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5
M13噬菌体的生命周期
1. PIII蛋白结合于E.Coli 的F纤 毛
2. 细菌的Tol蛋白复合体解聚噬 菌体的外壳蛋白，ssDNA转 运至胞浆
3. 病毒ssDNA进入细菌的胞浆 合成dsDNA
4. 以dsDNA为模版合成所有的 病毒蛋白，且通过滚环复制
合成组装病毒所需的ssDNA。
5. 第一代噬菌体在感染10分钟 后出现在培养液中
膜上；与噬菌体组装终止有关。 • G1、G2:甘氨酸片段，在感染过程
中，增加各个功能域之间的灵活性
7
主要外壳蛋白 pVIII
• 每子个病毒含约2700个拷贝， 约10%能有效地融合外源多 肽。以pIII融合子方式表达的 是单价的，而以pVIII融合子 方式表达的则是多价的。
• 这种多价pVIII展示所增加的 亲和力有利于筛选到亲和力 非常低的配体，而单价pIII展 示则将筛选限制在具有较高 亲和力的配体上。
复合物。 优点：克服直接包被的出现的问题 缺点：容易筛到与亲和素（或者链酶亲和素）结合的克隆。
14
噬菌体抗体库淘选示意图 直接包被法
• 噬菌体抗体库与靶分子相互 作用
• 洗涤去未结合的或非特异性 结合的噬菌体
• 将特异性结合的噬菌体洗脱 下来，并扩增，用扩增产物 进行下一轮筛选
• 三轮淘选后，克隆测序
19
第五步：扩增—将洗脱的噬菌体扩增 扩增产物进行下一轮筛选
后面的筛选逐步加大筛选压力
多克隆和单克隆噬菌体ELISA
ELISA阳性克隆测序，最终得 到特异性结合的克隆序列
感染 和扩增
E.coli
20
噬菌体展示系统 Phage on display
•噬菌体展示原理 –噬菌体展示定义、分类
–简介噬菌体及淘选过程
噬菌体表面展示技术：是一种将外源多肽或蛋白质的 DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白的一个结构基因的适当位 置上,外源基因将随着外壳蛋白的表达而表达,从而使多肽 或蛋白以与外壳蛋白融合表达的形式展示在噬菌体表面。
3
噬菌体展示系统的分类
根据噬菌体不同： •温和噬菌体---M13 •烈性噬菌体---T7
根据文库不同： •肽库 •CDNA文库 •抗体库
pIII展示 单价展示 亲和力高
主要应用于抗体库
9
噬菌体展示技术流程
10
噬菌体抗体库的构建
建库：[例子]
11
12
噬菌体质粒-phagemid
• 噬菌体质粒特征： • 携带有欲在噬菌体上融合展示的外源蛋白基因和pIII基
因，没有其他噬菌体基因。 • 有包装序列信号。（packing signal）
15
噬菌体抗体库淘选示意图 液相法
第一步：生物素化抗体与磁珠结合 Bind to Streptavidin coated magnetic bead biotin -antigen
16
第二步：磁珠生物素化抗原复合物与抗体库结合
17
第三步：洗涤—洗去非特异和弱结合的噬菌体
18
第四步：洗脱—将特异性结合的噬菌体洗脱下来
4
M13噬菌体的组成和结构
1. 丝状噬菌体：M13。 2. 单链DNA病毒,6407 bp。 3. 基因组编码11种蛋白质，其
中5种为结构蛋白质。 4. 与展示密切相关的有pIII、
pVIII两种结构蛋白质。 5. DNA在细菌内滚环复制，细
菌不被裂解，但生长速度减 慢，并且分泌大量噬菌体颗 粒。
• 有供筛选的抗生素标记基因。
• Helper phage：提供噬菌体质粒复制、合成ssDNA和 病毒包装所需要的所有蛋白和酶。
13
筛选的方法－亲和淘选
直接包被淘选法： 直接将靶分子包被在固相表面 优点：简单直接。 缺点：偶尔会导致配体结合位点难以进入 可能是由于分子的立体封阻 或者是靶分子表面的部分变性而引起 液相淘选法： 将靶蛋白与噬菌体抗体库先结合，之后再亲和捕获靶分子-噬菌体
•噬菌体展示应用 •淘选过程中常见问题及解决方案
21
噬菌体展示的应用
•抗原表位分析 •发现特异性抗体 •新疫苗、多价疫苗的开发
22
淘选过程中常见问题及解决方案
23
谢谢
24
8
pIII展示和pVIII展示的区别
• pVIII 展示的多肽比较小，如果太大会影响噬菌体壳蛋白的组 装。
• pIII只要不影响感染，可以展示更大的多肽及蛋白。
• 丝状噬菌体展示系统一般是在外壳蛋白pIII或pVIII的N端融合 表达外源多肽及蛋白。
pVIII展示 多价展示
筛选到的分子亲和力相 对低 高拷贝数增加了抗原性 应用于肽库
噬菌体展示系统 Phage on display 1
噬菌体展示系统 Phage on display
•噬菌体展示原理 –噬菌体展示定义、分类
–简介噬菌体及淘选过程
•噬菌体展示应用 •淘选过程中常见问题及解决方案
2
什么是噬菌体表面展示技术
Smith在1985年首次证实外源DNA可以插入丝状噬菌体基 因III中，并与pIII蛋白融合展示。
6. 感染后1小时内平均每个细胞 分泌1000个噬菌体
6
次要外壳蛋白 pIIIΒιβλιοθήκη Baidu
1. 406 aa 组成，5个拷贝，位于噬菌 体的尾部。
2. 由三个功能区组成： • N1 穿膜区：作用于E.coli细胞膜上
的TolA蛋白；与噬菌体的入侵有关。 • N2 受体结合区：负责结合F菌毛。 • CT 疏水区：组装前黏附在细菌内
M13噬菌体的生命周期
1. PIII蛋白结合于E.Coli 的F纤 毛
2. 细菌的Tol蛋白复合体解聚噬 菌体的外壳蛋白，ssDNA转 运至胞浆
3. 病毒ssDNA进入细菌的胞浆 合成dsDNA
4. 以dsDNA为模版合成所有的 病毒蛋白，且通过滚环复制
合成组装病毒所需的ssDNA。
5. 第一代噬菌体在感染10分钟 后出现在培养液中
膜上；与噬菌体组装终止有关。 • G1、G2:甘氨酸片段，在感染过程
中，增加各个功能域之间的灵活性
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主要外壳蛋白 pVIII
• 每子个病毒含约2700个拷贝， 约10%能有效地融合外源多 肽。以pIII融合子方式表达的 是单价的，而以pVIII融合子 方式表达的则是多价的。
• 这种多价pVIII展示所增加的 亲和力有利于筛选到亲和力 非常低的配体，而单价pIII展 示则将筛选限制在具有较高 亲和力的配体上。
复合物。 优点：克服直接包被的出现的问题 缺点：容易筛到与亲和素（或者链酶亲和素）结合的克隆。
14
噬菌体抗体库淘选示意图 直接包被法
• 噬菌体抗体库与靶分子相互 作用
• 洗涤去未结合的或非特异性 结合的噬菌体
• 将特异性结合的噬菌体洗脱 下来，并扩增，用扩增产物 进行下一轮筛选
• 三轮淘选后，克隆测序
19
第五步：扩增—将洗脱的噬菌体扩增 扩增产物进行下一轮筛选
后面的筛选逐步加大筛选压力
多克隆和单克隆噬菌体ELISA
ELISA阳性克隆测序，最终得 到特异性结合的克隆序列
感染 和扩增
E.coli
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噬菌体展示系统 Phage on display
•噬菌体展示原理 –噬菌体展示定义、分类
–简介噬菌体及淘选过程
噬菌体表面展示技术：是一种将外源多肽或蛋白质的 DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白的一个结构基因的适当位 置上,外源基因将随着外壳蛋白的表达而表达,从而使多肽 或蛋白以与外壳蛋白融合表达的形式展示在噬菌体表面。
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噬菌体展示系统的分类
根据噬菌体不同： •温和噬菌体---M13 •烈性噬菌体---T7
根据文库不同： •肽库 •CDNA文库 •抗体库
pIII展示 单价展示 亲和力高
主要应用于抗体库
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噬菌体展示技术流程
10
噬菌体抗体库的构建
建库：[例子]
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12
噬菌体质粒-phagemid
• 噬菌体质粒特征： • 携带有欲在噬菌体上融合展示的外源蛋白基因和pIII基
因，没有其他噬菌体基因。 • 有包装序列信号。（packing signal）
15
噬菌体抗体库淘选示意图 液相法
第一步：生物素化抗体与磁珠结合 Bind to Streptavidin coated magnetic bead biotin -antigen
16
第二步：磁珠生物素化抗原复合物与抗体库结合
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第三步：洗涤—洗去非特异和弱结合的噬菌体
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第四步：洗脱—将特异性结合的噬菌体洗脱下来
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M13噬菌体的组成和结构
1. 丝状噬菌体：M13。 2. 单链DNA病毒,6407 bp。 3. 基因组编码11种蛋白质，其
中5种为结构蛋白质。 4. 与展示密切相关的有pIII、
pVIII两种结构蛋白质。 5. DNA在细菌内滚环复制，细
菌不被裂解，但生长速度减 慢，并且分泌大量噬菌体颗 粒。
• 有供筛选的抗生素标记基因。
• Helper phage：提供噬菌体质粒复制、合成ssDNA和 病毒包装所需要的所有蛋白和酶。
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筛选的方法－亲和淘选
直接包被淘选法： 直接将靶分子包被在固相表面 优点：简单直接。 缺点：偶尔会导致配体结合位点难以进入 可能是由于分子的立体封阻 或者是靶分子表面的部分变性而引起 液相淘选法： 将靶蛋白与噬菌体抗体库先结合，之后再亲和捕获靶分子-噬菌体
•噬菌体展示应用 •淘选过程中常见问题及解决方案
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噬菌体展示的应用
•抗原表位分析 •发现特异性抗体 •新疫苗、多价疫苗的开发
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淘选过程中常见问题及解决方案
23
谢谢
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8
pIII展示和pVIII展示的区别
• pVIII 展示的多肽比较小，如果太大会影响噬菌体壳蛋白的组 装。
• pIII只要不影响感染，可以展示更大的多肽及蛋白。
• 丝状噬菌体展示系统一般是在外壳蛋白pIII或pVIII的N端融合 表达外源多肽及蛋白。
pVIII展示 多价展示
筛选到的分子亲和力相 对低 高拷贝数增加了抗原性 应用于肽库
噬菌体展示系统 Phage on display 1
噬菌体展示系统 Phage on display
•噬菌体展示原理 –噬菌体展示定义、分类
–简介噬菌体及淘选过程
•噬菌体展示应用 •淘选过程中常见问题及解决方案
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什么是噬菌体表面展示技术
Smith在1985年首次证实外源DNA可以插入丝状噬菌体基 因III中，并与pIII蛋白融合展示。
6. 感染后1小时内平均每个细胞 分泌1000个噬菌体
6
次要外壳蛋白 pIIIΒιβλιοθήκη Baidu
1. 406 aa 组成，5个拷贝，位于噬菌 体的尾部。
2. 由三个功能区组成： • N1 穿膜区：作用于E.coli细胞膜上
的TolA蛋白；与噬菌体的入侵有关。 • N2 受体结合区：负责结合F菌毛。 • CT 疏水区：组装前黏附在细菌内