噬菌体展示技术PPT精选文档
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噬菌体展示技术和其应用ppt课件
2024/3/30
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应用举例：
部分做过的工作
2024/3/30
26
一、半合成噬菌体抗体库的构建
构建一个半合成抗体库，不经免疫制备人源抗Tie2 Fab抗体。通过RT-PCR方法，从人脐带血淋巴细胞总 RNA 扩增轻链基因及重链VH段基因，将轻链基因插 入pCOMb3载体中，得人轻链质粒库；从乙肝表面抗 体（HBsAb）的Fd段基因制备含有不同长度随机化 CDR3的FR3-CDR3-J-CH1片段，然后将VH段基因与随 机化的CDR3融合，得到Fd基因片段，再将其插入轻链 质粒库中，得半合成人Fab质粒库。
成3节段
2024/3/30
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M13噬菌体
丝 状 噬 菌 体
λ噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体
蝌 蚪 形 噬 菌 体
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T7与M13相比优势明显
T7Select的优势 解释
是在细胞质中表 达的裂解性噬菌 体
C-端融合
与M13不同，T7是裂解性的，其展示的蛋白无需分泌。
插入序列被克隆到T7Select载体基因10 的C-端，可以使带有终止密码子的 插入子得以表达和展示。
2024/3/30
34人源噬菌体Fab抗体半合成的构建将酶切纯化的重链重叠PCR产M13的超感染 下，繁殖出表算出κ＋Fd（包括CDR3-5个菌落，涂格，过夜培养后菌落PCR： 其中6个克隆中有轻链也有重链。双链插入率 为60％左右。
κ 链 文 库 的 容 量 为 5.03×106,λ 链 文 库 的 容 量 为 6.8×106(多次建库混合后的库容量)。
从平板上随机挑取10个菌落，涂为70％。
载体克隆容量大 T7载体比M13克隆容量大，而任何克隆到M13上大于1 kbp的片段都不稳定。
噬菌体展示技术及其应用.ppt
Lytic phages specifically kill pathogenic bacteria as an alternative to antibiotics
Example of a successful phage therapy treatment.
接受过噬菌体治疗的病人对细菌和病 毒感染的抵抗力增强, 噬菌体能上调感染 病人的免疫应答。噬菌体治疗能改变血清 α肿瘤坏死因子(TNF-α) 水平, 体外加入 噬菌体能提高血细胞培养物中的TNF-α和 白细胞介素6水平。IL-6 涉及Th2 型应答, 对诱导B细胞分化成抗体形成细胞特别重要。 总之, 这些结果表明噬菌体能作为细胞和 体液免疫的天然佐剂。
In phage display, a heterologous peptide or protein is displayed on the surface of the phage through transcriptional fusion with a coat-protein gene ,producing novel phage particles that have a variety of potential uses.
目前，能用于蛋白质/多肽展示的噬菌 体系统有丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展 示系统、T4噬菌体展示系统和T7噬菌体展示 系统。
T7 噬菌体基因组由39936bp双链线性DNA组成，有 160bp 的突出末端。T7噬菌体衣壳蛋白通常有2 种形式， 10A（344氨基酸）和10B（397氨基酸），10B是在10A的341 个氨基酸的翻译框中产生的(translational frameshift)， 约占衣壳蛋白的10%，功能性衣壳或者由10A、或者由10B、 或者由10A和10B以一定比例构成，这说明T7衣壳蛋白能够 容纳变异体。独特的10B 衣壳蛋白区存在于噬菌体表面， 所以被用作噬菌体展示。不像丝状噬菌体系统，展示在T7 表面的多肽或蛋白质不需要通过细胞膜分泌出来，因而其 表面展示多肽和蛋白的范围广。T7展示系统可以高、中、 低拷贝地展示不同分子量的蛋白质，是目前最为理想的展 示系统。
演示版抗体噬菌体展示技术.ppt
for display level
▪ Selective marker: for selection of infected host cells
.,
5
Introduction of Phage Display Technology
▪ Nonlytic filamentous phage is the most often
▪ pIII protein is essential for infection of bacteria ▪ Helper phage: wild-type pIII helper phage and
special helper phage
▪ Antigen immobilized on magnetic beads,
than mammalian cell line.
▪ Easier to maintain and grow bacterial cultures for recombinant
antibody production.
▪ Bypass immunization in antibody selection. ▪ Bypass the use of animal cells for production of antibodies. ▪ Producing the combinatorial library (ideally with 108 toisplay
Meiling Xiong 20180629
.,
Contents
2
▪ Introduction of Ab phage Display Technology ▪ Ab Formats for Phage Display ▪ Ab Libraries Construction ▪ Phage Ab Selection Methods & Strategies ▪ Phage Ab Screening Applications ▪ In vitro Affinity Maturation ▪ Expression & Purification of Phage Ab Fragments
▪ Selective marker: for selection of infected host cells
.,
5
Introduction of Phage Display Technology
▪ Nonlytic filamentous phage is the most often
▪ pIII protein is essential for infection of bacteria ▪ Helper phage: wild-type pIII helper phage and
special helper phage
▪ Antigen immobilized on magnetic beads,
than mammalian cell line.
▪ Easier to maintain and grow bacterial cultures for recombinant
antibody production.
▪ Bypass immunization in antibody selection. ▪ Bypass the use of animal cells for production of antibodies. ▪ Producing the combinatorial library (ideally with 108 toisplay
Meiling Xiong 20180629
.,
Contents
2
▪ Introduction of Ab phage Display Technology ▪ Ab Formats for Phage Display ▪ Ab Libraries Construction ▪ Phage Ab Selection Methods & Strategies ▪ Phage Ab Screening Applications ▪ In vitro Affinity Maturation ▪ Expression & Purification of Phage Ab Fragments
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介 ppt课件
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融合蛋白的表达是低价的，只有不到10％的噬菌体可以表 达融合基因，其余噬菌体展示的均是野生型噬菌体的p3蛋PPT课件
36
淘筛—亲和淘筛
1.噬菌体肽库与靶分子相互作用
2.洗涤去未结合的或是非特异性结合 的噬菌体
3.将特异性结合的噬菌体洗脱下来
M13噬菌体遗传图谱和结构示意图
PPT课件
17
3.6.2次要衣壳蛋白PⅢ展示系统
次要衣壳蛋白PⅢ
PⅢ是病毒的次要外壳蛋白，位 于病毒颗粒的尾端，是噬菌体感染 大肠杆菌所必须的。每个病毒颗粒 都有3个～5个拷贝PⅢ蛋白，其在结 构上可分为N1、N2和CT 3个功能区 域，这3个功能区域由两段富含甘氨 酸的连接肽G1和G2连接。其中，N1 和N2与噬菌体吸附大肠杆菌菌毛及 穿透细胞膜有关，而CT构成噬菌体 外壳蛋白结构的一部分，并将整个 PⅢ蛋白的C端结构域锚定于噬菌体 的一端。
PPT课件
18
PⅢ展示系统，PⅢ有2个位点可供外源序列插入， 当外源的多肽或蛋白质融合于PⅢ蛋白的信号肽(SgⅢ) 和N1之间时，该系统保留了完整的PⅢ蛋白，噬菌体 仍有感染性；但若外源多肽或蛋白直接与PⅢ蛋白的 CT结构域相连，则噬菌体丧失感染性，这时重组噬菌 体的感染性由辅助噬菌体表达的完整PⅢ蛋白来提供。 PⅢ蛋白很容易被蛋白水解酶水解，所以有辅助噬菌 体超感染时，可以使每个噬菌体平均展示不到一个融 合蛋白，即所谓“单价”噬菌体。
PPT课件
12
3.3 噬菌体侵染大肠杆菌
PPT课件
13
3.4 λ噬菌体展示系统
（1）PV展示系统。λ噬菌体的PV蛋白构成了它的尾部管状部分。PV有
两个折叠区域，C端的折叠结构域（非功能区）可供外源序列插入或 替换。λ噬菌体的装配在细胞内进行，故可以展示难以分泌的肽或蛋白 质。该系统展示的外源蛋白质的拷贝数为平均1个分子/噬菌体，这表 明外源蛋白质或多肽可能干扰了λ噬菌体的尾部装配。 （2）D蛋白展示系统。D蛋白的参与野生型λ噬菌体头部的装配。当突变 型噬菌体基因组小于野生型基因组的82%时，可以在缺少D蛋白的情况 下完成组装，故D蛋白可作为外源序列融合的载体，而且展示的外源 多肽在空间上是可以接近的。该系统有一个很好的特点，噬菌体上融 合蛋白和D蛋白的比例可以由宿主的抑制tRNA活性加以控制，这对于 展示那些可以对噬菌体装配造成损害的蛋白质时特别有用。
抗体噬菌体展示技术ppt课件
polystryrene surfaces, or on columns, or is .
used in solution as biotinylated antigen and
Advantages of Phage Display for
Recombinant Antibody Selection
▪ More efficiently than through conventional hybridoma system.
▪ Cheaper to produce recombinant antibodies using bacteria,
rather than mammalian cell line.
▪ Easy isolation and expression of the cloned gene in a bacterial
host.
▪ Excellent potential to further improve binding properties of the
selected antibody by protein engineering techniques.
▪ pIII protein is essential for infection of
bacteria
▪ Helper phage: wild-type pIII helper phage
and special helper phage
▪ Antigen immobilized on magnetic beads,
Antibody Phage Display
Meiling Xiong 20180629
.
Contents
▪ Introduction of Ab phage Display Technology ▪ Ab Formats for Phage Display ▪ Ab Libraries Construction ▪ Phage Ab Selection Methods & Strategies ▪ Phage Ab Screening Applications ▪ In vitro Affinity Maturation ▪ Expression & Purification of Phage Ab Fragments
used in solution as biotinylated antigen and
Advantages of Phage Display for
Recombinant Antibody Selection
▪ More efficiently than through conventional hybridoma system.
▪ Cheaper to produce recombinant antibodies using bacteria,
rather than mammalian cell line.
▪ Easy isolation and expression of the cloned gene in a bacterial
host.
▪ Excellent potential to further improve binding properties of the
selected antibody by protein engineering techniques.
▪ pIII protein is essential for infection of
bacteria
▪ Helper phage: wild-type pIII helper phage
and special helper phage
▪ Antigen immobilized on magnetic beads,
Antibody Phage Display
Meiling Xiong 20180629
.
Contents
▪ Introduction of Ab phage Display Technology ▪ Ab Formats for Phage Display ▪ Ab Libraries Construction ▪ Phage Ab Selection Methods & Strategies ▪ Phage Ab Screening Applications ▪ In vitro Affinity Maturation ▪ Expression & Purification of Phage Ab Fragments
噬菌体展示技术的原理及应用ppt课件
完整版ppt课件
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5. 酶： 例：碱性磷酸酶，蛋白水解酶类， 等等
完整版ppt课件
33
6. 底物与抑制剂： 主要是蛋白酶的底物和其抑制剂。
完整版ppt课件
34
7. 信息传递研究: 利用噬菌体展示多肽库，发现了一些受体，
如凝血致活酶、黑皮质素受体、CD80 和一 个 Hantaviral 受体；受体的配体， 如血管促 生素、 α-bungarotoxin， 和一些大蛋白分子 中的折叠区域，如 SH2、SH3 和 WW 区域。 从多肽库中可分离到与天然激素相似的、与
2
噬菌体展示技术是将
各种多肽或蛋白质以融合
蛋白的形式表达并展示在
噬菌体表面，同时将其遗
传密码包含于噬菌体内部，
这使得蛋白质的功能与其
基因密码有机的连结在一
起。
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3
选择方法： 淘选（Panning)
而不是 筛选（Screening)
完整版ppt课件
4
非展示系统
展示系统
完整版ppt课件
应用前景:
单克隆抗体 杂交瘤技术
杂交瘤 ~103 几个月 繁杂
噬菌体抗体 展示技术
细菌 107109 几周 相对简
必须
高 有限 再克隆
完整版ppt课件
有限
可避免
+ 低 无限 直接
28
不可估
二、噬菌体展示技术的应用现状
1. 抗体：
2.
抗狂犬病毒的单链抗体，
抗HIV-1囊膜糖蛋白的单链抗体，
此抗体可专一性杀死被HIV-1感染
完整版ppt课件
13
•
•
• 毒）
• 表面展示系统 • • •
噬菌体展示技术及20页PPT
噬菌体展示技术及
56、极端的法规，就是极端的不公。 ——西 塞罗 57、法律一旦成为人们的需要，人们 就不再 配享受 自由了 。—— 毕达哥 拉斯 58、法律规定的惩罚不是为了私人的 利益， 而是为 了公共 的利益 ；一部 分靠有 害的强 制，一 部分靠 榜样的 效力。 ——格 老秀斯 59、假如没有法律他们会更快乐的话 ，那么 法律作 为一件 无用之 物自己 就会消 灭。— —洛克
60、人民的幸福是至高无个的法。— —西塞 罗
▪
26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
▪
27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
▪
28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
▪
29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
▪
30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
谢谢！
20
56、极端的法规，就是极端的不公。 ——西 塞罗 57、法律一旦成为人们的需要，人们 就不再 配享受 自由了 。—— 毕达哥 拉斯 58、法律规定的惩罚不是为了私人的 利益， 而是为 了公共 的利益 ；一部 分靠有 害的强 制，一 部分靠 榜样的 效力。 ——格 老秀斯 59、假如没有法律他们会更快乐的话 ，那么 法律作 为一件 无用之 物自己 就会消 灭。— —洛克
60、人民的幸福是至高无个的法。— —西塞 罗
▪
26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
▪
27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
▪
28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
▪
29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
▪
30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
谢谢！
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第四章--噬菌体-PPT幻灯片
溶原状态
l 十分稳定，能经历许多代 l 在某些条件如紫外线、X线、致癌剂、突变剂等作
用下，可中断溶原状态进入溶菌性状态，这称为前 噬菌体的诱导与切离，发生率为10-2-10-5。 l 极少数溶原性细菌中的前噬菌体离开细菌基因组后， 不进入溶菌性周期，这个现象被形象地称之为“治 愈”。
溶原性转换（lysogenic conversion）
l 只要细菌有特异性受体，不论死活噬菌体都能吸附， 但噬菌体不能进入死亡的宿主菌。
穿入
l 有尾噬菌体吸附宿主后，借助尾部末端含有的 一种类似溶菌酶的物质，在细菌细胞壁上溶一 小孔，然后通过尾鞘的收缩，将头部DNA注入 细菌体内，而蛋白衣壳留在菌细胞外。
l 无尾噬菌体与丝形噬菌体可以脱壳的方式进入 细菌细胞内。
溶原周期
l 温和噬菌体（temperate phage）
l 噬菌体感染细菌后不增殖，不裂解细菌，其基因与 宿主菌染色体整合，不产生子代噬菌体，但噬菌体 DNA能随细菌DNA复制，并随细菌的分裂而传代
T4 bacteriophages infecting E.coli.
噬菌体噬菌体的复制来自2.化学组成l 蛋白质
© 构成噬菌体的头部的衣壳及尾部，包括尾髓、尾鞘、尾板、 尾刺和尾丝，起着保护核酸的作用，并决定噬菌体外形和 表面特征。
l 核酸-遗传物质
© 基因组大小2-200Kb © 核酸为DNA或RNA，大多数噬菌体的DNA为双链DNA，但一些
微小DNA噬菌体的DNA为环状单链。多数RNA噬菌体的RNA为 线状单链，少数为线状双链，且分成几个节段。 © 某些噬菌体的基因组含有异常碱基，如大肠埃希菌T2噬菌 体无胞嘧啶，而代以5-羟甲基胞嘧啶与糖基化的5-羟甲基 胞嘧啶；某些枯草芽胞杆菌噬菌体无胸腺嘧啶，而代以尿 嘧啶、 5-羟甲基尿嘧啶。因宿主细胞内没有这些碱基，可 成为噬菌体DNA的天然标记。
抗体噬菌体展示技术(课堂PPT)
▪ Easy isolation and expression of the cloned gene in a bacterial
host.
▪ Excellent potential to further improve binding properties of the
selected antibody by protein engineering techniques.
▪ Amber codon TAG: supE strains (glutamic acid
codon), non-suppressor strains (stop codon)
▪ Protease cleavage site
▪ Promoter
▪ Signal peptides: phage protein translocation, crucial
for display level
▪ Selective marker: for selection of infected host cells
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Introduction of Phage Display Technology
▪ Nonlytic filamentous phage is the most
6
▪ More efficiently than through conventional hybridoma system.
▪ Cheaper to produce recombinant antibodies using bacteria,
rather than mammalian cell line.
polystryrene surfaces, or on columns, or is used in solution as biotinylated antigen and
host.
▪ Excellent potential to further improve binding properties of the
selected antibody by protein engineering techniques.
▪ Amber codon TAG: supE strains (glutamic acid
codon), non-suppressor strains (stop codon)
▪ Protease cleavage site
▪ Promoter
▪ Signal peptides: phage protein translocation, crucial
for display level
▪ Selective marker: for selection of infected host cells
5
Introduction of Phage Display Technology
▪ Nonlytic filamentous phage is the most
6
▪ More efficiently than through conventional hybridoma system.
▪ Cheaper to produce recombinant antibodies using bacteria,
rather than mammalian cell line.
polystryrene surfaces, or on columns, or is used in solution as biotinylated antigen and
噬菌体展示技术
16
第二步：磁珠生物素化抗原复合物与抗体库结合
17
第三步：洗涤—洗去非特异和弱结合旳噬菌体
18
第四步：洗脱—将特异性结合旳噬菌体洗脱下来
19
第五步：扩增—将洗脱旳噬菌体扩增 扩增产物进行下一轮筛选
背面旳筛选逐渐加大筛选压力
多克隆和单克隆噬菌体ELISA
ELISA阳性克隆测序，最终得 到特异性结合旳克隆序列
噬菌体展示系统 Phage on display 1
噬菌体展示系统 Phage on display
•噬菌体展示原理 –噬菌体展示定义、分类
–简介噬菌体及淘选过程
•噬菌体展示应用 •淘选过程中常见问题及处理方案
2
什么是噬菌体表面展示技术
Smith在1985年首次证明外源DNA能够插入丝状噬菌体基 因III中，并与pIII蛋白融合展示。
• 有供筛选旳抗生素标识基因。
• Helper phage：提供噬菌体质粒复制、合成ssDNA和 病毒包装所需要旳全部蛋白和酶。
13
筛选旳措施－亲和淘选
直接包被淘选法： 直接将靶分子包被在固相表面 优点：简朴直接。 缺陷：偶尔会造成配体结合位点难以进入 可能是因为分子旳立体封阻 或者是靶分子表面旳部分变性而引起 液相淘选法： 将靶蛋白与噬菌体抗体库先结合，之后再亲和捕获靶分子-噬菌体 复合物。 优点：克服直接包被旳出现旳问题 缺陷：轻易筛到与亲和素（或者链酶亲和素）结合旳克隆。
23
谢谢
24
6. 感染后1小时内平均每个细胞 分泌1000个噬菌体
6
次要外壳蛋白 pIII
1. 406 aa 构成，5个拷贝，位于噬菌 体旳尾部。
2. 由三个功能区构成： • N1 穿膜区：作用于E.coli细胞膜上
第二步：磁珠生物素化抗原复合物与抗体库结合
17
第三步：洗涤—洗去非特异和弱结合旳噬菌体
18
第四步：洗脱—将特异性结合旳噬菌体洗脱下来
19
第五步：扩增—将洗脱旳噬菌体扩增 扩增产物进行下一轮筛选
背面旳筛选逐渐加大筛选压力
多克隆和单克隆噬菌体ELISA
ELISA阳性克隆测序，最终得 到特异性结合旳克隆序列
噬菌体展示系统 Phage on display 1
噬菌体展示系统 Phage on display
•噬菌体展示原理 –噬菌体展示定义、分类
–简介噬菌体及淘选过程
•噬菌体展示应用 •淘选过程中常见问题及处理方案
2
什么是噬菌体表面展示技术
Smith在1985年首次证明外源DNA能够插入丝状噬菌体基 因III中，并与pIII蛋白融合展示。
• 有供筛选旳抗生素标识基因。
• Helper phage：提供噬菌体质粒复制、合成ssDNA和 病毒包装所需要旳全部蛋白和酶。
13
筛选旳措施－亲和淘选
直接包被淘选法： 直接将靶分子包被在固相表面 优点：简朴直接。 缺陷：偶尔会造成配体结合位点难以进入 可能是因为分子旳立体封阻 或者是靶分子表面旳部分变性而引起 液相淘选法： 将靶蛋白与噬菌体抗体库先结合，之后再亲和捕获靶分子-噬菌体 复合物。 优点：克服直接包被旳出现旳问题 缺陷：轻易筛到与亲和素（或者链酶亲和素）结合旳克隆。
23
谢谢
24
6. 感染后1小时内平均每个细胞 分泌1000个噬菌体
6
次要外壳蛋白 pIII
1. 406 aa 构成，5个拷贝，位于噬菌 体旳尾部。
2. 由三个功能区构成： • N1 穿膜区：作用于E.coli细胞膜上
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噬菌体表面展示技术：是一种将外源多肽或蛋白质的 DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白的一个结构基因的适当位 置上,外源基因将随着外壳蛋白的表达而表达,从而使多肽 或蛋白以与外壳蛋白融合表达的形式展示在噬菌体表面。
3
噬菌体展示系统的分类
根据噬菌体不同： •温和噬菌体---M
6. 感染后1小时内平均每个细胞 分泌1000个噬菌体
6
次要外壳蛋白 pIII
1. 406 aa 组成，5个拷贝，位于噬菌 体的尾部。
2. 由三个功能区组成： • N1 穿膜区：作用于E.coli细胞膜上
的TolA蛋白；与噬菌体的入侵有关。 • N2 受体结合区：负责结合F菌毛。 • CT 疏水区：组装前黏附在细菌内
5
M13噬菌体的生命周期
1. PIII蛋白结合于E.Coli 的F纤 毛
2. 细菌的Tol蛋白复合体解聚噬 菌体的外壳蛋白，ssDNA转 运至胞浆
3. 病毒ssDNA进入细菌的胞浆 合成dsDNA
4. 以dsDNA为模版合成所有的 病毒蛋白，且通过滚环复制
合成组装病毒所需的ssDNA。
5. 第一代噬菌体在感染10分钟 后出现在培养液中
4
M13噬菌体的组成和结构
1. 丝状噬菌体：M13。 2. 单链DNA病毒,6407 bp。 3. 基因组编码11种蛋白质，其
中5种为结构蛋白质。 4. 与展示密切相关的有pIII、
pVIII两种结构蛋白质。 5. DNA在细菌内滚环复制，细
菌不被裂解，但生长速度减 慢，并且分泌大量噬菌体颗 粒。
复合物。 优点：克服直接包被的出现的问题 缺点：容易筛到与亲和素（或者链酶亲和素）结合的克隆。
14
噬菌体抗体库淘选示意图 直接包被法
• 噬菌体抗体库与靶分子相互 作用
• 洗涤去未结合的或非特异性 结合的噬菌体
• 将特异性结合的噬菌体洗脱 下来，并扩增，用扩增产物 进行下一轮筛选
• 三轮淘选后，克隆测序
15
噬菌体抗体库淘选示意图 液相法
第一步：生物素化抗体与磁珠结合 Bind to Streptavidin coated magnetic bead biotin -antigen
16
第二步：磁珠生物素化抗原复合物与抗体库结合
17
第三步：洗涤—洗去非特异和弱结合的噬菌体
18
第四步：洗脱—将特异性结合的噬菌体洗脱下来
•噬菌体展示应用 •淘选过程中常见问题及解决方案
21
噬菌体展示的应用
•抗原表位分析 •发现特异性抗体 •新疫苗、多价疫苗的开发
22
淘选过程中常见问题及解决方案
23
谢谢
24
pIII展示 单价展示 亲和力高
主要应用于抗体库
9
噬菌体展示技术流程
10
噬菌体抗体库的构建
建库：[例子]
11
12
噬菌体质粒-phagemid
• 噬菌体质粒特征： • 携带有欲在噬菌体上融合展示的外源蛋白基因和pIII基
因，没有其他噬菌体基因。 • 有包装序列信号。（packing signal）
19
第五步：扩增—将洗脱的噬菌体扩增步加大筛选压力
多克隆和单克隆噬菌体ELISA
ELISA阳性克隆测序，最终得 到特异性结合的克隆序列
感染 和扩增
E.coli
20
噬菌体展示系统 Phage on display
•噬菌体展示原理 –噬菌体展示定义、分类
–简介噬菌体及淘选过程
噬菌体展示系统 Phage on display 1
噬菌体展示系统 Phage on display
•噬菌体展示原理 –噬菌体展示定义、分类
–简介噬菌体及淘选过程
•噬菌体展示应用 •淘选过程中常见问题及解决方案
2
什么是噬菌体表面展示技术
Smith在1985年首次证实外源DNA可以插入丝状噬菌体基 因III中，并与pIII蛋白融合展示。
8
pIII展示和pVIII展示的区别
• pVIII 展示的多肽比较小，如果太大会影响噬菌体壳蛋白的组 装。
• pIII只要不影响感染，可以展示更大的多肽及蛋白。
• 丝状噬菌体展示系统一般是在外壳蛋白pIII或pVIII的N端融合 表达外源多肽及蛋白。
pVIII展示 多价展示
筛选到的分子亲和力相 对低 高拷贝数增加了抗原性 应用于肽库
• 有供筛选的抗生素标记基因。
• Helper phage：提供噬菌体质粒复制、合成ssDNA和 病毒包装所需要的所有蛋白和酶。
13
筛选的方法－亲和淘选
直接包被淘选法： 直接将靶分子包被在固相表面 优点：简单直接。 缺点：偶尔会导致配体结合位点难以进入 可能是由于分子的立体封阻 或者是靶分子表面的部分变性而引起 液相淘选法： 将靶蛋白与噬菌体抗体库先结合，之后再亲和捕获靶分子-噬菌体
膜上；与噬菌体组装终止有关。 • G1、G2:甘氨酸片段，在感染过程
中，增加各个功能域之间的灵活性
7
主要外壳蛋白 pVIII
• 每子个病毒含约2700个拷贝， 约10%能有效地融合外源多 肽。以pIII融合子方式表达的 是单价的，而以pVIII融合子 方式表达的则是多价的。
• 这种多价pVIII展示所增加的 亲和力有利于筛选到亲和力 非常低的配体，而单价pIII展 示则将筛选限制在具有较高 亲和力的配体上。
3
噬菌体展示系统的分类
根据噬菌体不同： •温和噬菌体---M
6. 感染后1小时内平均每个细胞 分泌1000个噬菌体
6
次要外壳蛋白 pIII
1. 406 aa 组成，5个拷贝，位于噬菌 体的尾部。
2. 由三个功能区组成： • N1 穿膜区：作用于E.coli细胞膜上
的TolA蛋白；与噬菌体的入侵有关。 • N2 受体结合区：负责结合F菌毛。 • CT 疏水区：组装前黏附在细菌内
5
M13噬菌体的生命周期
1. PIII蛋白结合于E.Coli 的F纤 毛
2. 细菌的Tol蛋白复合体解聚噬 菌体的外壳蛋白，ssDNA转 运至胞浆
3. 病毒ssDNA进入细菌的胞浆 合成dsDNA
4. 以dsDNA为模版合成所有的 病毒蛋白，且通过滚环复制
合成组装病毒所需的ssDNA。
5. 第一代噬菌体在感染10分钟 后出现在培养液中
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M13噬菌体的组成和结构
1. 丝状噬菌体：M13。 2. 单链DNA病毒,6407 bp。 3. 基因组编码11种蛋白质，其
中5种为结构蛋白质。 4. 与展示密切相关的有pIII、
pVIII两种结构蛋白质。 5. DNA在细菌内滚环复制，细
菌不被裂解，但生长速度减 慢，并且分泌大量噬菌体颗 粒。
复合物。 优点：克服直接包被的出现的问题 缺点：容易筛到与亲和素（或者链酶亲和素）结合的克隆。
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噬菌体抗体库淘选示意图 直接包被法
• 噬菌体抗体库与靶分子相互 作用
• 洗涤去未结合的或非特异性 结合的噬菌体
• 将特异性结合的噬菌体洗脱 下来，并扩增，用扩增产物 进行下一轮筛选
• 三轮淘选后，克隆测序
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噬菌体抗体库淘选示意图 液相法
第一步：生物素化抗体与磁珠结合 Bind to Streptavidin coated magnetic bead biotin -antigen
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第二步：磁珠生物素化抗原复合物与抗体库结合
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第三步：洗涤—洗去非特异和弱结合的噬菌体
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第四步：洗脱—将特异性结合的噬菌体洗脱下来
•噬菌体展示应用 •淘选过程中常见问题及解决方案
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噬菌体展示的应用
•抗原表位分析 •发现特异性抗体 •新疫苗、多价疫苗的开发
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淘选过程中常见问题及解决方案
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谢谢
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pIII展示 单价展示 亲和力高
主要应用于抗体库
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噬菌体展示技术流程
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噬菌体抗体库的构建
建库：[例子]
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噬菌体质粒-phagemid
• 噬菌体质粒特征： • 携带有欲在噬菌体上融合展示的外源蛋白基因和pIII基
因，没有其他噬菌体基因。 • 有包装序列信号。（packing signal）
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第五步：扩增—将洗脱的噬菌体扩增步加大筛选压力
多克隆和单克隆噬菌体ELISA
ELISA阳性克隆测序，最终得 到特异性结合的克隆序列
感染 和扩增
E.coli
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噬菌体展示系统 Phage on display
•噬菌体展示原理 –噬菌体展示定义、分类
–简介噬菌体及淘选过程
噬菌体展示系统 Phage on display 1
噬菌体展示系统 Phage on display
•噬菌体展示原理 –噬菌体展示定义、分类
–简介噬菌体及淘选过程
•噬菌体展示应用 •淘选过程中常见问题及解决方案
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什么是噬菌体表面展示技术
Smith在1985年首次证实外源DNA可以插入丝状噬菌体基 因III中，并与pIII蛋白融合展示。
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pIII展示和pVIII展示的区别
• pVIII 展示的多肽比较小，如果太大会影响噬菌体壳蛋白的组 装。
• pIII只要不影响感染，可以展示更大的多肽及蛋白。
• 丝状噬菌体展示系统一般是在外壳蛋白pIII或pVIII的N端融合 表达外源多肽及蛋白。
pVIII展示 多价展示
筛选到的分子亲和力相 对低 高拷贝数增加了抗原性 应用于肽库
• 有供筛选的抗生素标记基因。
• Helper phage：提供噬菌体质粒复制、合成ssDNA和 病毒包装所需要的所有蛋白和酶。
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筛选的方法－亲和淘选
直接包被淘选法： 直接将靶分子包被在固相表面 优点：简单直接。 缺点：偶尔会导致配体结合位点难以进入 可能是由于分子的立体封阻 或者是靶分子表面的部分变性而引起 液相淘选法： 将靶蛋白与噬菌体抗体库先结合，之后再亲和捕获靶分子-噬菌体
膜上；与噬菌体组装终止有关。 • G1、G2:甘氨酸片段，在感染过程
中，增加各个功能域之间的灵活性
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主要外壳蛋白 pVIII
• 每子个病毒含约2700个拷贝， 约10%能有效地融合外源多 肽。以pIII融合子方式表达的 是单价的，而以pVIII融合子 方式表达的则是多价的。
• 这种多价pVIII展示所增加的 亲和力有利于筛选到亲和力 非常低的配体，而单价pIII展 示则将筛选限制在具有较高 亲和力的配体上。