绿色木霉对大豆等植物的危害及防治

重寄生菌木霉灭毒剂作为抗红豆尖孢镰刀菌和强雄腐霉的生物防治药剂以及大豆生长促进剂

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Received 18 May 2010

Received in revised form

23 July 2010

Accepted 2 August 2010

关键词:

木霉灭毒剂

大豆

生物防治药剂

红豆尖孢镰刀菌

强雄腐霉

生长促进剂

摘要:

木霉灭毒剂被证实能够有效地针对两种真菌病原体, 感染大豆的红豆尖孢镰刀菌和强雄腐霉进行生物防治.在体外进行的生物防治试验,木霉显示了试验病原真菌的重寄生现象和破坏性控制.这两种病原体显著影响发芽,强雄腐霉具有严重的影响(发芽率只有5%).大豆根系发育不良是由于感染和外加的负面影响在根瘤固氮以及植物的进一步发展阶段.在生物防治活性测定中,结果表明木霉菌生长促进大豆植物的生长.木霉强化嫩枝和根系的生长以及十二周后果实的产量.腐霉和镰刀菌感染的木霉治愈过的植株比病原体单独的高194%和141%.木霉治愈过的果实产量每株66而对照植株只有41.腐霉和镰刀菌感染过的木霉治愈植株果实产量分别为43和53他们比被病原体感染的分别高5倍和1.6倍.

1简介

大豆(毛豆属Merr. cv. Lotus,早期品种,加拿大魁北克省农业和农业食品参考中心)是最重要的农作物之一(Herridge et al., 2008; Prévost et al., 2010)以及植物蛋白和油的来源.大豆占全球豆类作物种植面积的一半和68%的产量以及修复16.4 Tg N/year,它代表了大于四分之三的种植面积施用氮肥(Herridge et al., 2008).真菌疾病是一个主要的获得高产商业大豆的障碍,普遍使用一些化学杀菌剂控制这些疾病.由于生物防治剂的出现化学杀菌剂的应用已被取代,因为出现了杀菌及耐药菌株以及公众对于健康和化学物质对环境的影响的关注.在过去的几十年里,几个潜在的生防微生物已被隔离,以及商业化和特点,因此植物病害生物防治已受到更多的关注(Shali et al., 2010).木霉被认为是现在的生防和促生长剂对于许多的作物来说(V erma et al., 2007; Bai et al., 2008; Savazzini et al., 2009).病原体,寄生菌和抗真菌化合物的竞争中最重要的是生防机制(V erma et al., 2007; Savazzini et al., 2009).木霉种群可以比较容易的生长在不同的土壤类型,可以继续在检测水平持续几个月.木霉灭毒剂(被印度理工学院分离获得,印度新德里)是对土传植物病原微生物制剂,他可以轻松地分散在植物根周围以及帮助植物生长(V erma et al.,2007).

镰刀菌属和腐霉属,是两种真菌病原体能够严重感染大豆从而影响大豆的从萌发生长到各生长阶段.腐霉属,感染常见于玉米和大豆,造成两种作物的猝倒疾病.这种损害是由腐霉引起的对于种植者能够带来重大的经济损失. (Zhang and Y ang, 2000).镰刀菌如茄病镰刀菌感染大豆幼苗根和叶症状(坏死,枯黄,落叶等)通常花开前后略有下降.该菌株可减少严重感染早期,种子和荚果的减产. (Luo et al., 1999).强雄腐霉3047(收集于AAFC Ottawa collection, Ontario)

和枯萎病菌oxysporum f. sp. Adzuki(分离收集于AAFC Ottawa collection, Ontario)已被分离且对大都专门病原体确定.体外生物活性可以确保对这些病原体生防反应,并进一步.将确保最终成功(V erma et al.,2007).我们团队以前测试了镰刀菌生物防治的木霉菌株潜在性.和Cylindrocladium ?oridanum(分离获得自Laurentian Forestry Centre (LFC), Quebec, Canada)以及他们对不同植物生长的影响.据Sivan 和Chet (1989),木霉菌菌株他们可以改变生物防治活性病原体到病原体。木酶（T-203 and T-35)是强烈的重寄生菌对水稻纹枯病菌和瓜果腐霉分离株，但非枯萎菌寄生，如楼病菌藻和枯病菌藻。(Sivan and Chet, 1989).在本研究中，T的潜在木酶A TCC 9275进行了测试，上述的生防真菌分离出两个新病原体和病原体和拮抗剂对种子发芽生长的影响和初步植物（水果在大豆植物中。）

2、材料和方法

2.1 使用和维护微生物

绿色木霉A TCC 9275作为生物控制剂是用两条大豆病原体，腐酶3047玉米，AAFC收集渥太华，安大略省和尖孢镰刀菌分离楼藻。小豆大豆分离，AAFC耙，安大略省。这两个物种可能导致大豆和玉米根腐病。在这项研究中，慢生根瘤菌532c（Nitragin孕育剂，密尔沃基，威斯康星州，美国），一结瘤菌，被用来提供共生生物固氮。病原体和微生物制剂培养在马铃薯30摄氏度的葡萄糖琼脂（PDA）天为5到7 天，储存在4摄氏度下直到使用。在酵母中提取甘露醇种植Bradyrhizobiumwas肉汤（YMB），浓缩，离心（10,380 20分钟克4℃）和4摄氏度下储存储存，直到使用。

2.2 在体外试验的生物防治

在体外T的绿色木霉对镰刀菌抗真菌活性，和腐菌，被测试的双重培养方法。光碟（直径5毫米）的真菌病原体株（一次一个）和木霉切断推进7天的PDA边缘文化相互放置5厘米，培养在30摄氏度下。及以上的真菌病原体侵入径向木霉生长的抑制作用进行了测定和与对照组相比。

2.3 植物法

多兰斯等（2004年）报告说，腐霉属。从被感染的种子或幼苗的玉米或大豆收回，或直接从土壤中有致病性和侵略性的致病性实验时，测试范围。因此，这些病原体和生物制剂进行了测试，发现土壤对种子发芽的影响。

2.3.1培养皿测试

木霉真菌病原体和转移分别为1％（瓦特/ V）的水琼脂（WA）和室温（25e30三）培养接种前7天。大豆种子进行表面消毒和（华盛顿州）真菌培养上。种子也放在作为对照组未接种西澳板。板块在10摄氏度下的黑暗中培养6天，然后在疾病的发生明显前2天再移到至室温（25摄氏度到30 摄氏度）。每个菌被认为是一种处理，并有应变三复制每个板块。对soybeanwas侵略性的评定量表：0=没有可见的感染（种子可以作为germinatedwhen主根长度等于种子长度定义）种子发芽；1=发芽与根光变色；2=发芽短，严重变色根；3=发芽后死亡；4=发芽前死亡。真菌对大豆的积极性应变测量，计算作为一种疾病指数从以下公式：病情指数=∑xi/N

其中xi是第i个复制疾病评级(i=0~4), N是苗木审查总数.

2.3.2 土壤真菌接种的准备

所有真菌培养生长在马铃薯葡萄糖琼脂并且培养在25摄氏度到30摄氏度下3天。6个1平方厘米3天的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上长出的插头每个菌培养物放置在瓶500毫升含有200毫升的砂，玉米粉11.2毫升，80去离子水蒸压40分钟两次（毫升，然后再次为24小时）。被允许的真菌定植10天sandecorn餐中。该瓶被动摇每隔一天，以确保统一的殖民统治。繁殖数量的测定在PDA或玉米粉琼脂板（贝茨等人2008）电镀土壤稀释。

2.3.3 出现检测

土的巴氏杀菌（二氧化硅的混合物：蛭石水分，1:1）的基础层，由病原体层之后，约2毫米厚，被安置在底部排水塑料壶。接种覆盖着一层薄薄的土壤消毒和10对土壤种子播种。二血吸虫被用作本研究生物肥料。种子预接种前1与B血吸虫播种小时。再次覆盖的种子消毒土壤用100克。壶是浇水放入塑料托盘，并在生长箱（22摄氏度到17摄氏度的日/夜温度，光照16小时）内。苗数的10天以后出现的记录。所有苗木从土壤中分离的种子在流水下冲洗，每次观察是为疾病观察记录根变色，根销毁或前或后发芽，幼苗死亡。

2.3.4 生物防治法（长期）

土壤样品（二氧化硅的混合物：蛭石，用N2无植物营养液，水分霍格兰溶液1:1）被用来在不同的组合：（1）未经任何处理（2）与土壤混合接种木霉（3）与土壤混合接种镰刀菌（4）腐土混合接种（5）与木霉和镰刀菌混合，土壤接种（1:1比例）（6）与木霉和腐菌混合，土壤接种（1:1比例）。接种含有w1500繁殖/克所有真菌培养土。八复制每个实验塑料壶进行了审判。最初10个种子（与慢生涂2 106细胞每种子）土壤中含有的大豆播种面积分别加入不同的花盆，经过近10天只为2发芽的植物生物活性而保留perpotwere。在控制植物生长的环境条件在生长室（Conviron模型PGR15，环境控制有限公司，温尼伯，加拿大）（390 60 mmol/mol美国）underambient二氧化碳（22/17摄氏度昼/夜温度，16小时光照）。植物定期浇水（每天两次），使土壤接近饱和，无氮营养液（200毫升）每星期浇一次维护。与植物结瘤等指标，疾病严重程度，干重（地上部和根系），株高，碳，氮，不同参数的记录。在生长6周之后，这植物实在花绽放的开始阶段收获的，把根与芽分开，用溪水把根洗净，去除沙粒，根瘤菌结瘤根据测定，（表1，丰度，位置，颜色和大小的结节），根与芽在70摄氏度干燥72小时，并测量它的干重，并系统的测量碳和氮的总浓度，另一种植物再保存6个星期，来评估为水果产量，这种水果或植物的干重以及水果的产量需要被记录，其感染方面的数据也需要被监测。

2.4. 色素分析

对一种已知色素含量的植物进行色素提取需要使用百分之八十含量的丙酮，叶绿素和类胡萝卜素

使用光谱和浓度检测，并用比施曼（2001）方法来计算。该色素浓度表示为毫克/克干重。

2.5。统计分析

所有的的实验都要进行多次测量，实验数据也要在标准差的基础上取其平均数。数据通过方差分析，而且结果要求在P < 0.05的情况下被视为显著。这些方法的区别被认为使用了费舍尔的最小显着差异方法。

3。结果与讨论

3.1 体外研究

这种霉菌初始阶段生长较快，在48小时内，这种菌覆盖超过了板的一半，之后，在120小时潜伏期内，木彻底侵染并销毁了腐霉。尖孢镰刀菌生长速度小雨木霉，但尖孢镰刀菌生长受到了木霉的限制，如图所示。虽然，木霉抑制细菌的生长，但其对镰刀菌孢子的影响较小，木霉在平板中所有细菌可以生长的地方进行生长，从而来一直其他菌种生长，在有木霉的平板中，病原菌没有进一步的生长，经过长时间的生长，两种菌种控制了平板，这些初步的实验结果表明木霉菌株目前可作为一种病原真菌的防治剂，通过微观观察平板，木霉缠绕周围的病原体，这证明木霉对真菌特别是腐霉有极强的破坏性。抗菌素的生产，重寄生现象，细胞壁降解酶的产量和营养空间的竞争被视为病原体生物的防治行动，在

木霉菌和真菌之间的相互作用过程中，在两者相互接触之前，一种分子被宿主释放被证明是水解酶，在直接接触过程中，宿主分泌的细胞凝集素可以缠绕木霉菌菌丝而且宿主可以产生附着胞状结构，以摧毁病原体。根据Zeilinger和Omann，酶的产量和感染结构的形成是

由扩散因子来诱导激活的，切特说明了许多菌种（丝核菌和腐霉）与木霉的作用，例如与木霉可以共存的菌种。病原菌菌丝正常降解来取代穿透附着胞状结构，而且他们已经观察到病原体中木霉的生长。

3.2大豆种子的发芽率检测

种子的感染或者根部的变色，这些疾病的状况需要被记录，这两个几乎对种子起类似作用的病原体，而且他们的病情指数分别为3.3和3.7，这两种菌分别是尖孢镰刀菌和腐酶菌种（最高病情指数是4）。在疾病的评级中，在发芽或发芽之前，尖孢镰刀菌和腐酶完全感染了所有的种子

3.3结果检测

病原体可以影响大豆植株根系进而影响大豆植株结瘤，在最初的几天，控制种子具有更高的发芽率，百分之六十的种子在前5天，只有百分之四十的发芽率的种子被观测到木霉在其土壤中，而土壤中的尖孢镰刀菌被木霉所控制，在发芽测试的最后阶段（第十天），含有木霉的土壤具有较高的发芽率，尖孢镰刀菌却很影响种子的发芽，以至于只有百分之三十五的种子发芽，木霉可以提高种子的发芽率达百分之六十五，在发芽期间腐酶几乎全部耗尽，且大多数中资没有发芽或是在发芽之后就死去，只有0.5%的种子被观测到发芽并活了下来，地上部分的生长和根部系统也会受到病原体的侵染，然而，通过利用木霉，疾病将会被控制或是被降低感染风险，被木霉控制腐酶会延迟发芽的时间，最后在第十天发芽率在65%，在13天之后，发芽率会在90%以上，土壤中含有腐酶的没有发芽，并进一步证明这种疾病的严重程度，多兰斯报告说，腐霉可以单独引发疾病也可以为其他菌种提供组织感染植物，有一个例子就是一种腐霉引发玉米根部的腐烂。

3.4长期影响

植物集分别保存6个星期，观察生长的治疗效果，之后在进行12周的的培养来验证果实产量，镰孢菌侵染植物要比腐霉菌侵染植物要好得多，在长期的生长过程中，只有6%的被腐霉侵染的幸存的活下来。在6周之后，根系通过各种方法的治疗，并检测其生长和根瘤指数。根瘤为了控制植物，其指数为18，木霉侵染植物，植物在上述条件下根部具有许多大的粉红色的结节，这两种病菌感染植物产生较少的根瘤，而且产生的根瘤也较小，木霉侵染植物后会减少结瘤，木霉通过控制病原体来进行治疗，使植物的感染程度降低，促进了植物的生长，这可能是由于木没得的增效作用。木霉对根起作用，促进根系的生物量的积累，并提高对氮元素的固定。生物控制剂可能与植物相互作用并交换代谢产物，并可能引起重大的植物代谢。当木霉侵略植物的根系，他只是侵略表面层的根系，进一步的渗透可控制植物的防御系统。因此，木霉通常是无毒的，从内部侵染植物。然而，一些植物的防御系统变得系统化，而且可以保护整个植物免受病原体的侵染，此外，根部侵染可以促进植物的生长，从而提高植物的产量，植物根部的共生联盟可以帮助植物适应环境和提高养分吸收。植物干重被镰刀菌和腐霉侵染是在植物生物活性处理所有类型中的最小值，然而木霉通过侵染植物来改善根系和植物的干重，从而得到结论，绿色木霉具有抑制细菌生长的能力，即使在土壤中，它以一个类似的方式控制菌种，在木霉侵染的情况下植物的氮，碳和干重含量要显著增加，而且在生物防止方面起到了积极的作用。色素的含量也证明了对大豆生长的病原菌的影响

叶绿素含量是腐霉侵染植物当中最低的。腐霉侵染植物的高度在16厘米，误差在0.2厘米内。然而木霉侵染植物的最大高度为62.5厘米，误差在1.8厘米内。腐霉和镰刀菌侵染植物对抗木霉已超过他们自己侵染植物194％和141％以上的高度。Vinale认为次生代谢产物如生长素或植物生长素诱导物质的相互作用可能是改进增长的原因，给花生接种根瘤菌进行种子推广，通过增加跟的密度来增加根瘤。

因此，氮的吸收，生长和作物产量对木霉的治疗有积极的影响。被病原菌侵染的植物会影响干重和果实重量，被病原菌控制的根系密度往往小于被木霉控制的植株根系。根系的生长反应了地上部的生长和果实的产量，病原菌感染的植株，

特别是腐霉感染的植株往往很少产果实，而其他的植株却结许多水果。