蛋白质组学及其研究方法(1)..共47页文档
蛋白质组学及其研究方法与进展
蛋白质组学及其研究方法与进展蛋白质是生命活动的体现者，基因的表达最后是通过蛋白质来体现的，在这个过程中，蛋白质起了连接基因与表现的功能。
蛋白质是有氨基酸组成的，组成蛋白质的氨基酸的种类及排列顺序构成了蛋白质的一级结构，而在一级机构基础上的多肽链本身的折叠和盘绕方式构成了蛋白质的二级结构，考虑到多肽链上原子在空间的分布，由二级结构进一步形成了蛋白质的三级结构，对于有多个亚基的蛋白质还存在四级结构。
蛋白质的一级结构决定了高级结构，而高级结构则决定着蛋白质的生物学功能。
如今对于蛋白质研究已经单独形成了一个活跃的生物学分支学科―――蛋白质组学，在蛋白质的研究中发挥着很重要的作用，下面将介绍蛋白质组学的一些基本内容及研究进展。
一.产生背景[1]在20世纪中后期随着DNA双螺旋结构的提出和蛋白质空间结构的解析，生命科学研究进入了分子生物学时代，对遗传信息载体DNA和生命功能的体现者蛋白质的研究，成为了其主要内容。
90年代初期启动的庞大的人类基因组计划．在经过各国科学家多年的努力下，已经取得了巨大的成就。
10多种低等模式生物的基因组序列测定L三完成；第一个多细胞生物一线虫基因组的DNA全序列测定也在1998年年底完成；人类所有基因的部分序列测定(EST)已经完成；人类基因组的全序列测定有可能提前到2003年完成。
生命科学已跨入了后基因组时代。
在后基因组时代，研究重心将从揭示生命的所有遗传信息转移到在整体水平上对功能的研究。
这种转向的第一个标志是产生了功能基因组学这一新学科，即从基因组整体水平上对基因的活动规律进行阐述。
如在mRNA 水平上，通过DNA 芯片(DNA chips)和微阵列(Microarray)法等技术检测大量基因的表达模式，并取得了很好的进展。
但是，mRNA的表达水平(包括mRNA的种类和含量)由于mRNA储存和翻译调控以及翻译后加工等的存在．并不能直接反映蛋白质的表达水平}蛋白质自身特有的活动规律，如蛋白质的修饰加工、转运定位结构形成、代谢、蛋白质与蛋白质及其他生物大分子的相互作用等．均无法从在基因组水平上的研究获知。
蛋白质组学的研究方法和进展
蛋白质组学的研究方法和进展蛋白质是细胞中最重要的一类生物大分子，不仅构成生物体的大部分物质，而且参与多种生物过程。
在生物学的研究中，蛋白质组学就是广泛用于研究蛋白质及其解析结构、功能和相互作用的一种技术。
蛋白质组学技术的不断发展，为科学家们提供了更广阔的研究领域和更深入的认识和理解。
一、蛋白质分离技术蛋白质在细胞中有着多种不同的类型和数量，分离这些蛋白质对于进一步的研究至关重要。
凝胶电泳是一种最早应用于蛋白质分离的技术，在这一技术中，蛋白质被分离到一条凝胶条中，并且能够根据其分子量进行鉴定。
近年来，液相色谱技术得到快速发展，以逆相高效液相色谱（RP-HPLC）为主的技术广泛应用于蛋白质的分离、富集和纯化中。
二、蛋白质鉴定技术现代蛋白质组学技术的特点是高通量、高分辨率、高灵敏度和准确率。
鉴定样品中的所有蛋白质非常复杂，多组学技术的整合在蛋白质组学的研究中显得尤为重要。
代表性的鉴定技术是质谱法，可将蛋白质析出后离线或在线进行鉴定。
其中，MALDI-TOF 质谱技术是蛋白质鉴定中的重要方法之一，该技术使用激光脱附离子化（MALDI）策略以减少化学修饰和分离过程对蛋白质结构的影响。
三、蛋白质表达技术从DNA转录到蛋白质翻译的过程，是生物体逐步实现功能的一个重要环节。
蛋白质表达技术是在外部体系中重现这一过程的有效方法，在研究中应用极为广泛。
常见的蛋白质表达系统有大肠杆菌、酵母、哺乳动物等，其中，大肠杆菌是最常用的单细胞表达体系。
近年来，蛋白质表达与修饰的转化药学已经成为一个热门领域，各种新型表达体系也层出不穷。
四、蛋白质数据分析鉴定蛋白质，只是蛋白质组学研究的第一步，有关数据分析和解释的关键环节，对于进一步的研究显得尤为重要。
目前，由于蛋白质比较庞大并且互相之间联系复杂，因此数据分析技术的不断发展就格外重要了。
从最初的数据搜索和标识，到后来的蛋白质序列分析、结构预测、功能预测和网络分析等，蛋白质数据分析技术已经成为蛋白质组学研究的重要环节。
蛋白质组学研究方法
2. 蛋白质的分离
2D-DIGE中内标的重要性
以样品中的蛋白点与其内 标的比值作为其定量数据
使不同凝胶之间的点的分 析和定量更加精确
使不同凝胶之间的匹配更 加可信
使实验间的误差与样品之
分间析的说明差：异区分开来
1)在没有内标的情况下，我们通过AB两
块胶的分析，会得出结论： 图中红色圆
环所标记的蛋白质点在处理组(样品3和
样品4)表达量增高；
2)通过内标的校正，我们可以证明，这
实际上是由凝胶之间的误差造成的，并
不是样品之间的真实差异。
2x4x
2. 蛋白质的分离
多维液相色谱
亲和色谱（AC） 离子交换色谱（IEC） 反相高效液相色谱（
RP-HPLC）
顺序使用基于不同物理化学
。
凝胶
丙烯酰胺缓冲
液: CH2=CH-
CO-NH-R,
1x4x
R ：羧基或叔
2. 蛋白质的分离
不同pH和长度的IPG胶（以BIO-
RAD的ReadyStrip™ IPG 胶条为例）
相对聚焦功率表示在使用不同长度或 pH 范围的 IPG 胶条时，在第一维中预 期获得的增强的分辨率。 为 7 cm pH 3–10 IPG 胶条任意分配基线聚焦功率 1.0 以便计算其他胶条的相对聚焦功率
x6 x
1.
蛋白质组学简介
蛋白质调控及功能实现的复
杂性 DNA
Riboso me
tRN A mRN A Polypeptide
Protei n
x7 x
1. 蛋白质组学简介
蛋白质组学研究特点
x8 x
1. 蛋白质组学简介
蛋白质组学研究内容
蛋白质组学研究技术-PPT精品文档
二维凝胶电泳（2-DE）—目前唯一能将 数千种蛋白质同时分离与展示的分离技 术 工作原理是根据蛋白质的两个一级属性： 等电点和分子量的特异性，将蛋白质混 合物通过等电聚焦电泳（IEF）和聚丙烯 酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），在两个水 平上进行分离。 1975年首先由O’Farrell等创立
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第一节 概述
蛋白质组学研究范围及意义
表达蛋白质组学研究 选择具有重要生物学意义且已完成DNA测
序的生物体，鉴定出生物体/某种组织（细胞） 所表达的全部蛋白质，建立其蛋白质表达谱数 据库。 进展较快的领域：一些重要的疾病及微生物组。 有难度的领域：估计人类的蛋白质组由50万个 蛋白质组成，真核生物细胞表达的蛋白质也超 出1万个
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第一节 概述
2019成立了中国人类蛋白质组组织 （CHHUPO），并分别于2019年9月、 2019年8月以及2019年8月召开了中 国蛋白质组学首届、第二届及第三届 学术大会，2019年10月在中国北京召 开了第三届国际蛋白质组学会议。
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第一节 概述
科技部已将疾病蛋白质组研究列入我 国“973”计划项目和“863”计划项 目；国家自然科学基金委员会也将 “蛋白质组研究”列为重点项目。
第一节 概述
基因与其编码产物蛋白的非线性关系
mRNA水平的基因表达研究取得进展，但 mRNA与蛋白质间的相关系数仅为0.4～0.5， mRNA的种类与含量不能代表蛋白质的种类与 含量。支原体的蛋白质数目较基因多24%，对 于人，蛋白质的数目至少多3倍。 蛋白质自身特点难以从DNA和mRNA水平得到 解答：复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定 位或迁移、蛋白质－蛋白质相互作用等
细胞膜和亚细胞器蛋白质组学研究方法及其应用
细胞膜和亚细胞器蛋白质组学研究方法及其应用随着细胞和分子生物学的发展，越来越多的科研人员开始注重蛋白质组学的研究。
细胞膜和亚细胞器蛋白质组学研究是其中的重要分支，它们不仅对于基础研究有着重要的价值，也可以为疾病的研究提供新的思路和方法。
一、细胞膜蛋白质组学研究方法细胞膜是细胞的外壳，包裹着细胞内部的各种细胞器和器官。
细胞膜的功能非常重要，它负责控制物质的进出以及信号的传递，将外界的刺激转化为细胞内信号，并作出相应的反应。
因此，对细胞膜进行蛋白质组学研究有着重要的意义。
1.细胞膜富集技术细胞膜是一个很薄的结构，其蛋白质含量很低，一些蛋白质表达量很少，很难从细胞总量中富集出来。
为了克服这一难题，科研人员提出了一些细胞膜富集技术，例如：细胞膜抽提法、亲和纯化技术、二维薄层电泳法等。
这些富集技术可以有效地提高细胞膜的纯度和蛋白质含量，为后续的研究提供更好的样本。
2.蛋白质组分析技术细胞膜的蛋白质组分析技术主要有两种，一种是液相色谱-质谱法（LC-MS/MS），另一种是差凝电泳法（DIGE）。
液相色谱法是目前常用的蛋白质组学分析方法，它可以高效地分离出蛋白质，并进行定性和定量的分析。
差凝电泳法则是利用蛋白质电荷和分子量的差异，在凝胶中进行分离和比较，其分离精度较高。
目前，液相色谱法和差凝电泳法的结合，已成为细胞膜蛋白质组学研究的主流方法。
二、亚细胞器蛋白质组学研究方法细胞是一个复杂的系统，不仅包含细胞膜，还包含各种不同的亚细胞器。
例如：线粒体、内质网、高尔基体、溶酶体等。
这些亚细胞器各自承担着不同的生理功能，需要精细的调控和协同作用，否则就会影响到整个细胞的正常功能。
因此，亚细胞器的蛋白质组学研究也具有非常重要的价值。
1.亚细胞器富集方法亚细胞器富集技术与细胞膜富集技术类似，其核心思想是从细胞总量中筛选出目标亚细胞器的蛋白质，进行定性和定量的分析。
不同的亚细胞器富集技术主要依赖于亚细胞器的特性，例如：线粒体可以利用亲和剂富集，内质网则可以通过离心分离或膜上酶解法获得等等。
蛋白质组学的研究方法和进展
蛋白质组学的研究方法和进展蛋白质组学的研究方法主要包括样品制备、质谱分析以及数据分析三个阶段。
在样品制备阶段，研究人员需要选择合适的方法来提取和纯化蛋白质。
常用的方法包括差凝蛋白法、电泳法、柱层析法等。
质谱分析是蛋白质组学的核心技术，主要有两种方法：质谱图谱分析和质谱定量分析。
质谱图谱分析可以通过比对已知蛋白质的质谱图数据库来鉴定未知蛋白质；质谱定量分析可以测定样品中各个蛋白质的数量变化。
数据分析是蛋白质组学研究的关键环节，用于解读大量的质谱数据。
近年来，蛋白质组学的研究取得了诸多重要进展。
首先，高通量质谱技术的发展使得大规模蛋白质组学研究成为可能。
比如，液相色谱和质谱联用技术（LC-MS/MS）可以同时检测数千种蛋白质，大大提高了鉴定和定量蛋白质的效率和准确性。
其次，全蛋白质组学的研究范围不断拓展。
除了研究细胞蛋白质组，研究人员还开始探索组织蛋白质组和生物体蛋白质组等更高层次的组学研究。
通过研究这些复杂组织中蛋白质的种类和功能，可以深入了解细胞和生物体的复杂生理和病理过程。
此外，蛋白质组学也开始向单细胞水平的研究发展，可能为研究细胞发育、疾病药物靶点等方面提供新的突破口。
蛋白质组学在医学和生命科学领域有着广泛的应用前景。
通过深入了解蛋白质组的变化和相互作用，可以揭示细胞和生物体的生理和病理过程，为疾病的早期检测和诊断提供重要依据。
蛋白质组学也可以用于发现新的疾病标志物、筛选新药靶点以及评估药物的疗效和安全性。
此外，蛋白质组学还可以用于研究生命起源、进化以及各种生物学过程的分子机制。
总之，蛋白质组学的发展必将为生命科学研究带来更多的突破和进展。
蛋白质组学及研究方法
蛋白质组学及研究方法质谱法是蛋白质组学中最重要的分析方法之一、常用的质谱法有两大类，一类是基于质谱仪直接测定蛋白质的质量和序列信息，如质谱仪联用液相色谱法（LC-MS）和二维凝胶电泳结合质谱法（2-DE-MS）；另一类是基于质谱法间接测定蛋白质的表达水平和修饰信息，如蛋白质组学差异凝胶鉴定法（DIGE）和蛋白质组学激光解吸电离质谱法（MALDI-TOF）。
质谱法的基本原理是通过将蛋白质分子化为离子，在质谱仪中进行分离和检测。
质谱仪的常见类型有基于时间的质谱仪（TOF）、静电荧光质谱仪（ESI）、磁性质谱仪（FT-ICR）等。
质谱法可以通过测定蛋白质的质量和碎片信息来确定蛋白质的序列和修饰状态。
免疫检测是蛋白质组学中常用的方法之一，用于检测特定蛋白质在生物体中的表达水平和定位信息。
免疫检测可分为传统免疫学方法和现代免疫学方法两大类。
传统免疫学方法包括酶联免疫吸附测定法（ELISA）、免疫印迹和免疫组织化学等。
现代免疫学方法包括流式细胞术、免疫磁珠法和免疫表观遗传学等。
生物信息学分析是蛋白质组学中的重要环节。
通过生物信息学分析，可以从大量的蛋白质组学数据中提取有用的信息，如蛋白质相互作用网络、信号通路分析和功能注释等。
常用的生物信息学工具和数据库有NCBI、UniProt、STRING和Kegg等。
蛋白质组学的研究方法还包括蛋白质组分离和富集技术、蛋白质组学数据库和蛋白质组学分析软件等。
蛋白质组分离和富集技术可用于从复杂的蛋白质混合物中提取特定蛋白质或蛋白质家族，并进行进一步的分析。
蛋白质组学数据库和蛋白质组学分析软件可用于存储和分析大规模的蛋白质组学数据，并帮助研究者解释实验结果。
总之，蛋白质组学是一门综合性研究领域，涉及蛋白质的分析、鉴定、定位和功能等方面。
通过质谱法、免疫检测和生物信息学分析等方法，可以更好地理解蛋白质在生物体内的功能和调控机制，为生物医学研究和药物开发提供重要的技术支持。
蛋白质组学的研究方法
第23卷 第6期内蒙古民族大学学报(自然科学版)Vol.23 No.6 2008年11月Journal of I nnerMongolia University for Nati onalities Nov.2008蛋白质组学的研究方法3张树军,狄建军,张国文,魏永春(内蒙古民族大学生命科学学院,内蒙古通辽 028000)〔摘 要〕蛋白质组学是后基因组时代出现的一个新兴研究领域,具有巨大的商业应用前景,将会推动整个生命科学的发展.本文对蛋白质组学的定义和主要使用的研究方法作一简要介绍.〔关键词〕蛋白质组学;研究方法;后基因组时代〔中图分类号〕Q51 〔文献标识码〕A 〔文章编号〕1671-0185(2008)06-0647-03The Research M ethods of Proteo m i csZ HANG Shu-jun,D I J ian-jun,ZHANG Guo-wen,W E I Yong-chun(College of B i oche m istry,I nnerMongolia University for Nati onalities,Tongliao028000,China)Abstract:Pr oteom ics is a ne w research area of the post-genome era,W hich has a great p r os pect ofcommercial app licati on,and will advance the devel opment of bi ol ogy.This article makes a conciseintr oduce about the definiti on and research methods of p r oteom ics.Key words:Pr oteom ics;Research method;Post-geno me era21世纪将是生命科学的世纪.随着人类基因组测序计划的完成,生命科学的重心开始转移到对基因的表达产物-蛋白质的研究上,蛋白质组学遂成为后基因时代的研究前沿和热点领域.后基因组时代中,生命科学的中心任务是阐明基因组所表达的真正执行生命活动的全部蛋白质的表达规律和生物功能,即生命科学的研究重心将从基因组学转移到蛋白质组学.蛋白质组研究便是其中一个很重要的内容.因为蛋白质是基因功能活动的最终执行者,是生命现象复杂性和多变性的直接体现者,因此人类要揭示整个生命活动的规律,就必须研究蛋白质,只有从蛋白质组学的角度对所有蛋白质的总和进行研究,才能更贴近对生命现象和本质的掌握,生命活动的本质和活动规律才能找到答案.1 蛋白质组学的定义蛋白质组(Pr oteome)是1994年由W ilkins首先提出,它是指一种基因组或一种生物、一个细胞组织所表达的全套蛋白质〔1〕.它与基因组相对应,也是一个整体的概念.蛋白质组学(Pr oteom ics)以蛋白质组为研究对象,分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与联系,在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的活动规律.蛋白质组学旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式.蛋白质组学的研究内容主要有两方面:结构蛋白质组学和功能蛋白质组学.结构蛋白质组学主要是蛋白质表达模式的研究,包括蛋白质氨基酸序列分析及空间结构的解析.功能蛋白质组学主要是蛋白质功能模式的研究,包括蛋白质的功能和蛋白质间的相互作用.蛋白质的功能模式的研究是蛋白质组学研究的最终目标,目前主要集中在蛋白质组相互作用网络关系的研究.3收稿日期:2008-05-17作者简介:张树军(1980-),男,内蒙古科右中旗人,助教,硕士,从事生物化学方面的研究.内 蒙 古 民 族 大 学 学 报2008年8462 蛋白质组学研究方法2.1 双向凝胶电泳双向电泳(T wo di m ensi onal gelelectr ophoresis,2-DE)技术的基本原理一是基于蛋白质的等电点不同在pH梯度胶内等电聚焦,二是根据分子量的不同大小进行S DS-P AGE分离,把复杂蛋白质混合物中的蛋白质在二维平面上分开〔2〕.双向凝胶电泳的第一向是等电聚焦I EF,根据蛋白质等电点(P I)的不同进行第一次分离;第二向是S DS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,根据蛋白质分子量不同进行分离.双向电泳技术具有其他技术不可比拟的蛋白质高分辨率,是蛋白质组学研究中最常用的核心技术之一.以双向即二维凝胶电泳技术和质谱技术为基础的蛋白质组学研究程序为:样品制备→等电聚焦→聚丙烯酰胺凝胶电泳→凝胶染色→挖取感兴趣的蛋白质点→胶内酶切→质谱分析确定肽指纹图谱或部分氨基酸序列→利用数据库确定蛋白.差异凝胶电泳(differential in-gelelectr ophoresis,D I GE)是为改进双向电泳的重复性和灵敏度,最近发展的一种荧光染料标记的双向电泳技术即差异凝胶电泳,其方法是将两种样品中的蛋白质采用不同的荧光标记后混合,在同一凝胶内进行电泳.因此,可以对来自正常组织和癌变组织的样品蛋白质表达差异进行分析.与常规的双向电泳技术比较,D I GE更加简单,劳动强度降低,效率更高〔3〕.2.2 生物质谱技术质谱技术的基本原理是在样品离子化后,根据不同离子质荷比(m/z)的不同进行分离并确定相对分子量,具有灵敏度高、准确度高且易于实现自动化等优点〔4〕.已取代了传统的蛋白质鉴定方法(如Ed man降解法、氨基酸分析法等),成为蛋白质鉴定分析的主要支撑技术.生物质谱还可应用于定量蛋白质组分析、蛋白质翻译后修饰(如糖基化、磷酰化)以及蛋白质相互作用等研究领域.但质谱法还存在固有的局限性,如Leu和Ile、Lys和Gln不能区别;有些多肽的固有序列不能用质谱法测定;无法区分分子量和带电电荷相同的同分异构体;仪器较为昂贵.2.3 生物传感芯片质谱生物传感芯片质谱是定性和定量检测蛋白质间相互作用并对其进行鉴定的简便而快捷的方法〔5〕.它是以表面等离子激原共振SPR为基础的生物分子相互作用分析技术与质谱技术有机结合而形成的新型技术,核心是生物传感芯片,以玻璃作为支持物,上面结合有羧甲基葡聚糖聚合物,通过化学修饰可将特定蛋白质肽固定在葡聚糖聚合物上形成传感片,当待测蛋白质或肽溶液通过微射流卡盘流过该固相载体时,与固相蛋白质肽发生相互作用的蛋白质(肽)被滞留在聚合物的表面上,而芯片表面蛋白质含量增加导致入射光的折射率改变,使其表面等离子激原共振光的共振角发生改变,该变化与表面蛋白的含量呈线性关系.生物分子相互作用分析技术是进行蛋白质相互作用分析的较好技术.该法可用于筛选功能性蛋白质,并可在蛋白质水平筛选基因的多态性,从而能有效地将基因与蛋白质结合在一起.2.4 I C AT技术同位素标记亲和标签(Is ot ope Coded Affinit Tags,I CAT)技术目前已成为蛋白质组研究的核心技术之一.它是在质谱技术的基础上发展起来的一种定量质谱法,能够精确地分析不同样品中蛋白质表达量的差异,从而使蛋白质组学真正成为一种差异显示技术〔6〕.此技术是用具有不同质量的小分子试剂I CAT去标记处于不同状态下的细胞中的蛋白质,再利用串联质谱技术,就能非常准确地比较出两份样品中蛋白质表达水平的不同.I CAT技术的优点在于它可以对混合样品进行直接测试而不需分离,能够迅速地定性和定量鉴定低丰度蛋白质,故可用于快速临床诊断.但I C AT技术也面临一些问题:无法检测不含半胱氨酸的蛋白质;半胱氨酸残基必须位于易处理的位置上;很难得到蛋白质磷酸化等翻译后修饰的信息存在特异性吸附、不可逆吸附和容量低的缺点.2.5 蛋白质芯片蛋白质芯片是用于研究蛋白质组功能模式的一种鉴定方法〔7〕.其原理是利用蛋白质与蛋白质、酶与底物、蛋白质与其他小分子之间的相互作用,检测分析蛋白质.蛋白质芯片是高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术.它是指在硅物质如玻璃等固相支持物表面高密度排列的探针蛋白点阵,通过如抗原-抗体专一性结合等各种相互作用,可特异地捕获样品中的靶蛋白,然后通过检测器对靶蛋白进行定性或定量分析.蛋白质芯片上的探针蛋白可根据研究的目的不同,选用抗体、抗原、受体、酶等具有生物活性、高度特异性和亲和性的蛋白质.2.6 酵母双杂交系统酵母双杂交系统是目前研究蛋白质组中蛋白质间相互作用的一个重要手段,其基本思路是只有靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后,其中的诱饵蛋白结合于报道基因的启动子才能启动报道基因在酵母细胞内的表达,通过检测报道基因表达产物判别作为“诱饵”和“靶蛋白”的两个蛋白间是否存在相互作用〔8〕.该技术的发展与创新,在蛋白质间相互作用的研究、新蛋白质筛选、蛋白质功能研究等诸多方面发挥着重要作用.2.7 噬菌体展示技术第6期张树军等:蛋白质组学的研究方法946将编码噬菌体外壳蛋白的基因上连接一个单克隆抗体的基因序列.当噬菌体生长时,表面就会表达出相应的单抗.将噬菌体过柱,检测单抗与柱上目的蛋白的特异性结合〔9〕.同酵母双杂交系统相比,噬菌体展示技术同样具有简便、高通量的优点,不同的是,反应在溶液中而不是在酵母细胞核中进行.另外,由于有些蛋白质本身有激活转录活性,不经过双杂交相互作用就能激活报道基因的表达,此时酵母双杂交系统不再适用,噬菌体展示则能很好地解决这个问题.但是噬菌体文库中的编码蛋白均为融合蛋白,可能改变天然蛋白质的结构和功能,其体外检测的相互作用可能与体内不符.2.8 串联亲和纯化(Tande m affinity purificati on,T AP)T AP技术的开发成为研究蛋白质相互作用的方法学上的巨大突破.该方法集成了经典的亲和纯化和免疫共沉淀这两种技术的优点,既可像前者得到高纯度、低拷贝数的蛋白质复合体,也继承了后者运用特异性的标记蛋白与亲和柱之间的相互作用,可快速地得到生理条件下与目标蛋白存在真实相互作用的蛋白质〔10〕.目前T AP技术与质谱技术的联用,以及质谱技术的自动化,使得大规模地分析相互作用的蛋白质在技术上成为可能.2.9 生物信息学方法生物信息学是在生命科学、计算机科学和数学的基础上逐步发展而形成的一门新兴交叉学科,是以理解各种数据的生物学意义为目的,运用数学与计算机科学手段进行生物信息的收集、加工、存储、传播、分析与解析的科学〔11〕.生物信息学在基因组学和蛋白质组学的研究中起到了特殊的重要作用,因为基因组和蛋白质组研究提供的数据的数量之巨大在生物学史上是史无前例的.而且,蛋白质组比基因组具有更大的复杂性,因而蛋白质组信息学更有挑战性.在后基因组时代,生物信息学的研究内容已经从对基因组和蛋白质组数据的高效分析,转移到比较基因组学、代谢网络分析、基因表达谱网络分析、蛋白质结构与功能分析以及药物靶点筛选等领域〔12〕.3 展望虽然蛋白质组学的研究方法很多,但每种方法都存在缺点.但随着科学技术的不断发展,蛋白质组学的研究技术会日益成熟.目前,已经出现了大量灵敏度更高、更有效的检测方法.色谱、质谱、芯片等技术现正得到普遍的应用.我们有理由相信,随着基因组研究的进一步拓展,蛋白质研究数据的不断积累,尤其是随着新技术方法的不断突破和生物信息学工具的日益完善,蛋白质组学必将取得突飞猛进的发展,相信随着全世界生命科学研究的持续快速发展,蛋白质组学及其研究技术必将成为21世纪的核心学科之一,并将切实而广泛地对人类生活带来巨大影响,为人类进步和发展做出更大的贡献.参 考 文 献〔1〕W ilkinsM R,Sanchez J C,Gooley A A,et al.Pr ogress with p r oteome p r ojects:why all p r oteins exp ressed by a genome should be identified and how t o do it〔J〕.B i otechnol ogy and genetic engineering revie ws,1996,13:19-50.〔2〕李义良,朱华清,张红锋.双向电泳技术〔J〕.生物学教学,2004,29(4):64-66.〔3〕黄丽俊,王建华.蛋白质组研究技术及其进展〔J〕.生物学通报,2005,40(8):4-7.〔4〕刘维薇,吕元.蛋白质组学研究技术及其临床应用〔J〕.中华检验医学杂志,2004,20:625-629.〔5〕Seong S Y.M icr oi m munoassay using a p r otein chi p:op ti m izing conditi ons f or p r otein i m mobilizati on〔J〕.Clin D iagn LabI m munol,2002,9(4):927-930.〔6〕Ong S E,M ann M.Mass s pectr ometry based p r oteom ics turns quantitative〔J〕.Nat Che mB i ol,2005,1(5):252-257.〔7〕BoguskiM S,Mcint osh M W.B i omedical inf or mati ons f or p r oteom ics〔J〕.Nature,2003,422(6928):233-237.〔8〕Ma J,Ptashne M.A ne w class of yeast transcri p ti onal activat ors〔J〕.Cell,1987,51(1):113.〔9〕Sidhu S S,Fairbr otherW J,Deshayes K.Exp l oring p r otein-p r otein interacti ons with phage dis p lay〔J〕.Che mbi oche m, 2003,4(1):14-16.〔10〕程永升,刘进元.串联亲和纯化(T AP)技术在蛋白质组学中的应用〔J〕.生物化学与生物物理进展,2004,31(4): 379-382.〔11〕陈铭.后基因组时代的生物信息学〔J〕.生物信息学,2004,2(2):29.〔12〕Englbrecht,C C,Facius A.B i oinf or matics challenges in p r oteom ics〔J〕.Comb Che m.H igh Thr oughout Screen,2005, 8(8):705.〔责任编辑 徐寿军〕。
蛋白质组学及研究方法
计的分析蛋白质相互作用的方法。
以真核细胞转录激活因子的结构和活性特
点为基础。
22
酵母双杂交技术的基本原理
转录激活因子GAL4---BD：N端与酵母GAL1基因启动子上游激活序列(UASG)结合的结构域 AD：C端转录激活结构域
2．噬菌体表面显示技术
蛋白质组学及其 研究技术
1
蛋白质组学(proteomics)
指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门
新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内
动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰
状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭
示蛋白质功能与细胞生命活动规律。
2
蛋白质组实验室流程
3
4
2-DE原理
5
The 1st D: Isoelectric Focusing(IEF)
( phage display )
24
3. 免疫共沉淀耦联质谱技术
原理：以细胞内源性靶蛋白为诱饵，用 抗靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行免疫共 沉淀（immuno-precipitation，IP）纯化 靶蛋白免疫复合物，凝胶电泳分离后， 质谱鉴定靶蛋白的结合蛋白。
25
标签融合 蛋白沉淀 实验流程 示意图
白进行定性和定量分析。
29
100 µ g E. coli IPGphor pH 4-7 24 cm
ETTAN Dalt II 12.5 % T Novel buffer
12
二维电泳的重复性？
13
胶 内 差 异 显 示 技 术
满天星斗”中找出特别的星座？
A B
E. Coli grown at 30ºC
化学蛋白质组学PPT课件演示文稿
• 在20世纪90年代中期，国际上萌发了一门研究细
胞内各种蛋白质的组成及其活动规律的新兴学科-蛋白质组学(proteomics)。
• 蛋白质组(proteome)这一概念是1995年由澳大利 亚学者最先提出来的，源于蛋白质（protein）与 基因组（genome）两个词的杂合，指的在一个 特定的时间和空间内，一个基因组､一种细胞组 织或一种生物体所表达的全部蛋白质。
• 对蛋白质组问题的研究称之为蛋白质组学
(proteomics)，主要是在整体水平上研究细胞 内蛋白质的组成及其活动规律。
第四页，共48页。
• 而化学在这里再一次与生物学的最新发展融合，形成新的交叉研究
领域-化学蛋白质组学(chemical proteomics)。化学蛋白质组学
是一个目前仍在不断扩展中的全新领域，学术界至今对其尚未有确
根据分子量大小进行分离。
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2，基质辅助激光解吸电离-飞行
时间质谱技术
• 基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱测量法以多 肽质量/电荷比为依据同数据库资料进行比较,进而
对蛋白质进行鉴定。此法通常被称为肽质量指纹法。
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3，色谱与质谱联用技术
• 将色谱技术与新型质谱技术相结合,可有效地克服双向凝胶电 泳/质谱的不足,确保了分析的准确性。
• 首先对蛋白质混合物进行酶切得到混合肽段,然后通过强离子交换
反相色谱柱进行多次分离,并连用液相色谱-串联质谱分析肽段, 而且通过核素标记肽段的技术实现蛋白定量分析。分离 后的产品离子得到完好地扫描,连用分析肽段,可以区分待
测蛋白质和其他类似物。
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蛋白质组学及其研究方法(1)..49页PPT
11、战争满足了，或曾经满足过人的 好斗的 本能， 但它同 时还满 足了人 对掠夺 ，破坏 以及残 酷的纪 律和专 制力的 欲望。 ——查·埃利奥 特 12、不应把纪律仅仅看成教育的手段 。纪律 是教育 过程的 结果， 首先是 学生集 体表现 在一切 生活领 域—— 生产、 日常生 活、学 校、文 化等领 域中努 力的结 果。— —马卡 连柯(名 言网)
36、自己的鞋子，自己知道紧在哪里。——西班牙
37、我们唯一不会改正的缺点是软弱。——拉罗什福科
xiexie! 38、我这个人走得很慢，但是我从不后退。——亚伯拉罕·林肯
39、勿问成功的秘诀为何，且尽全力做你应该做的。——孔子
13、遵守纪律的风气的培养，只有领 导者本 身在这 方面以 身作则 才能收 到成效 。—— 马卡连 柯 14、劳动者的组织性、纪律性、坚毅 精神以 及同全 世界劳 动者的 团结一 致，是 取得最 后胜利 的保证 。—— 列宁 摘自名言网
15、机会是不守纪律的。——雨果
谢谢！
蛋白质组学及其研究方法
蛋白质数据库
• （一）蛋白质序列数据库
• （二）蛋白质结构数据库
• （三）蛋白质直系同源簇数据库
• （四）DIP数据库 • 瑞士的SWISS-PROT拥有目前世界上最大、种类最多的
蛋白质组数据库 • 目前应用最普遍的数据库是NRDB 和dbEST数据库 • 蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础
主要质谱类型
• 基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）
• 电喷雾质谱（electrospray ionization mass spectrometry， ESI-MS）
0.5M Tris-HCl（pH 6.8）
50ul样品
Mix
50ul(2×)Loading buffer 950C/5min
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电泳槽
样品槽
电泳 方向
上样器 阴极
上电极缓冲液
阳极
聚丙烯酰胺凝胶板
下电极缓冲液
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蛋白质点的染色
• 凝胶上的蛋白质点染色常用方法有银染法、考马斯亮蓝
染色法, 另外还采用以下染色试剂:丽春红S、氨基黑、 印度墨、35S 硫脲银、胶态金、咪唑锌等. • 银染法广泛用于双向凝胶电泳分离后蛋白质点的染色 , 该法灵敏度为4 ng , 但对质谱测定有干扰, 必须
先脱银.
• 考马斯亮蓝染色法可用于胶上或膜上蛋白质点染色 , 该法操作方便、重现性好, 同银染法一样, 质谱测 定时也必须先脱色.
蛋白质组学研究方法与实验方案
蛋白质组学研究方法与实验方案随着科学技术的不断发展，蛋白质组学已经成为了生物医学领域中的一个重要研究方向。
蛋白质组学是指通过对细胞或组织中的蛋白质进行分析，来探究这些蛋白质在生物体内的作用和功能。
本文将从理论和实验两个方面，详细介绍蛋白质组学的研究方法与实验方案。
一、蛋白质组学的理论基础1.1 蛋白质的结构与功能蛋白质是由氨基酸组成的大分子化合物，其结构和功能密切相关。
蛋白质的结构决定了其功能的实现，而蛋白质的功能又反过来影响其结构。
因此，对蛋白质的结构和功能进行深入研究，有助于我们更好地理解蛋白质组学的本质。
1.2 蛋白质的分离与鉴定蛋白质的分离是蛋白质组学研究的基础。
目前常用的蛋白质分离方法有凝胶过滤、亲和层析、电泳等。
这些方法可以帮助我们将复杂的混合物中的蛋白质分离出来，并对其进行初步鉴定。
1.3 蛋白质的定量与分析蛋白质的定量与分析是蛋白质组学研究的核心环节。
目前常用的蛋白质定量方法有比色法、荧光法、电化学法等。
这些方法可以帮助我们准确地测定样品中蛋白质的数量，并对其进行进一步的分析。
二、蛋白质组学的实验方案2.1 实验材料与设备在进行蛋白质组学实验时，需要准备一系列的实验材料和设备，包括：(1)细胞样本：如人类血液、尿液、组织切片等。
(2)试剂：如酶、抗体、色谱柱等。
(3)仪器设备：如高效液相色谱仪(HPLC)、质谱仪(MS)、核磁共振仪(NMR)等。
2.2 实验步骤与流程蛋白质组学实验通常包括以下几个步骤：(1)样品处理：将细胞样本进行固定、脱水、去盐等处理。
(2)蛋白质提取：利用各种试剂从样品中提取出目标蛋白质。
(3)蛋白质纯化：通过柱层析、电泳等方法将目标蛋白质纯化至一定程度。
(4)蛋白质鉴定：利用各种技术手段对目标蛋白质进行鉴定，如比色法、荧光法、电化学法等。
(5)数据分析：利用统计学方法对收集到的数据进行分析，得出结论。
2.3 结果解读与讨论在完成实验后，我们需要对实验结果进行解读与讨论。
蛋白质组学的基本研究方法PPT课件
（3）还原剂用于断裂二硫键，常用的有DTT（二硫苏糖醇）、TDF （二硫赤藓糖）
和TBP（三丁基膦）
使用注意点：
样品离心前在室温下至小保持1小时，使完全变性和溶解；样品含尿素不可加热，
已防蛋白修饰；样品类型不同，选择裂解液的- 组成也不同。
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（二）蛋白质分步提取技术
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Sample Preparation
μg/ml DNase I 、 5 μg/ml RNase A 。
对大部分细胞提取，第一步与第二步往往出现相同的图谱，最后一步因
膜蛋白提取出来而完全不同。若先将细胞器分级提取，再联合上述方法，
效果将更好。
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（三）亚细胞蛋白质的提取
1、细胞中亚细胞的分离
据蛋白的大小和密度的差异进行分离。细胞破碎后，先低速离心从胞质溶 液中分离出细胞核和未破碎的细胞，得到上清溶液；随后对上清溶液进行密 度梯度分离，得到线粒体、溶酶体等亚细胞器；然后对亚细胞内的蛋白质进 行分离提取。
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2、蛋白质组学研究技术进展
（1）1975年，2-DE技术建立 （2）上世纪80年代，固相化pH梯度凝胶问世，使2D-E的重复性
和加样量改善 （3）上世纪末期，MALDI-TOF-MS和ESI-MS可精确测定相对分子
量和微量 （4）快速多肽序列 （5）90年代，多图象分析与大规模数据处理软件问世，复杂蛋
更多的离液剂进行清洗，可去掉与膜作用不强的非膜蛋白，从而富集膜蛋
白。另外膜蛋白通常位于两相去污系统中相对较丰富的一相。
B、摸蛋白的特性
低丰度、大多偏碱性、难溶于等电聚焦的水相介质中。
C、为了从二维电泳凝胶图谱中分离出膜蛋白，首先必须服从三个条件
(完整)蛋白质组学研究方法精品PPT资料精品PPT资料
DE maps of PEG fractions: (C) F1 PEG fraction; (D) F2 PEG fraction; (E) F3 PEG fraction. 可回收，点样于MS样品靶 生物质谱技术（MALDI-TOF-MS, ESI-MS)
The typical flow of gel-based proteomics (2DE & MS) 蛋白质组学比基因组学研究复杂
Expression analysis 蛋白质不能用PCR扩增
– Second-dimension SDS-PAGE 20世纪80年代末期的两项软电离质谱技术—电喷
Sample preparation
可得到等电点、分子量的信息
优点
缺点
不已自动化
After removal
将DNA固定化在表面已经是成熟的 由于蛋白质分子的稳定性不好，方法的重复性 1．二维色谱—串联质谱技术（2D-HPLC-MS-MS)
Of albumin
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2-DE analysis of non-fractionated soybean leaf proteins (Left) and Ca2+/phytate fractionated soybean leaf proteins (Right).
(Krishnanet al. (A rapid method for depletion of Rubisco from soybean
时间/自动化
已成为高通量的扫面技术
高通量与自动化
目前还达不到工业化需求的高通量
采用二维色谱—串联质谱技术可以对 (A rapid method for depletion of Rubisco from soybean
蛋白质组学研究技术
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第二节 蛋白质组学研究的技术体系
过程 1）收集生物样品 2）破碎 3）抽提
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第二节 蛋白质组学研究的技术体系
抽提蛋白质常用到的试剂 1）去污剂，有助于溶解膜蛋白质，并有 助于膜蛋白质与脂类的分离 2）还原剂，用于还原二硫键或防止蛋白 质氧化 3）变性剂，用于改变溶液离子强度和PH， 破坏蛋白质-蛋白质相互作用，破坏蛋白 质的二级结构和三级结构。 4）酶，用于消化污染的核酸、糖和脂类。
科技部已将疾病蛋白质组研究列入我 国“973”计划项目和“863”计划项 目；国家自然科学基金委员会也将 “蛋白质组研究”列为重点项目。
我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌 蛋白质组研究方面取得了较大的进展。
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第一节 概述
蛋白质组的概念： 2019年，由Wasinger等在《Wlectrophoresis》
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Central dogma
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第一节 概述
基因与其编码产物蛋白的非线性关系
mRNA水平的基因表达研究取得进展，但 mRNA与蛋白质间的相关系数仅为0.4～0.5， mRNA的种类与含量不能代表蛋白质的种类与 含量。支原体的蛋白质数目较基因多24%，对 于人，蛋白质的数目至少多3倍。 蛋白质自身特点难以从DNA和mRNA水平得到 解答：复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定 位或迁移、蛋白质－蛋白质相互作用等
样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质的 上样量和检测灵敏度。
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第二节 蛋白质组学研究的技术体系
分步提取法 采用三种溶解性能不同的裂解液分步提取细胞 总蛋白质组分，然后分别进行双向电泳分离。 各步提取液： ①40mmol/L Tris-base； ②8m/L尿素、4%CHAPS、100mmol/L DTT、 40mmol/L Tris-base、0.5 %的两性电解质； ③5m/L尿素、 2mol/L硫脲、4%CHAPS、 2%SB3-10、2mmol/L TBP、40mmol/L Trisbase、0.5 %的两性电解质。