1在氧化应激中的作用机制还未被深 入研究。
参考文献
1、坚哲.Nrf2-ARE信号通路在白癜风氧化应激发病中的作用和机制研 究.第四军医大学.R758.41 2、赵晶晶，张农。核因子相关因子 2在氧化应激性纤维化疾病中的最 新研究进展。复旦大学上海医学院。 3、李琼。 Sulfiredoxin-1对双氧水诱导的 PC12细胞氧化应激损伤的 保护作用研究。重庆医科大学。 4、邹颜阳。Sulfiredoxin-1经Nrf2/ARE通路保护PC12细胞氧化损伤 的机制研究。重庆医科大学
Sulfiredoxin-1通过Nrf2-ARE信号 通路发挥抗氧化应激的机制
报告提纲
立论依据
研究内容
参考文献
实验方案
研究意义
临床生物化学检验-第27章 氧化应激的临床生化检验
抗氧化和氧化应激损伤指标检测的方法与方法学评价。
自由基、活性氧、氧化应激、脂质过度氧化作用的概念与种类； 氧化应激损伤机制、抗氧化损伤的防御系统组成和作用。
氧化应激与疾病和衰老的关系；氧化应激的原因。
氧化应激 (oxidative stress, OS)：机体受到各种内外源因素的干扰 ，使体内的活性氧 (reactive oxygen species, ROS) 自由基和活性氮 (reactive nitrogen species, RNS) 自由基等相关物质产生过多 ，氧化程度超出抗氧化物的清除能力 ，氧化系统和 抗氧化系统失衡 ，从而导致分子、细胞和机体损伤的状态。
自由基 (free radical)： 自由基是单独存在的 ，最外层电子轨道上具有不配对电子的离子、原子、分子基团 ，化学性质十分活泼 ，极易与周围分子发生反应 ，具有多种生物学活性。
活性氧 (reactive oxygen species, ROS)： R OS是一类由氧形成、并在分子组成上含有氧且化学性质比氧自身活泼的物质的总称。
ROS包括超氧阴离子 (O2-)、羟 自由基 (·OH)、烷氧基 (RO ·)、烷过氧基 (ROO ·) 等氧自由基及过氧化氢 (H2O2)、 单线态氧 (single oxygen, 1O2)、氢过氧化物 (ROOH) 和次卤酸 (HOX) 等。
活性氮 (reactive nitrogen species, RNS)： NO及其生物体内继发性产物的统称。
R NS包括一氧化氮 (NO)、二氧化氮 (NO₂) 和过氧化亚硝酸盐 (ONOO-) 等。
1.ROS过多(1) 外源性因素 ：① 加热；② 环境化学污染物； ③ 电离辐射；④ 细菌感染。
(2) 内源性因素 ： ① O2-的产生； ② ·OH的产生； ③ 脂质过氧化作用；④ 一氧化氮 (NO) 的产生； ⑤ 吞噬细胞中活性氧的产生。
临床生物化学检验基本知识课件
质量控制程序等的组合称为检测系统。
(四)实验室检测系统
参考系统 常规检测系统 校准品 校准 常规方法 检测
各实验室的检 测结果之间必须具 有跨时空的可比性，
一级标准 标化 参考方法 检测
而实现这一目标的
重要手段是建立和 保证检验结果的可
新鲜病人样品
获得 可比性良好 获得
参考值与环境必须满足工作人员健康和安 全防护的需要，应按照本实验室要求最严格的仪器建
立环境控制限，使照明、能源、水质、通风、灰尘、
电磁干扰、辐射、温度、湿度、消毒、网络、声级和 震级等完全符合检验质量要求。
(二)仪器和设备
基本管理要求
仪器设备使用人员经过严格的培训并授权。 新购置的仪器和设备在安装好后，应由生产厂家对设备和 检测系统的性能进行校准。 根据仪器说明书的承诺对各项参数进行验证。
---标准物质 注意：单一纯品标准液、经过加工处理的质控品
及校准品和临床标本的基质是完全不同的，检测时，
它们与标本虽然是在完全相同的体系下反应，但由于 基质效应不同，所以检测结果可能有所差别。因此， 实验室在使用标准物质时必须了解它们的这些差别， 并注意其专用属性。
(三)外部供应品
---标准物质
(二)组合检验
提高疾病诊断敏感度：如将γ-谷氨酰基转移酶(γ-GT)、αL-岩藻糖苷酶(AFU)、甲胎蛋白(AFP)组合在一起检测，可 提高原发性肝癌的诊断敏感度。许多实验室将几个不同的 “项目组合”成一个大的“体检系列”来筛查某些疾病， 用于健康监督。 了解某器官不同功能状态：如将蛋白质、胆红素、丙氨酸 氨基转移酶( ALT)和门冬氨酸氨基转移酶( AST)等项目组 合成“肝功能”系列，可以了解肝脏的蛋白质合成功能、 胆红素的排泄和转化功能、以及肝细胞损伤程度。
体内氧化应激损伤的评估方法
体内氧化应激损伤的评估方法随着现代人们的生活条件不断提高和寿命延长，慢性疾病的问题日益突出。
其中一个重要的因素就是氧化应激损伤，即氧自由基和活性氧物质对细胞分子的攻击和破坏。
氧化应激损伤的发生和积累会导致各种慢性疾病，包括心血管疾病、癌症、神经退行性疾病等等，因此如何评估氧化应激损伤变得尤为重要。
本文旨在介绍体内氧化应激损伤的评估方法。
首先，氧化应激损伤的评估需要了解氧自由基和活性氧物质的生成和消除。
氧自由基包括超氧阴离子、羟自由基；活性氧物质包括单线态氧分子和氢氧自由基等等。
它们与身体内蛋白质、脂质、核酸等分子相互作用，导致细胞膜、蛋白质、氧化还原途径等组织结构和功能的变化，从而影响人体健康。
其次，体内氧化应激损伤的评估方法包括实验方法和临床方法。
实验方法是在实验室中测量氧化应激指标的变化，常见的指标包括氧化脂质、氧化蛋白质和DNA氧化损伤等。
通过检测这些指标的变化，可以推断体内氧化应激水平的高低。
其中，氧化脂质检测是衡量氧化应激的重要方法之一。
脂质分子在氧化过程中形成的自由基会引起脂质过氧化反应，产生大量的丙二醛（MDA）等证据。
通过检测血液和组织中MDA的水平，可以判断体内脂质氧化的水平。
临床方法是应用生物体内自身的反应来评估氧化应激的水平。
目前最常用的方法是测定血清中的抗氧化酶（SOD、CAT等）和非酶抗氧化指标（葡萄糖醛酸、总抗氧化能力等）的水平。
这些反应物可以反映机体内抗氧化能力的程度，即抵御和清除氧自由基的能力。
除此之外，还有一些先进的分子遗传学方法，如单核苷酸多态性（SNP）和表观遗传学标志物等可在基因水平上探讨氧化应激和氧化应激相关疾病的关系。
虽然这些方法在评估氧化应激有一定的先进性和预测性，但由于技术的限制和方法的复杂性，目前在临床诊断和治疗中尚未得到普遍应用。
总的来说，体内氧化应激损伤的评估方法主要包括实验方法和临床方法，二者可以互相补充，每种方法各有优缺点。
为了更全面和准确地评估氧化应激水平，我们需要根据不同情况，选择合适的方法进行评估。
临床生化检验名词解释
1.急性时相反应蛋白：在炎症性疾病如手术、创伤、心肌梗死、感染、肿瘤等情况下，血浆中一系列浓度发生变化的蛋白质的总称，其中大部分蛋白质如AAT、AAG、Hp、Cp、CRP、C3和C4等浓度升高，PA、Alb和TRF等浓度下降。
这些血浆蛋白质统称为急性时相反应蛋白．2.苯丙酮酸尿症：苯丙酮酸尿症是由于苯丙氨酸羟化酶先天性缺乏所致，属常染色体隐性遗传，因患儿尿液中排出大量苯丙酮酸等代谢产物而得名。
3.双缩脲反应：血清中蛋白质中相邻的肽键（- CO -NH -）在碱性溶液中能与二价铜离子作用产生稳定的紫色络合物。
此反应和双缩脲在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似，因此将蛋白质与碱性铜的反应称为双缩脲反应。
4.痛风：痛风是一组嘌呤代谢紊乱所致的疾病，由于遗传性和（或）获得性的尿酸排泄减少和（或）嘌呤代谢障碍，导致高尿酸血症及尿酸盐结晶形成和沉积，从而引起特征性急性关节炎、痛风石、间质性肾炎，严重者呈关节畸形及功能障碍；常伴尿酸性尿路结石。
5.糖尿病：是一组由胰岛素分泌不足和（或）作用缺陷所引起的以慢性血糖水平增高为特征的代谢性疾病。
6.胰岛素抵抗：是指胰岛素作用的靶器官（主要是肝脏、肌肉和脂肪组织）对正常浓度的胰岛素不能产生正常的生物学反应，即组织对胰岛素敏感性降低。
7.代谢综合征.：是与代谢异常相关的心血管病多种危险因素在个体内聚集的状态。
MS的基础是IR,其主要组成成分是肥胖症尤其是中心性肥胖、2型DM或糖调节受损、血脂异常和高血压。
8.空腹血糖：是指8 ~10h内无任何热量摄入时检测的静脉血浆葡萄糖水平。
9.糖化血红蛋白：是葡萄糖或其他糖与血红蛋白的氨基发生非酶催化反应的产物(一种不可逆的糖化蛋白)。
10.低血糖症：是指血糖浓度低于参考值水平下限，临床出现以交感神经兴奋和脑细胞缺糖为主要特点的综合征。
一般以血浆葡萄糖浓度低于2. 8mmol/L时作为低血糖症的标准。
11.载脂蛋白:脂蛋白中的蛋白质具有运脂质的作用故被称为载脂蛋白。
氧化应激类检测
氧化应激类检测氧化应激(Oxidative Stress，OS)是机体应答内外环境，通过氧化还原反应对机体极性多层次应激性调解和信号转导，同时造成氧化损伤的重要生命过程。
机体的调节机制会使体内处于相对自稳态，正常代谢使机体处于自稳态的瞬间，会产生氧化产物，通常用所研究系统中或体内氧化增强剂和抗氧化剂之比来衡量其应激水平。
迪信泰检测平台采用生化法，实现对多种氧化应激类物质高效、精准的测定。
目前可检测的氧化应激类物质包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、丙二醛和过氧化氢等。
此外，我们还提供氧化应激系列生化试剂盒产品，以满足您的不同需求。
5种氧化应激类物质含量比较迪信泰检测平台可检测氧化应激类项目丙二醛(MDA)含量检测脯氨酸(PRO)含量检测过氧化氢(H2O2)含量检测超氧化物歧化酶(SOD)活性检测过氧化氢酶(CAT)活性检测过氧化物酶(POD)活性检测多酚氧化酶(PPO)活性检测苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性检测黄嘌呤氧化酶（XOD）活性检测葡萄糖氧化酶(GOD)活性检测二胺氧化酶(DAO)活性检测二氢黄酮醇还原酶(DFR)活性检测花青素还原酶(ANR)活性检测总抗氧化能力(T-AOC)检测超氧阴离子含量检测超氧阴离子清除能力检测羟自由基清除能力检测蛋白质羰基含量检测单宁含量检测铜蓝蛋白(Cp)含量检测尿酸(UA)含量检测总巯基含量检测非蛋白质巯基含量检测植物总酚(Tp)含量检测植物类黄酮含量检测植物原花青素(OPC)含量检测植物花色苷含量检测生化法测定氧化应激类物质样本要求：1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL，测定样品不返还，请您保留备份。
周期：2~3周项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：1. 实验步骤（中英文）2. 相关参数（中英文）3. 图片4. 原始数据5. 指定氧化应激类物质含量/酶活性信息。
氧化应激
诱导抗氧化有关的酶类产生：
•超氧化物歧化酶（SOD）、 •过氧化氢酶（CAT）、 •谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px） 等。
减轻氧化硝基化损伤
维持金属离子稳态
降低心脏自噬作用
金属离子 稳态
转运 代谢
重金属 清道夫
•缓解金属 离子浓度 过高造成 的结构损 伤 •解除金属 诱导的细 胞毒性 •保护心肌 细胞
非特异性
不产生新氧化物质
靶向分布
安全性
• MT抗氧化过程中不影响心肌细胞正常功能表达
减轻氧化硝基化损伤
维持金属离子稳态
降低心脏自噬作用
氧化还原循环：
•低氧化水平时，当环境氧化程度 因为某些因素例如谷光甘肽 （GSH）/氧化型谷胱甘肽（GSSG） 比例增加而减弱，Zn结合MT-硫醇 生成MT； •高氧化水平时，随着在ROS或 GSSG存在下环境氧化程度增加， MT在Se催化作用下转为MT-硫醇 结合自由基，Zn被释放出来作用 于蛋白质、脂质等生物大分子。
MT-mRNA
检测 金属饱和度测定法 电化学方法
质谱偶联法
巯基显色法 分 离 电泳法 色谱分析法 层析法 DEAE-Sepharose Fast Flow
凝胶电泳、毛细管电泳 高效液相色谱法（HPLC）、高效液相原子吸收法（HPLC-AAS） 离子交换层析法等
纯化
抗酸 抗碱
高金属 含量
低分子 量
高诱导 性
减轻氧化硝基化损伤
维持金属离子稳态
降低心脏自噬作用
PI3K（I） -Akt信 号通路
代谢失 调
自噬信 号级联
减少心 脏畸形
氧化应激
• 指机体在内外环境有害刺激的条件下，体内产生活性氧自由基（ROS）和 活性氮自由基（RNS）所引起的细胞和组织的生理和病理反应。 • 可以直接或间接氧化或损伤DNA、蛋白质和脂质，可诱发基因突变、蛋白 质变性和脂质过氧化，被认为是人体衰老和各种重要疾病的主要危险因子。
临床生物化学检验-第29章 临床毒物的生物化学检验
一氧化碳中毒、氰化物中毒、 乙醇中毒以及有机磷农药中毒常用检验方法的原理及方法学评价。
毒物、药物滥用及中毒的概念以及临床常用的药物中毒检验方法及方法学评价。
毒物的分类、影响毒物作用的因素以及临床常见毒物及药物中毒机制。
毒物 (toxicant)： 在一定条件下 ， 进入生物体后通过物理或者化学作用 ，侵害机体的组织和器官 ， 破坏机体正常的生理功能 ， 引发机体功能性或器质性病变 ， 甚至 危及生命造成死亡的物质。
毒品 (narcotic drugs)： 鸦片、海洛因、 吗啡、 大麻、 可卡因、 甲基苯丙胺及国家规定管制的其他能够使人成瘾的药品。
药物滥用 (drug abuse)： 用药者故意不按医学所规定的用途 ， 多次、 连续地摄入麻醉及精神药品 ，导致药物依赖和精神依赖。
常见毒物及检测方法
一氧化碳 (CO)：分光光度法、气相色谱法等，可用煮沸法、氢氧化钠法等进行定性。
氰化物：普鲁士蓝法、比色法、色谱法等。
乙醇：呼气法、碘仿反应、酶法等。
三环类抗抑郁药物：色谱法、免疫法等。
抗组胺类药物：化学定性法、中和滴定法、色谱法等。
有机磷酸脂类化合物： HPLC等色谱法。
苯丙胺类、大麻类等：可用胶体金免疫层析法对尿液进行快速筛选。
氧化应激
• 硫氧还原蛋白（TRX） • TRX为细胞内重要的氧化还原调节分子之一；遇有病
毒感染、紫外线和环境污染物等各种刺激时，将诱导其细 胞内表达。 即使TRX单独存在也可表现出对单态氧和羟自 由基的消除作用，除可作为抗氧化剂使用之外，还用做还 原蛋白的二硫键。进一步，就突触传递， TRX能够抑制 ASK1和p38MAPK的活化。再者，认识到TRX也同样向细胞 外释放，显示其细胞因子/趋化因子样作用。有报告指出， 在与人类疾病的相互关系方面，HIV感染者和丙型肝炎患 者的血清中，可出现TRX浓度的上升。此外尚注意到，对 包括风湿性关节炎在内的自身免疫性疾病、缺血再灌注损 伤以及慢性心功能不全之类可导致氧化应激的疾病，亦均 可应用TRX做有效评价。TRX已有检测试剂盒。
氧化应激的产生
• 氧化应激的产生既有内部也有外部的。外因包括接触环境
• •
污染、石化制品或重金属；内因包括慢性或急性感染，还 有血糖调节方面存在的问题。 氧化应激的出现还与生活方式有关，如吸烟、喝酒、 运动过度、服用药物，还有进食过量。特别要注意的是， 日晒（紫外线辐射）过多也会引起氧化应激。 此外，营养物质的缺乏也会导致氧化应激。如果我们 缺硒，或者体内的维生素E、维生素A或其他关键性抗氧化 剂含量不足，那么就无法给自身提供维护抗氧化系统正常 工作的必要因素。体重超重也有危害，脂肪组织制造发炎 分子，从而导致氧化应激。
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大部分与老化有关的健康问题，如皱纹、心脏 病和阿尔兹海默症，都与体内氧化应激过大有关。 正如美国加州大学伯克利分校的邓汉姆· 哈尔蒙博 士指出的那样：“很少有人能活到他们潜在的最 大寿命。他们往往提早死于各种疾病，其中很大 一部分是自由基引发的。”尽管哈尔蒙博士的研 究成果已经是半个世纪以前的事了，人们却直到 最近才对他的理念有所了解。 事实上，人体几乎所有的器官都很容易受到氧 化应激带来的伤害，症状表现不计其数，如疲倦、 全身无力、肌肉和关节痛、消化不良、焦虑、抑 郁、皮肤瘙痒、头痛，以及注意力难以集中和感 染难以痊愈等。由氧化应激水平升高诱发的最常 见疾病有心脏病、癌症、骨关节炎、风湿性关节 炎、糖尿病以及神经退化性问题如阿尔兹海默症、 帕金森病。
氧化应激检测方法
氧化应激检测方法氧化应激是指机体内氧化与抗氧化失衡所引起的一系列有害反应。
氧化应激与多种疾病的发生和发展密切相关，如神经系统疾病、心血管疾病、肿瘤和炎症等。
因此，准确检测氧化应激的程度非常重要。
本文将介绍几种常用的氧化应激检测方法。
1.抗氧化酶活性测定：超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和过氧化物酶（CAT）是体内重要的抗氧化酶。
这些酶的活性可以反映氧化应激的强度。
例如，SOD活性指标可以通过测定其对还原试剂的抑制能力来进行监测。
GPx活性可以通过观察其对底物的降解情况来进行测定。
而CAT活性可以通过观察其催化底物降解速率来进行测定。
测定抗氧化酶活性可以提供一个直接的指标来评估氧化应激的程度。
2.抗氧化物质的测定：维生素C、维生素E和谷胱甘肽等是体内重要的抗氧化剂。
这些物质的浓度可以通过高效液相色谱法、电化学法等进行测定。
比如，维生素C可以通过高效液相色谱法进行测定。
维生素E可以通过吸收光度法进行测定。
谷胱甘肽可以通过还原试剂反应测定其浓度。
测定抗氧化物质的浓度可以反映体内抗氧化能力。
3.氧化损伤标志物的测定：氧化应激会导致DNA、脂质和蛋白质等生物分子的氧化损伤。
因此，测定氧化损伤标志物的浓度可以反映氧化应激的程度。
例如，通过测定尿液中8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）的浓度来评估DNA氧化损伤。
通过测定血液中丙二醛（MDA）的浓度来评估脂质氧化损伤。
通过测定血液中氧化蛋白（carbonylated protein）的浓度来评估蛋白质氧化损伤。
这些标志物的浓度可以通过各种分析技术进行测定，如高效液相色谱法、气相色谱法等。
4.氧自由基测定：总之，氧化应激的检测方法可以从抗氧化酶活性、抗氧化物质浓度、氧化损伤标志物浓度和氧自由基浓度等方面进行评估。
这些方法可以为研究氧化应激的机制、评估氧化应激的程度以及指导临床治疗提供重要的参考。
临床生化检验名词解释
1。
急性时相反应蛋白：在炎症性疾病如手术、创伤、心肌梗死、感染、肿瘤等情况下，血浆中一系列浓度发生变化的蛋白质的总称，其中大部分蛋白质如AAT、AAG、Hp、Cp、CRP、C3和C4等浓度升高，PA、Alb和TRF等浓度下降。
这些血浆蛋白质统称为急性时相反应蛋白．2。
苯丙酮酸尿症:苯丙酮酸尿症是由于苯丙氨酸羟化酶先天性缺乏所致，属常染色体隐性遗传，因患儿尿液中排出大量苯丙酮酸等代谢产物而得名。
3。
双缩脲反应:血清中蛋白质中相邻的肽键（—CO -NH —）在碱性溶液中能与二价铜离子作用产生稳定的紫色络合物。
此反应和双缩脲在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似，因此将蛋白质与碱性铜的反应称为双缩脲反应。
4.痛风:痛风是一组嘌呤代谢紊乱所致的疾病，由于遗传性和（或）获得性的尿酸排泄减少和（或）嘌呤代谢障碍，导致高尿酸血症及尿酸盐结晶形成和沉积，从而引起特征性急性关节炎、痛风石、间质性肾炎，严重者呈关节畸形及功能障碍；常伴尿酸性尿路结石.5。
糖尿病：是一组由胰岛素分泌不足和（或)作用缺陷所引起的以慢性血糖水平增高为特征的代谢性疾病。
6。
胰岛素抵抗：是指胰岛素作用的靶器官（主要是肝脏、肌肉和脂肪组织）对正常浓度的胰岛素不能产生正常的生物学反应，即组织对胰岛素敏感性降低。
7.代谢综合征.：是与代谢异常相关的心血管病多种危险因素在个体内聚集的状态。
MS的基础是IR，其主要组成成分是肥胖症尤其是中心性肥胖、2型DM或糖调节受损、血脂异常和高血压。
8.空腹血糖：是指8 ~10h内无任何热量摄入时检测的静脉血浆葡萄糖水平.9。
糖化血红蛋白:是葡萄糖或其他糖与血红蛋白的氨基发生非酶催化反应的产物（一种不可逆的糖化蛋白）。
10。
低血糖症：是指血糖浓度低于参考值水平下限，临床出现以交感神经兴奋和脑细胞缺糖为主要特点的综合征。
一般以血浆葡萄糖浓度低于2。
8mmol/L时作为低血糖症的标准。
11.载脂蛋白:脂蛋白中的蛋白质具有运脂质的作用故被称为载脂蛋白。
氧化应激的定量评价方法大致分做三类
氧化应激的定量评价方法大致分做三类：1）测定由活性氧修饰的化合物；2）测定活性氧消除系统酶和抗氧化物质的量；3）测定含有转录因子的氧化应激指示物。
而根据氧化应激的物质种类，又可主要分为蛋白质氧化损伤标志物检测、脂质过氧化标志物检测、核酸DNA/RNA损伤检测以及活性氧消除系统酶和抗氧化物质检测等。
检测的方法也是多种多样，化学法、免疫染色、ELISA等等就本人经验，核酸DNA/RNA损伤，如8-OHDG ELISA 等方法是比较可靠的，但是通常损伤较重才可能检测出，而传统MDA等脂质过氧化标志物、各种氧化酶化学检测是比较简便的，但却稳定性很差。
大家能否谈谈自己曾采用的相关方法，并从敏感性、简便性等方面谈谈自己的方法ROS氧化损伤碱基后，碱基不稳定，自己掉下去，可以形成AP site(apurinic/apyrimidinic site or abasic site)，或者损伤的碱基被碱基切除（base excision repair）机制切掉形成中间产物。
AP site一般不直接引起细胞凋亡，但是当量太大而又处在S期DNA复制时，细胞在修复AP site 时形成nick直接激活PARP，或者两条互补链上临近的APsite会导致双链断裂，这样激活ATM等，就会进一步传递信号触发细胞凋亡机制了。
一般活性氧才会损伤DNA，过氧化氢不会氧化应激（Oxidative Stress，OS）是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。
氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素细胞氧化损伤后需证实细胞功能障碍可检测哪些指标啊?1.细胞存活率的测定在细胞氧化损伤过程中,每隔半小时吸取100μL细胞液置于96孔微量滴定板,存活细胞用MTT(噻唑兰,serva)染色法确定.MTT溶于pH7.2PBS(终浓度5g/L),过滤灭菌.每孔加入20μLMTT溶液,37℃孵育4h,每孔再加入100μL酸性异丙醇(100μL异丙醇中含0.04NHCl),混匀,静置5min后,将96孔滴定板置于酶联免疫检测仪上,于波长570nm处测定每孔光吸收值OD,用不加MTT的细胞孔作本底对照,细胞存活率=([OD]t/[OD]u)×100%,此处[OD]t为经3种处理方式处理过的细胞光吸收值,[OD]u为未经任何处理的细胞的光吸收值.2. 凋亡细胞DNA电泳分析以800g的速度离心收集处理过的细胞,弃上清后悬浮于40μL96%0.2M磷酸氢二钠于4%0.1M柠檬酸的PC缓冲液中(pH7.8)30min;1kg离心5min后将上清转移至0.5mL Eppendorf管,真空浓缩20min;加入3μL0.25%NP-40溶液和3μL RNaseA(1g/L)溶液,在37℃下孵育30min后,再加入3μL 1g/L蛋白酶K,37℃下继续孵育30min,最后加入12μL电泳指示剂溶液(含0.25%溴酚兰,40%蔗糖).将样品小心加入含溴乙啶的0.8%琼脂糖凝胶点样孔中,在25V电压下电泳10h,于紫外透射仪上观察电泳结果并拍照保存氧化损伤是引起许多组织细胞凋亡的一个重要机制。
氧化应激
氧化应激导致的疾病
• •
1.糖尿病 1.糖尿病 看法一：胰岛素抵抗源于氧化应激 高游离脂肪酸(FFA)刺激的后 高游离脂肪酸(FFA)刺激的后 果是高活性反应分子[1]性氧簇(ROS)和活性氮簇(RNS)生成增多, 果是高活性反应分子[1]性氧簇(ROS)和活性氮簇(RNS)生成增多,从而 启动了氧化应激机制( 启动了氧化应激机制(高活性反应分子产生和抗氧化作用之间长期失 衡而引起组织损伤)。这些活性分子可直接氧化和损伤DNA、蛋白质、 衡而引起组织损伤)。这些活性分子可直接氧化和损伤DNA、蛋白质、 脂类,还可作为功能性分子信号,激活细胞内多种应激敏感信号通路, 脂类,还可作为功能性分子信号,激活细胞内多种应激敏感信号通路,这 些信号通路与胰岛素抵抗和β 些信号通路与胰岛素抵抗和β细胞功能受损密切相关。 • 胰岛素抵抗可以先于糖尿病发生,在其作用下, 胰岛素抵抗可以先于糖尿病发生,在其作用下,疾病早期胰岛素代 偿性分泌增加以保持正常糖耐量。当胰岛素抵抗增强、胰岛素代偿性 分泌减少或二者共同出现时,疾病逐渐向糖耐量减退和糖尿病进展, 分泌减少或二者共同出现时,疾病逐渐向糖耐量减退和糖尿病进展,血 糖开始升高。高血糖和高FFA共同导致ROS大量生成和氧化应激, 糖开始升高。高血糖和高FFA共同导致ROS大量生成和氧化应激,也激 活应激敏感信号途径,从而又加重胰岛素抵抗, 活应激敏感信号途径,从而又加重胰岛素抵抗,临床上表现为糖尿病持 续进展与恶化。体外研究显示,ROS和氧化应激可引起多种丝氨酸激酶 续进展与恶化。体外研究显示,ROS和氧化应激可引起多种丝氨酸激酶 激活的级联反应。最近的抗氧化剂改善血糖控制试验也证实,ROS和氧 激活的级联反应。最近的抗氧化剂改善血糖控制试验也证实,ROS和氧 化应激会引起胰岛素抵抗
氧化应激反应
氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时,体内高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species,RNS)产生过多,氧化程度超出氧化物的清除,氧化系统和抗氧化系统失衡,从而导致组织损伤。
ROS包括超氧阴离子(.O₂-)、羟自由基(.OH)和过氧化氢(H₂O₂)等;RNS包括一氧化氮(.NO)、二氧化氮(.NO₂)和过氧化亚硝酸盐(.ONOO-)等。
机体存在两类抗氧化系统,一类是酶抗氧化系统,包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等;另一类是非酶抗氧化系统,包括维生素C、维生素E、谷胱甘肽、褪黑素、α-硫辛酸、类胡萝卜素、微量元素铜、锌、硒(Se)等。
物的清除,氧化系统和抗氧化系统失衡,从而导致组织损伤。
氧自由基反应和脂质过氧化反应在机体的新陈代谢过程中起着重要的作用，正常情况下两者处于协调与动态平衡状态，维持着体内许多生理生化反应和免疫反应。
一旦这种协调与动态平衡产生紊乱与失调，就会引起一系列的新陈代谢失常和免疫功能降低，形成氧自由基连锁反应，损害生物膜及其功能，以致形成细胞透明性病变、纤维化，大面积细胞损伤造成进神经、组织、器官等损伤。
这种反应就叫脂质过氧化。
脂质过氧化过程中发生的ROS氧化生物膜的过程，即ROS与生物膜的磷脂、酶和膜受体相关的多不饱和脂肪酸的侧链及核酸等大分子物质起脂质过氧化反应形成脂质过氧化产物(Lipid PerOxide, LPO)如丙二醛(Malonaldehyde, MDA)和4-羟基壬烯酸(4-hydroxynonenal,HNE)，从而使细胞膜的流动性和通透性发生改变,最终导致细胞结构和功能的改变。
1。
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4、与抗氧化作用相关的其他酶
醛酮还原酶 它可催化脂肪醛和脂肪醛-谷胱甘肽加成物的还原，以
清除脂质过氧化作用的毒性产物
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第二十四章 氧化应激的生物化学检验
非酶类抗氧化系统
脂溶性抗氧化剂 维生素E、类胡萝卜素（CAR）、还原型辅酶Q、皮质醇等。
水溶性小分子抗氧化剂 维生素C（又称抗坏血酸）、谷胱甘肽(GSH)、尿酸等。
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第二十四章 氧化应激的生物化学检验
2、氧化应激对蛋白质和酶的损害
蛋白质变性和破坏：
老年人皮肤起皱、骨骼变脆等都与胶原蛋白破坏和功能改变 有关；动脉粥样硬化、缺血-再灌注损伤、神经退行性疾病、器官 移植排斥等病变与蛋白质变性和破坏有关
对酶活性的影响：
使酶分子发生聚合、交联，或通过破坏酶分子中氨基酸以及 与酶分子中的金属离子反应，影响酶活性。
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第二十四章 氧化应激的生物化学检验
一、主要活性氧的测定与评价
O2-的检测
方法概述
直接法 间接法
优点：准确度较高
电子自旋共振波普（ESR） 缺点：操作繁琐，仪器
昂贵，不便推广
化学发光法
优点：操作简便，灵敏度较高，稳定性较好 缺点：特异性不太高，需化学发光仪
分光光度法：稳定性好，操作简便，测定快速
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第二十四章 氧化应激的生物化学检验
·OH检测
方法概述
自旋捕捉法 高效液相色谱法（HPLC） 化学发光法 荧光分析法 分光光度法
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第二十四章 氧化应激的生物化学检验
活性氧和氧自由基
活性氧(ROS )：羟自由基(·OH)、超氧阴离子(O2 - )、 ·
过氧化氢（ H2O2 ）、烷氧基（RO·）等 氧自由基：羟自由基(·OH)、超氧阴离子(O2 - )、烷 氧基（RO·）等 活性氮(RNS ): 一氧化氮（NO）和过氧亚硝酸根 （ONOO－）等
❖ 了解：氧化应激与疾病和衰老的关系；氧化 应激的原因
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第二十四章 氧化应激的生物化学检验
目录
1 氧化应激的生物化学基础 22 氧化应激生化指标的测定与评价 3 氧化应激生物化学指标的临床应用 4 小结
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第二十四章 氧化应激的生物化学检验
第一节 氧化应激的生物化学基础
一、活性氧和氧自由基及其产生原因
蛋白性抗氧化剂 铜蓝蛋白、金属硫蛋白（MT）等蛋白性抗氧化剂。
新发现的一些抗氧化剂
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第二十四章 氧化应激的生物化学检验
第二节 氧化应激生物化学指标的测定与评价 评价氧化与抗氧化系统：
1、测定活性氧及其化合物的含量； 2、测定抗氧化酶和抗氧化剂的量； 3、测定氧化应激损伤的标志物。
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第二十四章 氧化应激的生物化学检验
活性氧与氧自由基： ROS包括所有的氧自由基 ROS并非都是自由基，比如H2O2 自由基中也有不属于ROS的成分，比如活性氮
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第二十四章 氧化应激的生物化学检验
活性氧和氧自由基产生原因
外源性因素：
电离辐射及环境Hale Waihona Puke 染、药物和食物内源性因素：
线粒体内是生成活性氧的主要场所
全国高等医药院校医学检验技术专业规划教材 临床生物化学检验（第三版）
第二十四章
氧化应激的生物化学检验
第二十四章 氧化应激的生物化学检验
教学目标与要求
❖ 掌握：掌握氧化应激的概念与自由基种类； 掌握主要氧化应激损伤和抗氧化指标检测方 法、原理和方法学评价
❖ 熟悉：氧化应激损伤机制，抗氧化损伤的防 御系统组成与作用
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2、过氧化氢酶(CAT)
过氧化氢酶清除O2-的歧化产物H2O2，而后 者往往是·OH的前体。
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3、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）
(1) 含硒谷胱甘肽过氧化物酶(SeGPx、eGPx、PHGPx)：
可清除LOOH或H2O2，抑制自由基的生成反应
(2) 不含硒谷胱甘肽过氧化物酶(谷胱甘肽硫转移酶 GST):
❖ 氧化应激（oxidative stress, OS）是指机体受到各种内外源 因 素 的 干 扰 ， 使 体 内 的 活 性 氧 (reactive oxygen species, ROS)自由基和活性氮( reactive nitrogen species, RNS)自由 基等相关物质产生过多，氧化程度超出抗氧化物的清除能 力，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致分子、细胞和 机体损伤的状态。
抗氧化酶类
超氧化物歧化酶（SOD） 过氧化氢酶(CAT) 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px） 与抗氧化作用相关的其他酶，如醛酮还原酶
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1、超氧化物歧化酶（SOD）
体内唯一以O2-为底物的酶，需氧代谢的细胞内都含有SOD。其 作用是催化歧化反应以清除O2- 。
SOD是金属酶，包括三种同工酶 CuZn-SOD在真核细胞胞液中，以Cu2+-Zn2+为辅基 Mn-SOD在原核细胞及真核细胞的线粒体中以Mn2+为辅基 Fe-SOD在原核细胞中以Fe3+为辅基
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第二十四章 氧化应激的生物化学检验
3、氧化应激对核酸和染色体的损害
氧自由基对核酸的毒性作用包括染色体畸变、碱基突变、 DNA断裂等。
4、氧化应激对糖分子的损害
氧化应激可使细胞膜中的糖分子羟基化，破坏细胞膜 上的多糖结构，影响细胞功能的发挥。
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第二十四章 氧化应激的生物化学检验
三、体内抗氧化防御系统
荧光分析法
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第二十四章 氧化应激的生物化学检验
❖ 反应原理 羟胺氧化法
通过O2-氧化羟胺生成亚硝酸，在酸性条件下，亚硝酸 与对氨基苯磺酸和和N-甲奈基二氨基乙烯反应生成红色 化合物，后者在550nm处有吸收峰，以此检测O2- 。
❖ 方法学评价
ESR是首选方法 羟胺氧化法适合作为常规检测方法 化学发光法一般只作为辅助手段，特异性差 荧光探针法的灵敏度和特异性较好
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第二十四章 氧化应激的生物化学检验
二、活性氧和氧自由基的生物学作用 对机体的生理作用
1、防御作用，杀灭外来病原微生物 2、参与合成某些重要的生物活性物质 3、参与许多酶促反应 4、参与解毒作用
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第二十四章 氧化应激的生物化学检验
损害效应
1、脂质氧化对生物膜的损伤
氧自由基最容易攻击生物膜中多不饱和脂肪酸的 不饱和共价键，引发生物膜的脂质过氧化作用，形成 脂质过氧化产物，破坏膜的结构和功能。